質(zhì)譜電噴霧離子源中電化學(xué)與電暈放電氧化還原反應(yīng)的研究進展

裴繼影，侯壯豪

(1.廣西大學(xué) 海洋學(xué)院，廣西 南寧 530000；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230026)

質(zhì)譜技術(shù)作為當(dāng)今最有發(fā)展前景的分析技術(shù)之一，在生命科學(xué)、材料分析、公安刑偵、食品安全、環(huán)境監(jiān)測以及航天和軍事技術(shù)等諸多領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。電噴霧離子源(Electrospray ionization，ESI)可在大氣壓下對分析物實現(xiàn)“軟電離”，產(chǎn)生單/多電荷離子，保留待測物的分子結(jié)構(gòu)信息，具有分析靈敏度高、檢測速度快，以及與毛細(xì)管電泳及高效液相色譜兼容性好等優(yōu)點，是質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用最廣泛的離子源之一。然而，由于ESI中金屬電極的存在和高壓的使用，質(zhì)譜分析過程中會發(fā)生電化學(xué)氧化還原[1-8]和電暈放電氧化還原[9-12]兩類反應(yīng)。Van Berkel等[2]認(rèn)為ESI源類似于恒電流電解池，在正離子模式下，噴針相當(dāng)于正極，質(zhì)譜相當(dāng)于負(fù)極。噴霧過程中噴針尖端釋放正離子，為維持溶液電中性，電極/溶液界面發(fā)生電化學(xué)氧化反應(yīng)，例如，水溶液中:2H2O-4e-=4H++O2；氯化鈉溶液中:2Cl--2e-= Cl2。而在負(fù)離子模式下，電極/溶液界面發(fā)生電化學(xué)還原反應(yīng)。與此同時，ESI施加高壓的過程中，ESI噴針尖端發(fā)生局部自持放電現(xiàn)象，即電暈放電，產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)(·OH、·NO、O3、H2O2等)[13]，這些活性氧物質(zhì)與分析物作用，發(fā)生氧化還原反應(yīng)[14]。這兩類化學(xué)反應(yīng)對質(zhì)譜的分析檢測會產(chǎn)生兩方面影響:干擾譜圖解析、降低分析物檢測靈敏度；氧化還原反應(yīng)可應(yīng)用于非極性或弱極性化合物的離子化、蛋白質(zhì)之間的相互作用研究等。本綜述分別介紹了ESI中電化學(xué)氧化還原反應(yīng)和電暈放電氧化還原反應(yīng)的研究進展，并介紹了區(qū)分兩種反應(yīng)的方法。

