在線微固相萃取/高效液相色譜聯(lián)用分析環(huán)境水樣中磺胺類藥物

周嬋媛，羅 軍，王 壹，嚴(yán) 偉，聶勝強(qiáng)

(貴陽學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005)

磺胺類藥物(Sulfonamides,SAs)屬于化學(xué)合成類抗生素，被廣泛應(yīng)用于防治人類、水產(chǎn)和畜禽養(yǎng)殖過程中由細(xì)菌感染引發(fā)的疾病。SAs的大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染，尤其是水體的污染。而農(nóng)作物吸收了被污染的水源并被人類食用后可能對(duì)人體健康形成危害?；赟As污染造成的危害，亟需對(duì)污染水體進(jìn)行處理，而現(xiàn)有的污水處理工藝僅針對(duì)廢水中耗氧有機(jī)物和營(yíng)養(yǎng)元素氮磷，對(duì)SAs污染物幾乎無處理效果。因此，迫切需要建立有效、快捷、簡(jiǎn)便的樣品前處理富集分析技術(shù)。目前SAs的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[1-3]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、電化學(xué)檢測(cè)法[7-8]等。然而，SAs具有強(qiáng)極性且在環(huán)境樣品中含量較低，導(dǎo)致其分析檢測(cè)難度增大。快速有效的樣品前處理方法可對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行有效的分離富集，是提高SAs檢測(cè)靈敏度的重要途徑。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)SAs的前處理方法有液-液萃取法[9-10]、基質(zhì)固相萃取法[11-12]和固相萃取法[13],但主要以離線方式進(jìn)行，耗時(shí)長(zhǎng)，操作復(fù)雜，且溶劑消耗量大。將樣品前處理與分析儀器在線聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)前處理與分離分析的優(yōu)化組合，可以提高分析的自動(dòng)化程度，減少離線操作中的人為誤差和樣品損失，是當(dāng)前復(fù)雜樣品前處理分離分析的重要發(fā)展方向。

本文基于Sep的高比表面積、良好化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性等優(yōu)異性能，通過酸化法制備氧化海泡石(O-Sep)功能化材料，研究了O-Sep材料的結(jié)構(gòu)和萃取性能，并建立了分析環(huán)境水樣中磺胺對(duì)甲氧嘧啶(Sulfameter，SMD)、磺胺多辛(Sufladoxine，SDX)、磺胺苯吡唑(Sulfaphenazole，SPP)3種磺胺類藥物的O-Sep在線微固相萃取/高效液相色譜(O-Sep/μ-SPE/HPLC)聯(lián)用方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SK2200H超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯儀器有限公司)；ST16R離心機(jī)(美國(guó)Thermor公司)；LC-10Avp 型高效液相色譜儀(日本 Shimadzu 公司)，配備 CLASS-VP 工作站，SPD10AVP 紫外檢測(cè)器，Diamonsil C18色譜柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm，迪馬公司)；FA1604型電子天平(上海天平儀器廠)；Quanta600電子掃描顯微鏡(SEM，荷蘭 FEI 公司)；NICOLET AVATAR330傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)熱電公司)；Orion868型酸度計(jì)(美國(guó)ThermoElectron公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺苯吡唑(百靈威科技有限公司)；海泡石原礦(湘潭九華碳素高科有限公司)；丙酮、乙酸乙酯、正己烷(分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠)；乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由Millipore 純化系統(tǒng)制備。其他試劑均為分析純。

1.2 氧化海泡石的制備

以Sep原礦為原料，用酸化法制備O-Sep[22-24]：稱取5.0g過200目篩的Sep粉末置于盛有50mL50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液的燒杯中，攪拌10min，減壓抽濾，用水反復(fù)清洗。過濾后將收集的產(chǎn)物放入100mL4mol/L HCl溶液中，于80℃磁力攪拌8h。過濾，用超純水反復(fù)洗滌，直至上清液接近中性，然后將樣品分散在超純水和乙醇的混合溶液(1∶1，體積比)中，超聲(200W，24kHz)2h，使其充分分散，離心收集上清液，用超純水洗滌5次，于105℃干燥，所得固體產(chǎn)物即為O-Sep。

1.3 微填充柱的制備

10mg O-Sep粉末填充于聚醚醚銅(PEEK)制成的2.0mm內(nèi)徑微柱中，柱兩端用不銹鋼篩板固定填料，然后將其裝入相匹配的色譜保護(hù)柱的不銹鋼套內(nèi)。將填充柱連接于高壓液相泵上，用乙腈(含1%甲酸)以0.05mL/min 沖洗48h,再用超純水在0.1mL/min流速下沖洗4h，直至流出液接近中性。

