硅烷化GC-MS指紋圖譜在卷煙品牌分析中的應(yīng)用

賴燕華，盧浥良，李煥威，王 予，林寶敏，林 云，劉 熙

(廣東中煙工業(yè)有限責任公司 技術(shù)中心，廣東 廣州 510385)

卷煙產(chǎn)品是煙絲與卷煙輔材的集成產(chǎn)品，由于卷煙葉組配方、香精香料和加工工藝的不同導(dǎo)致卷煙煙絲具有更大的復(fù)雜性和多變性，所以對不同品牌卷煙的煙絲進行鑒別具有較大難度。隨著市場對卷煙產(chǎn)品需求的不斷提升，優(yōu)質(zhì)煙葉種植量和市場需求量的矛盾日益突出，在不斷加大原料葉組中薄片和梗絲調(diào)配比例的情況下，卷煙特有的香味風(fēng)格特征也被削弱。在此情況下，利用現(xiàn)代分析技術(shù)對卷煙產(chǎn)品進行深入分析，探究不同品牌卷煙煙絲的關(guān)鍵性化學(xué)成分含量分布對于品牌卷煙的維護具有重要意義。

硅烷化氣相色譜法的原理是通過硅烷化衍生反應(yīng)使三甲基硅烷基取代衍生對象的羥基、羧基、巰基、氨基及亞氨基的活潑氫，提高衍生對象的揮發(fā)性，將非揮發(fā)性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性衍生物，可克服氣相色譜對極性強、揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)不能直接進樣分析的缺點[1]，從而擴大氣相色譜的測定范圍。煙草中含有羥基、羧基、巰基、氨基及亞氨基的化合物有醇類、有機酸、糖類、氨基酸等物質(zhì)，其對煙草和卷煙的質(zhì)量有重要影響。其中煙草中的有機酸占煙葉干物質(zhì)總量的12%～16%[2],許多有機酸及其衍生物是煙草香味的重要成分，直接影響煙葉及其制品的質(zhì)量。葡萄糖、果糖等糖類物質(zhì)是煙草及煙草料液中的重要成分，在煙草制品中起黏合、加料、加香、產(chǎn)酸以及保潤等作用[3]。丙二醇、丙三醇等多元醇類化合物能夠保持煙草水分，可避免卷煙在保存過程中水分揮發(fā)造成的口感下降，減少加工過程中的糙碎，作為常用的保潤劑在煙草中得到廣泛應(yīng)用[4-5]。氨基酸也是煙草中的一類重要化合物，對煙葉的香味品質(zhì)有重要貢獻。在煙草調(diào)制、醇化或發(fā)酵加工直至燃燒過程中，游離氨基酸與還原糖(或羰基化合物)之間發(fā)生酶催化及非酶催化的棕色化反應(yīng)，生成多種具有烤香或爆米花香味特征的雜環(huán)類化合物[6]。因此，利用煙絲硅烷化成分對不同品牌卷煙煙絲進行鑒別具有可行性。

對于煙草中有機酸、糖類物質(zhì)、氨基酸及丙二醇、丙三醇等保潤劑成分的分析有多種檢測方法[7-12]，上述成分在不同卷煙中的含量差異及對感官質(zhì)量影響方面的研究也有一定進展。賴燕華等[13]采用逐步回歸分析法建立了卷煙感官風(fēng)格品質(zhì)與有機酸之間的關(guān)系模型，發(fā)現(xiàn)異戊酸、丙二酸、苯乙酸和檸檬酸等有機酸對卷煙香韻表現(xiàn)或感官品質(zhì)存在不同影響。甘學(xué)文等[14]以果糖和苯丙氨酸為原料制備中間體，研究了其在卷煙燃燒過程中卷煙香氣成分及含量的變化情況，證實了果糖-苯丙氨酸中間體具有增強卷煙香氣的作用。殷延齊等[15]對15種品牌卷煙煙絲中的游離態(tài)氨基酸含量進行了主成分分析和聚類分析，發(fā)現(xiàn)各種氨基酸的含量分布特征能反映不同品牌卷煙的特性。朱保昆等[16]的研究表明甘油、丙二醇等保潤劑對卷煙產(chǎn)品的感官舒適度有顯著影響。但利用煙絲硅烷化成分鑒別成品卷煙煙絲的報道較少。