1 ESI中電化學(xué)氧化還原反應(yīng)的研究進展

1.1 ESI中的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)現(xiàn)象

ESI中氣態(tài)離子的形成過程包括兩個步驟:帶電小液滴的形成和氣相離子的生成。有多種理論嘗試解析帶電小液滴的形成機制[15]，如2000年Van Berkel、de la Mora、Enke等針對該問題展開了辯論[3]:其中Van Berkel和Enke等支持“電解池假說”，認(rèn)為ESI在施加高壓的過程中，離子源和質(zhì)譜儀之間構(gòu)成電解池，化合物離子化歸咎于ESI電解池中發(fā)生的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)；而de la Mora和Martinez-Sanchez等認(rèn)為在某些情況下(例如離子液體)，ESI過程中不存在電解現(xiàn)象；Fenn認(rèn)為ESI中的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)對帶電小液滴的形成起重要作用，但通常對化合物的質(zhì)譜分析結(jié)果影響較小，只有特殊情況下才對分析結(jié)果產(chǎn)生重要影響。隨著科學(xué)家對ESI源機理的深入研究，越來越多的實例表明化合物的離子化與電化學(xué)氧化還原反應(yīng)有關(guān)。例如，Blades等[1]以鋅或鐵材料作為噴針電極，在質(zhì)譜圖中觀察到Zn2+和Fe2+的信號峰并設(shè)計了如下實驗證明Zn2+和Fe2+的生成與ESI中電化學(xué)氧化反應(yīng)的關(guān)系:將鋅毛細(xì)管置于ESI源的上游，隔離鋅毛細(xì)管與噴霧電壓的接觸，但樣品溶液仍流經(jīng)該鋅毛細(xì)管，結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜圖中Zn2+信號峰消失，表明Zn2+的生成與鋅毛細(xì)管/高壓接觸有關(guān)。Van Berkel等[16]使用ESI-MS對金屬卟啉、多環(huán)芳烴等弱極性化合物或非極性化合物進行分析，譜圖中觀察到化合物的M·+信號峰。ESI源一般適用于極性化合物的分析，即在溶液中已通過獲得質(zhì)子以[M+H]+形式存在的物質(zhì)，而不適用于非極性化合物的分析，因此作者推測ESI中非極性化合物的離子化與電化學(xué)氧化反應(yīng)有關(guān)，并設(shè)計了如圖1所示的實驗來驗證該假設(shè):樣品連續(xù)流經(jīng)一個內(nèi)表面積為0.2μm2的金屬兩通和一根內(nèi)表面積為2μm2的不銹鋼噴針(圖1A);樣品連續(xù)流經(jīng)一個內(nèi)表面積為0.2μm2的金屬兩通和一根熔融石英毛細(xì)管(圖1B);樣品連續(xù)流經(jīng)一個內(nèi)表面積為0.2μm2的金屬兩通、一根內(nèi)表面積為2μm2的不銹鋼噴針和一根熔融石英毛細(xì)管(圖1C)。然后在高壓作用下產(chǎn)生噴霧，產(chǎn)生的離子被質(zhì)譜檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圖A中金屬卟啉以M·+形式離子化且信號較強；圖B中M·+離子信號較弱；圖C中經(jīng)過一段時間(對應(yīng)樣品流經(jīng)石英毛細(xì)管的時間)之后質(zhì)譜圖上才觀察到金屬卟啉的M·+離子。表明金屬卟啉M·+離子的生成和溶液/高壓接觸有關(guān)，即電化學(xué)氧化反應(yīng)參與了其離子化過程，且溶液/高壓接觸的時間越長，電化學(xué)氧化反應(yīng)作用的時間越長，M·+離子的生成量越多，信號越強。Liu等[17]采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)對類固醇硫酸酯進行分析，質(zhì)譜圖上可觀察到[類固醇硫酸酯-H]-及[類固醇硫酸酯+nO-H]-(n=1,2,3,4)的信號峰，這是由于溶劑發(fā)生電化學(xué)氧化，生成·OH，造成了類固醇硫酸酯的氧化。

目前，ESI中的電化學(xué)研究主要集中在氧化反應(yīng)，還原反應(yīng)報道較少。Van Berkel等[18]指出ESI-MS分析Ag+、Cu2+、Hg2+等金屬離子時，負(fù)離子模式下這些金屬離子在電極表面發(fā)生還原反應(yīng)，其價態(tài)由高向低發(fā)生轉(zhuǎn)移。當(dāng)反向施加正高壓時，沉積在電極表面的金屬元素又在溶液/電極界面發(fā)生氧化反應(yīng)，重新以離子形態(tài)回到溶液。因此，氧化還原反應(yīng)的發(fā)生可通過改變金屬離子的價態(tài)而影響其定性、定量分析。根據(jù)電化學(xué)理論，ESI正離子模式下，電極/溶液界面發(fā)生氧化反應(yīng)；負(fù)離子模式下發(fā)生還原反應(yīng)。但研究人員在ESI正離子模式下亦觀察到分析物的還原反應(yīng)，例如，Gu等[19]在ESI正離子模式下對丙酸氟替卡松進行分析，觀察到[丙酸氟替卡松+46]+的信號峰，作者將該現(xiàn)象解釋為:溶劑水在ESI中發(fā)生電解生成還原氫，乙腈被還原氫還原為乙胺，進一步與丙酸氟替卡松形成[丙酸氟替卡松+46]的加合物。Ramos等[20]采用ESI-MS對三(1-甲基吡啶嗡-4-基)卟啉碘鹽(MI3)進行分析，觀察到M+和[M+2H]+離子，推測這是由于水或甲醇發(fā)生還原反應(yīng)，生成還原氫，還原氫與M3+反應(yīng)所致。