1.4 固相萃取材料的表征

將O-Sep材料用導(dǎo)電膠固定，經(jīng)噴金處理后，采用冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡在100～10000的放大倍率下觀察材料形貌與結(jié)構(gòu)。采用X射線衍射儀研究O-Sep和Sep粉末的晶態(tài)結(jié)構(gòu)。測(cè)定條件如下：電壓40kV，電流30mA，掃描速度5°/min。將O-Sep材料與溴化鉀混合均勻研磨，利用紅外燈光照射干燥，在400～4000cm-1波數(shù)范圍內(nèi)測(cè)定紅外吸收光譜。

1.5 萃取條件的研究

以pH3.0～7.0的磷酸緩沖溶液(20mmol/L)分別配制100μg/L的SAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用O-Sep/μ-SPE/HPLC在線聯(lián)用裝置，對(duì)萃取溶劑、萃取流速、解吸溶劑和解吸體積進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 樣品溶液的制備

將SMD、SDX和SPP先用乙腈配成1.0g/L的儲(chǔ)備液，于4℃避光保存，再用pH6.0的磷酸緩沖溶液(20mmol/L)配成100μg/L的水溶液用于固相萃取條件的優(yōu)化。以實(shí)驗(yàn)室自來水、魚梁河水和貴陽市采集的4月份雨水為實(shí)際樣品，以磷酸緩沖溶液(20mmol/L)調(diào)至pH6.0，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后存于4℃冰箱中備用。水樣中加入對(duì)應(yīng)體積的1.0mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻，作為SMD、SDX和SPP的加標(biāo)樣品。后續(xù)處理步驟與不加標(biāo)樣品相同。

1.7 色譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)；流動(dòng)相：有機(jī)相為乙腈，水相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液。流速為1mL/min；梯度洗脫程序：0～20min，乙腈由10%線性升至40%，保持5min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的結(jié)構(gòu)與性能表征

通過掃描電子顯微鏡(SEM)研究了Sep和O-Sep的形貌(圖1)。O-Sep通過酸化處理去除了表面的大部分雜質(zhì)，呈現(xiàn)疏松多層結(jié)構(gòu)，具有良好的通透性，且表面形貌發(fā)生了明顯改變，與Sep相比表現(xiàn)出良好的分散性。O-Sep的比表面積增至169.38m2/g，為Sep的7.4倍。說明O-Sep良好的分散性提高了材料的比表面積，從而有利于增強(qiáng)萃取性能。

Sep和O-Sep的X射線衍射圖譜如圖2A所示，O-Sep在2θ=30.0°處對(duì)應(yīng)于CaCO3的特征衍射峰強(qiáng)度與Sep相比明顯降低，而在2θ=27.3°處的海泡石特征衍射峰更加明顯，表明氧化處理去除了Sep中的CaCO3等雜質(zhì)組分，提高了Sep的純度。

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1萃取溶劑采用 100 μg/L的SMD、SDX和SPP標(biāo)準(zhǔn)溶液考察了O-Sep固相萃取柱在不同pH值條件下的萃取效果。結(jié)果表明，當(dāng)溶液pH值為6.0時(shí)，O-Sep固相萃取柱對(duì)SAs的吸附效率最好。隨著pH值的增大，O-Sep固相萃取柱對(duì)SAs的吸附效率反而降低，這是由于溶液pH值影響了吸附劑的結(jié)構(gòu)和磺胺類藥物的形態(tài)，隨著pH值的變化，SAs的存在形式不同，質(zhì)子化程度不同。在pH 4.0～6.0條件下，目標(biāo)物質(zhì)子化呈電中性，O-Sep與目標(biāo)物間的氫鍵作用促使O-Sep對(duì)SAs的萃取效果較好。當(dāng)溶液pH值大于6.0時(shí)，SAs轉(zhuǎn)變?yōu)殛庪x子形式，離子交換作用減弱，使得O-Sep對(duì)SAs的吸附量減少。綜上，實(shí)驗(yàn)選擇pH 6.0的磷酸緩沖液(20 mmol/L)為最優(yōu)萃取溶劑。

2.2.2萃取流速保持過萃取柱的5.0 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為2.0 mL，考察了萃取流速(200、400、600、800 μL/min)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示流速的改變對(duì)萃取結(jié)果影響不大，但流速為600 μL/min時(shí)萃取效果最佳，因此選擇萃取流速為600 μL/min。

2.2.3解吸溶劑分別選擇乙腈、0.1%氨水溶液-乙腈(5∶95) 、甲醇、0.1%氨水溶液-甲醇(5∶95)作為解吸溶劑進(jìn)行優(yōu)化，考察了解吸溶劑種類的影響。結(jié)果顯示，在相同條件下，甲醇解吸體系對(duì)SAs的解吸效果明顯高于乙腈解吸體系，且以0.1%氨水溶液-甲醇(5∶95)的效果最好，故選作解吸溶劑。