本文采用硅烷化氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)指紋圖譜方法同時測定卷煙煙絲中的多種有機酸、糖類物質(zhì)、氨基酸及丙二醇、丙三醇等成分，并根據(jù)化學(xué)模式識別原理，采用聚類分析和主成分分析法對各種卷煙進行了分類和比較，探索了利用煙絲硅烷化成分對卷煙品牌進行表征和區(qū)別的可能性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent6890/5973GC-MS聯(lián)用儀、DB-5MS色譜柱(60m×0.25mm×0.25μm)、Agilent7683自動進樣器(美國Agilent公司)。

N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，美國Regis Technologies 公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF，德國CNW Technologies GmbH)；乙酸苯乙酯-D3(內(nèi)標，純度98%，加拿大CDN isotopes公司)；2-硫代巴比妥酸(純度≥98.0%)，正十七烷(內(nèi)標)、磷酸、焦谷氨酸、甘油酸(純度均≥99.0%)，1,2-丙二醇、甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖、蘋果酸、檸檬酸、脯氨酸(純度均≥99.5%)，購于美國Sigma-Aldrich公司；甘油酸鈣鹽、L-蘇阿糖酸半鈣鹽(純度99%，Aldrich公司)。

選取不同廠家3個牌號的市售烤煙型商品卷煙，共21個樣品，其中品牌A卷煙9個(樣品編號1～9)，品牌B卷煙6個(樣品編號10～15)，品牌C卷煙6個(樣品編號16～21)。

1.2 溶液的配制

內(nèi)標溶液IS1:稱取500mg 乙酸苯乙酯-D3，置于50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度。

內(nèi)標溶液IS2:稱取1500mg 十七烷，置于50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度。

提取溶液:準確移取2.0mL IS1內(nèi)標溶液和2.0mL IS2內(nèi)標溶液至100mL容量瓶中，用DMF和BSTFA溶液(體積比2∶8)稀釋至刻度，得提取衍生溶液。

標準儲備液:準確稱量約80mg1,2-丙二醇、96mg脯氨酸、30mg甘油、450mg蘋果酸、80mg 檸檬酸、90mg肌醇、1800mg 果糖、1800mg葡萄糖和250mg蔗糖，置于100mL棕色容量瓶中，加入超純水溶解并稀釋至刻度，得混合標準儲備液。

1.3 標準工作溶液的制備

取10、25、50、100、200、500μL標準儲備液，分別置于2mL色譜瓶中，用氮吹儀于室溫下吹干，再加1mL提取衍生溶液，于70℃烘箱中衍生化反應(yīng)30min，得到GC-MS分析標準工作溶液。

1.4 GC-MS條件

進樣口溫度:250℃；進樣量:1μL；分流進樣，分流比:30∶1；載氣:氦氣，恒流模式，流量1mL/min；程序升溫:初始溫度50℃，保持2min，以5℃/min升至110℃，保持2min，再以2℃/min升至190℃，保持15min，最后以20℃/min升至280℃，運行15min。電離方式:EI；離子源溫度:230℃；傳輸線溫度:280℃；掃描方式:全掃描(SCAN)和選擇離子監(jiān)測(SIM)，SCAN范圍為35～1000。

1.5 樣品處理

按照行業(yè)標準方法YC/T31[16]將卷煙樣品制備成煙末，準確稱取10mg煙末，置于2mL色譜瓶中，加入1mL提取衍生溶液，于70℃烘箱中進行提取和衍生化反應(yīng)30min，冷卻至室溫后，取上層清液，用0.45μm有機濾膜過濾，轉(zhuǎn)移至2mL干凈色譜瓶中，得到GC-MS分析樣品溶液。以各化合物的量與相應(yīng)內(nèi)標物量的比值為橫坐標，目標物定量離子色譜峰的面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線進行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙絲的硅烷化GC-MS指紋圖譜

按照“1.1～1.5”實驗方法，得到了21個卷煙樣品的硅烷化GC-MS指紋圖譜，并通過標準譜庫檢索及標準品保留時間比對，共定性14種硅烷化化學(xué)成分(表1)，主要包括氨基酸、有機酸/無機酸、糖和多元醇。實驗考察了DMF與衍生化試劑的比例、衍生化反應(yīng)溫度及時間的影響，確定DMF與BSTFA的比例為2∶8,衍生化反應(yīng)溫度和時間分別為70℃和30min，此時14種目標化合物的衍生化效果好且趨于穩(wěn)定。3個不同品牌卷煙煙絲硅烷化衍生物的GC-MS指紋圖譜見圖1。