1.2 ESI中電化學(xué)氧化還原反應(yīng)的利弊

ESI中的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)既有弊又有利。一方面，ESI-MS中電化學(xué)氧化還原反應(yīng)干擾譜圖解析，降低分析物檢測靈敏度，影響電噴霧穩(wěn)定性，主要表現(xiàn)在:①改變?nèi)芤簆H值，使蛋白質(zhì)譜圖復(fù)雜化[21-23]。溶劑電解生成H+，溶液pH值降低，蛋白質(zhì)的電荷態(tài)從低向高發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而不利于混合蛋白質(zhì)樣品的分析。②降低分析物的檢測靈敏度。電化學(xué)反應(yīng)使分析物轉(zhuǎn)化為不同形式的氧化或還原產(chǎn)物，從而降低分析物在質(zhì)譜中的響應(yīng)信號。例如，利血平在ESI中發(fā)生氧化反應(yīng)，生成[M+O]、[M+2O]、[M-2H]、[M-4H]等一系列氧化產(chǎn)物[24]；苯并呋喃被氧化成[M-2H][25]；多肽被氧化成一系列加氧產(chǎn)物[26]。③電解形成的氣泡影響噴霧的穩(wěn)定性。Moini等[27]用毛細(xì)管電泳-電噴霧離子化質(zhì)譜對蛋白質(zhì)消解液進行分析時，水電解生成的O2干擾噴霧的穩(wěn)定性，加入對苯二酚后，水電解被抑制，噴霧穩(wěn)定。ESI-MS中電化學(xué)氧化還原反應(yīng)的有利一面表現(xiàn)在:①ESI中的電化學(xué)氧化可用于提高非極性或弱極性化合物的離子化效率，如金屬卟啉[16,28-29]、多環(huán)芳烴[16]、芳香胺[16]、雜芳族化合物[16]、二茂鐵[30-31]等。②通過在噴針上游構(gòu)建外接回路可用于提高分析物的信號強度[31]。③原位電解可實現(xiàn)化合物的在線標(biāo)記[32-37]。Rohner等[32]利用ESI電解作用氧化對苯二酚，對含有半胱氨酸的多肽和蛋白質(zhì)進行在線標(biāo)記；Prudent等[35]利用ESI電解氧化鋅電極，對磷酸肽進行在線標(biāo)記；④可用于研究電化學(xué)反應(yīng)機制。Mautjana等[38]利用ESI的電解性質(zhì)研究多巴胺的電化學(xué)氧化機制。

圖1 不同ESI源構(gòu)造[16]Fig.1 ESI source with different setups[16]A.a metal connector+a stainless steel needle；B.a metal connector+a fused silica capillary；C.two metal connectors+a stainless steel needle+a fused silica capillary

1.3 控制ESI中電化學(xué)氧化還原反應(yīng)的方法

控制ESI中電化學(xué)氧化還原反應(yīng)的方法如下:

(2)改變電極/溶液的接觸面積。電極/溶液的接觸面積越小，電化學(xué)反應(yīng)越弱。使用石英噴針代替金屬噴針可減弱電化學(xué)氧化還原反應(yīng)[39]；使用多孔石墨作為噴霧電極可增大電化學(xué)氧化還原反應(yīng)[40]；利用平板金屬電極代替常規(guī)圓管金屬電極，通過改變平板電極的表面積和材質(zhì)可靈活控制分析物的氧化還原程度[41]。

(3)改變?nèi)芤?電極的接觸時間。溶液/電極接觸時間越短，氧化還原程度越弱[42]，提高噴霧流速是降低溶液/電極接觸時間的一種方法。

(4)改變電壓施加方式。Kertesz等[24]使用脈沖高壓代替直流高壓以減少溶液/電壓的接觸時間，從而降低電化學(xué)反應(yīng)；Pei等[22]使用感應(yīng)電壓交替產(chǎn)生正負(fù)離子來避免某一極性離子在溶液中的累積，從而減小ESI中電化學(xué)氧化還原反應(yīng)的發(fā)生。

(5)調(diào)整溶液/電極界面電勢。化合物在ESI中是否發(fā)生電化學(xué)氧化還原反應(yīng)及該反應(yīng)發(fā)生的程度取決于電極電勢，通過構(gòu)建三電極體系可有效控制分析物在ESI中的氧化還原程度[43-44]。