2.2.4解吸體積考察了不同解吸體積(200、300、400、500、600 μL)對(duì)目標(biāo)物洗脫能力的影響。結(jié)果表明，隨著解吸體積的增大，SMD、SDX和SPP的解吸量均逐漸增加。當(dāng)解吸體積為500 μL時(shí)，3種目標(biāo)物均基本實(shí)現(xiàn)完全解吸；繼續(xù)增大解吸體積并不能提高解吸量，反而會(huì)影響各目標(biāo)物色譜峰的分離度和峰形。因此實(shí)驗(yàn)選擇解吸體積為 500 μL。

圖3 O-Sep與其它材料的萃取性能比較Fig.3 Comparison of extraction performances of O-Sep with other three materials

2.3 吸附容量的研究

分別保持吸附劑用量為10 mg，萃取體積為 3 mL，通過改變萃取溶液質(zhì)量濃度(由20 μg/L增至560 μg/L)考察了O-Sep微柱的萃取容量。結(jié)果表明，隨著萃取溶液質(zhì)量濃度的增加，O-Sep柱的萃取量增大，并在萃取溶液質(zhì)量濃度為480 μg/L時(shí)基本達(dá)到萃取平衡。此時(shí)，O-Sep萃取柱對(duì)SMD、SDX、SPP的飽和萃取容量分別為203.2、150.3、102.1 ng。

2.4 材料萃取性能的對(duì)比

對(duì)比了O-Sep與Sep、商用C18和多壁碳納米管(MWCNTs)對(duì)3種SAs的萃取性能(圖3)，O-Sep對(duì)SMD的萃取能力高于其他3種萃取材料，富集量約為MWCNTs的 8.5 倍，是C18的 10.2 倍;對(duì)SDX的富集量約為MWCNTs的 4.5倍，C18的 8.2倍;然而其對(duì)SPP的萃取能力相較于MWCNTs和Sep并無明顯提高。這可能是由于O-Sep經(jīng)酸化處理后,Si—O骨架生成Si—OH基，材料的親水性有所提高，從而增強(qiáng)了其對(duì)極性物質(zhì)的富集能力。

2.5 分析方法的建立與應(yīng)用

2.5.1分析方法的建立采用O-Sep萃取不同質(zhì)量濃度的SMD、SDX和SPP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0～50.0 μg/L)，按照“1.7”條件進(jìn)行HPLC分析，以質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。由表1可知，SMD、SDX和SPP在1.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.97；檢出限(信噪比S/N=3)為0.3～0.5 μg/L；采用10.0 μg/L磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液考察方法的精密度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=5) 為1.1%～3.2%，表明方法具有良好的靈敏度和精密度。

表1 3種目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Linear equations,correlation coefficients,linear ranges,detection limits and RSDs of 3 analytes

2.5.2實(shí)際樣品的分析將實(shí)驗(yàn)室自來水、魚梁河水和貴陽市4月份雨水按照“1.6”方法處理后，采用O-Sep/SPE/HPLC方法進(jìn)行測(cè)定，均未檢出SAs。對(duì)上述實(shí)際樣品進(jìn)行5.0、10.0、30.0 μg/L 3個(gè)質(zhì)量濃度的加標(biāo)回收試驗(yàn)，得到3種水樣的回收率分別為79.5%～98.3%、74.3%～98.6%和70.2%～98.7%，RSD為1.4%～7.6%(表2)。實(shí)際樣品加標(biāo)前后及加標(biāo)樣品在線富集后的色譜圖如圖4所示，當(dāng)樣品中不加SAs時(shí)均未檢出SAs；加標(biāo)10.0 μg/L后，可檢測(cè)到SAs的色譜峰，但出峰信號(hào)較??；而用O-Sep固相萃取柱富集分離后，SAs的色譜峰信號(hào)明顯升高。結(jié)果表明O-Sep固相萃取柱對(duì)環(huán)境水樣中SAs有較好的萃取能力。

表 2 環(huán)境水樣中3種磺胺類藥物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Recoveries and RSDs of three sulfonamides in spiked environmental water samples(n=5)

圖4 自來水(A)、河水(B)和雨水(C)樣品的色譜圖
Fig.4 Chromatograms of tap water(A),river water(B) and rain water(C) samples
a：real sample；b：sample spiking with 10.0 μg/L of each compound;c：online enrichment of spiked samples;1.SMD，2.SDX，3.SPP

3 結(jié) 論

本文通過酸化法制備了 O-Sep材料，將其填充于自制 PEEK 微柱中,構(gòu)建了在線萃取裝置，優(yōu)化了萃取解吸條件，研究了O-Sep微柱萃取性能。結(jié)果表明填充10 mg O-Sep的微柱對(duì)SMD、SDX和SPP的萃取容量分別為203.2、150.3、102.1 ng。所建立的O-Sep/SPE/HPLC在線分析方法實(shí)用、簡(jiǎn)便，在環(huán)境水樣中磺胺類藥物的分析中有較大的應(yīng)用潛力。