(6)使用氧化還原緩沖試劑?；衔锇l(fā)生氧化還原反應(yīng)的難易程度取決于其電極電勢，電極電勢越低(高)，氧化(還原)反應(yīng)越易發(fā)生。在溶液中加入電極電勢較低(高)的物質(zhì)可減弱分析物的氧化(還原)，常用的氧化還原緩沖試劑包括對苯二酚[27]、抗壞血酸[45]、金屬電極[46]、聚合物材料[47-48]等，例如，Van Berkel等使用聚吡咯[47]和聚(3,4-乙烯二氧吡咯)[48]修飾電噴霧噴針，用于降低分析物氧化反應(yīng)的發(fā)生。

2 ESI中電暈放電氧化還原反應(yīng)的研究進展

2.1 ESI中的電暈放電氧化還原反應(yīng)現(xiàn)象及應(yīng)用

ESI過程中的電暈放電通常發(fā)生在較高的噴霧電壓下，而Kanev等[14]證明即使在較低的噴霧電壓或噴霧電流下，電暈放電依然能發(fā)生。在200nA的噴霧電流條件下，電噴霧電暈放電產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)足夠使20mg/L的尿素酶失活。ESI中的電暈放電干擾譜圖解析，降低分析物的檢測靈敏度。在ESI電暈放電過程中多肽或蛋白質(zhì)易發(fā)生氧化反應(yīng)，生成一系列加氧物質(zhì)，且含有甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸的多肽更易發(fā)生氧化反應(yīng)[49]。Chen等[10]用ESI-MS對αβ肽進行分析時，在質(zhì)譜圖上觀察到一系列αβ肽的氧化產(chǎn)物，且隨著不銹鋼金屬噴針使用時間的延長，氧化更嚴(yán)重。該現(xiàn)象是由于金屬噴針在高壓作用下發(fā)生電暈放電，使噴針腐蝕，噴針的尖端生成很多小的毛刺，進一步加劇放電，從而使蛋白質(zhì)/多肽的氧化更加劇烈。ESI中的電暈放電氧化還原反應(yīng)也可應(yīng)用于質(zhì)譜分析方法開發(fā)及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。例如，Lloyd等[50-51]開發(fā)了一種基于電暈放電的新型離子源——電暈放電-電化學(xué)離子源(Corona discharge initiated electrochemical ionization，CD-ECI)，利用該離子源可實現(xiàn)多肽的源內(nèi)裂解[51]，其原理為:電暈放電使不銹鋼噴針發(fā)生氧化反應(yīng)，生成Fe·+，F(xiàn)e·+進一步與多肽發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，導(dǎo)致多肽內(nèi)部的化學(xué)鍵斷裂。Downard課題組利用電暈放電在蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面開展了大量工作[52-60]，其原理為:電暈放電優(yōu)先氧化暴露在蛋白質(zhì)表面的氨基酸，經(jīng)質(zhì)譜二級譜圖分析可判斷蛋白質(zhì)的氧化位點，根據(jù)氧化位點進而推斷蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[52,61]或蛋白質(zhì)與其它物質(zhì)的作用位點(如鈣調(diào)蛋白和蜂毒素的相互作用[53]、乙酰肌肽-體蛋白的相互作用[54]、核糖核酸酶S蛋白和S肽的相互作用[55])。Maleknia等[57]利用ESI中的電暈放電氧化蛋白質(zhì)，然后用涂覆蛋白酶的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI)點樣板收集氧化蛋白，再利用MALDI質(zhì)譜對酶解后的肽段進行分析，實現(xiàn)了氧化蛋白質(zhì)的快速Bottom-up分析。此外，電暈放電也使得ESI在某些情況下呈現(xiàn)優(yōu)異的抗基質(zhì)干擾能力[62-64]；電暈放電能夠通過降低蛋白質(zhì)的電荷態(tài)分布簡化其譜圖解析[65]。

2.2 控制ESI中電暈放電氧化還原反應(yīng)的方法

控制ESI中電暈放電氧化還原反應(yīng)的方法有以下4種:

(1)控制噴霧電壓。噴霧電壓與放電程度成正比，電壓越高，則放電越劇烈[14,66]。

(2)改變鞘氣的組成。氣體的電介質(zhì)強度越大，抑制放電的能力越強。Ar、O2、N2、SF6的介電常數(shù)分別為0.18、0.92、1.0和2.6，因此常采用SF6作為ESI中抑制電暈放電的鞘氣[9,67]。

(3)改變?nèi)軇┑慕M成。水相中加入甲醇、乙腈、四氯甲烷、三氯甲烷、二氯甲烷等有機試劑可減弱電暈放電[68]。

(4)改變?nèi)芤旱碾娊赓|(zhì)強度。電解質(zhì)強度越大，噴霧電流越大，電暈放電越劇烈，因此降低鹽濃度可減弱電暈放電的發(fā)生[66]。

3 區(qū)分ESI中電化學(xué)氧化還原反應(yīng)與電暈放電氧化還原反應(yīng)的方法

電化學(xué)氧化還原反應(yīng)和電暈放電氧化還原反應(yīng)在ESI過程中同時發(fā)生，一般以藍(lán)光的出現(xiàn)或電流信號的急劇增大作為判斷電暈放電發(fā)生的標(biāo)志，其余情況視為電化學(xué)反應(yīng)。Morand等[49]利用ESI對一系列多肽物質(zhì)進行分析，提高噴霧電壓時，噴針尖端出現(xiàn)藍(lán)色光暈，質(zhì)譜圖上出現(xiàn)一系列多肽加氧物質(zhì)，作者將該氧化歸咎于電暈放電引起。Boys等[9]首次對ESI中電化學(xué)和電暈放電導(dǎo)致的蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)進行區(qū)分，通過改變鞘氣組成觀察血紅蛋白的氧化程度，結(jié)果表明蛋白質(zhì)的氧化程度與放電程度成正比。作者進一步利用常規(guī)電解池模擬蛋白質(zhì)在ESI中的電化學(xué)氧化反應(yīng)行為，發(fā)現(xiàn)在常規(guī)實驗條件下，ESI中的電化學(xué)反應(yīng)造成的蛋白質(zhì)氧化可以忽略不計，而該氧化主要由電暈放電造成。Pei等[69]提出一種時間分辨方法用于區(qū)分ESI中的電化學(xué)和電暈放電氧化反應(yīng)，其原理是:電化學(xué)氧化反應(yīng)發(fā)生在溶液/電極接觸面上，氧化程度與溶液/電極接觸時間成正比；而電暈放電氧化反應(yīng)發(fā)生在氣相中，反應(yīng)瞬間完成，與電噴霧時間無關(guān)。因此，作者提出通過調(diào)整實驗參數(shù)(例如流速、電壓、溶劑等)來觀察化合物的氧化程度變化，可作為區(qū)分兩類氧化的一種方法。該方法同樣適用于ESI中電化學(xué)還原反應(yīng)及電暈放電還原反應(yīng)的區(qū)分。利用該方法，作者考察了醌類化合物在ESI正、負(fù)離子模式下的還原行為，通過調(diào)整流速、電壓、溶劑、鞘氣組成、噴針-質(zhì)譜入口距離等參數(shù)，證明了醌在ESI中的異常還原行為由電暈放電造成[11-12]。

4 總結(jié)與展望

ESI中的電化學(xué)和電暈放電氧化還原反應(yīng)分別發(fā)生在液相與氣相中。二者的發(fā)生會干擾質(zhì)譜圖解析、降低分析物的檢測靈敏度，但二者又可應(yīng)用于離子源開發(fā)、提高難離子化化合物的電離效率、蛋白質(zhì)標(biāo)記、蛋白質(zhì)相互作用研究等。對于電化學(xué)氧化還原反應(yīng)，控制反應(yīng)程度的方法包括調(diào)整實驗參數(shù)(如電解質(zhì)濃度、電壓、流速等)、改變電極/溶液接觸面積或接觸時間、改變電壓施加方式、使用氧化還原緩沖試劑等；對于電暈放電氧化還原反應(yīng)，調(diào)整實驗參數(shù)(如噴霧電壓、鞘氣組成、溶劑組成、電解質(zhì)強度等)可控制其反應(yīng)發(fā)生程度。

將來可在以下方面開展ESI中氧化還原反應(yīng)的相關(guān)工作:開發(fā)新型離子源，用于避免電化學(xué)及電暈放電氧化還原反應(yīng)的發(fā)生，如熱爆破離子源[70-71]；將電化學(xué)及電暈放電氧化還原反應(yīng)用于Top-down蛋白質(zhì)組學(xué)研究；開發(fā)簡單、快速區(qū)分兩類氧化還原反應(yīng)的分析方法。