表1 卷煙煙絲的硅烷化化學(xué)成分信息Table 1 Information of the silanized chemical components in cigarette samples

*quantitative ion

由圖1可知，脯氨酸、蘇阿糖酸、葡萄糖的硅烷化衍生物均出現(xiàn)2個峰，而果糖的硅烷化衍生物出現(xiàn)3個峰。改變衍生化試劑的比例、衍生化溫度及時間，脯氨酸、蘇阿糖酸、葡萄糖和果糖的硅烷化衍生物仍出現(xiàn)2個或3個峰，說明并非衍生化不完全所致，而是由于這些物質(zhì)存在多個異構(gòu)體，與BSTFA發(fā)生衍生化反應(yīng)后，不同異構(gòu)體的衍生化產(chǎn)物在該色譜條件下實現(xiàn)了分離[7]。另外，每個樣品的氣相色譜-質(zhì)譜分析時間達90 min，分析時間較長，且果糖、葡萄糖、蔗糖等出峰較晚的化合物含量較高，1,2-丙二醇、甘油、脯氨酸、磷酸等出峰較早的化合物含量相對較低。因此，綜合考慮保留時間和含量等因素，確定以乙酸苯乙酯-D3和正十七烷為雙內(nèi)標進行定量分析。由圖1可知，乙酸苯乙酯-D3和正十七烷與14種煙絲硅烷化成分實現(xiàn)了良好的色譜分離。由于內(nèi)標物乙酸苯乙酯-D3的出峰位置和強度與1，2-丙二醇、脯氨酸、磷酸、甘油、甘油酸、蘋果酸、焦谷氨酸和蘇阿糖酸比較接近，因此可用于這些化合物含量計算；而正十七烷則用作果糖、檸檬酸、2-硫代巴比妥酸、葡萄糖、肌糖和蔗糖的內(nèi)標物。14種目標化合物在3個品牌中均有檢出，其中果糖(峰13、14和15)和葡萄糖(峰18和19)在3個品牌中的含量差異較大，品牌A的糖類含量明顯較低，僅通過指紋圖譜的直觀比較，很難判斷不同品牌煙絲的歸屬，因此需對指紋圖譜數(shù)據(jù)做進一步分析。

圖1 品牌A(A)、B(B)和 C( C)卷煙的煙絲硅烷化衍生物GC-MS指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprint of silanizing derivatives in cut tobacco of cigarette brands A(A),B(B) and C(C)1.1,2-propylene glycol(1，2-丙二醇)；2，6.proline(脯氨酸)；3.phenethyl acetate-D3(乙酸苯乙酯-D3,IS1)；4.phosphoric acid(磷酸)；5.glycerol(甘油)；7.glyceric acid(甘油酸)；8.malic acid(蘋果酸)；9.pyroglutamic acid(焦谷氨酸)；10，11.threonic acid(蘇阿糖酸)；12.heptadecane(十七烷,IS2)；13，14，15.fructose(果糖)；16.citric acid(檸檬酸)；17.2-thiobarbituric acid(2-硫代巴比妥酸)；18，19.glucose(葡萄糖)；20.inositol(肌糖)；21.sucrose(蔗糖)

應(yīng)用本方法對1號卷煙樣品進行重復(fù)性測試，按照“1.5”樣品處理方法和“1.4”GC-MS條件平行測定5次，計算方法的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表1。14種化合物測定結(jié)果的RSD為1.5%～7.6%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2 不同品牌煙絲硅烷化成分的含量分布

運用箱線圖對3個品牌卷煙的煙絲硅烷化成分含量進行比較，圖2列出了部分硅烷化成分的箱線圖。14種煙絲硅烷化成分的分布情況如下:

①卷煙品牌B的煙絲脯氨酸含量上、下四分位跨度較大，其含量范圍較寬，但卷煙品牌A、B的脯氨酸含量總體上明顯低于品牌C；②卷煙品牌C的煙絲焦谷氨酸含量上、下四分位跨度較大，含量范圍較寬，但總體上其煙絲焦谷氨酸含量低于品牌A、B；③3個品牌的煙絲磷酸含量上、下四分位均較為集中，總體上品牌B的磷酸含量大于品牌A、C；④甘油酸、蘋果酸、蘇阿糖酸、檸檬酸、果糖、葡萄糖、肌糖的含量呈現(xiàn)品牌A<品牌B<品牌C的趨勢；⑤品牌C煙絲2-硫代巴比妥酸的含量跨度較大，總體上品牌A的煙絲2-硫代巴比妥酸含量低于其他兩個品牌；⑥卷煙C的煙絲蔗糖含量明顯高于其他兩個品牌；⑦1,2-丙二醇和甘油含量在3個品牌間無明顯差異。

2.3 煙絲硅烷化成分對不同品牌卷煙的區(qū)分能力

箱線圖可以大致判斷硅烷化成分在3個品牌煙絲中的分布，但無法明確區(qū)分不同品牌卷煙。為明確21個樣品間的相似性和差異性，對其硅烷化成分含量進行標準化處理后，采用聚類分析法和主成分分析法進行分析，結(jié)果分別如圖3、4所示。

由圖3可知，當距離為1.0時，樣品分為兩類，品牌A卷煙(樣品1～9號)獨自聚成一類，距其他兩個卷煙較遠，實現(xiàn)了很好的區(qū)分。品牌B卷煙(樣品10～15號)和品牌C卷煙(樣品16～21號)距離相對較近，但在距離約0.6處相互區(qū)分開，各自聚為一類。聚類分析的結(jié)果表明，煙絲硅烷化成分可以很好地區(qū)分不同品牌卷煙。

21個樣品的主成分分析結(jié)果表明，前2個主成分因子的累計方差貢獻率為82%，其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差貢獻率分別為68%和14%，因此提取前2個主成分概括煙絲硅烷化的總信息量，對樣品進行綜合評價。由圖4可知，21個樣品在第一主成分和第二主成分構(gòu)成的空間內(nèi)聚為3類:樣品1～9聚成第1類，樣品10～15聚成第2類，樣品16～21聚成第3類，3個品牌各自很好地區(qū)分，表明相同品牌的卷煙存在較好的相似性，而不同品牌卷煙的硅烷化成分存在較大差異，與聚類分析的結(jié)果一致。

圖3 煙絲硅烷化成分的聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis result of different cigarette brands based on the silanized chemical components in cut tobacco

圖4 不同品牌卷煙煙絲硅烷化成分的主成分分析雙圖Fig.4 Principle component analysis bi-plot of different cigarette brands based on the silanized chemical components in cut tobacco

3類樣品在PC1上的得分也呈現(xiàn)明顯趨勢:卷煙品牌A<卷煙品牌B<卷煙品牌C。結(jié)合14種硅烷化成分在第一主成分上的載荷，由圖4可以看出:葡萄糖、甘油酸、果糖、肌糖、蘋果酸、蘇阿糖酸、蔗糖、檸檬酸在第一主成分上的載荷最大，其次為脯氨酸、磷酸、2-硫代巴比妥酸，焦谷氨酸在第一主成分上的載荷最小，表明品牌C卷煙煙絲中葡萄糖、甘油酸、果糖、肌糖、蘋果酸、蘇阿糖酸、蔗糖、檸檬酸的含量最高，品牌A卷煙煙絲中焦谷氨酸的含量最高，品牌B介于兩者之間，與箱線圖的分析結(jié)果基本一致。

因此可將3個品牌卷煙的煙絲硅烷化成分主要特征概括為:①品牌A除了焦谷氨酸含量較高外，糖類成分(葡萄糖、果糖、蔗糖、肌糖)、酸類成分(甘油酸、蘋果酸、蘇阿糖酸、檸檬酸、2-硫代巴比妥酸、磷酸)和脯氨酸含量均低于其他兩品牌；②品牌C卷煙煙絲的糖類成分(葡萄糖、果糖、蔗糖、肌糖)、酸類成分(甘油酸、蘋果酸、蘇阿糖酸、檸檬酸)及脯氨酸含量最高；③品牌B卷煙煙絲中糖、有機酸、氨基酸的含量介于品牌A、C之間；④3個品牌卷煙煙絲中的保潤劑成分(1,2-丙二醇和甘油)含量無明顯差別。

聚類分析和主成分分析的結(jié)果表明，煙絲硅烷化成分可以很好地區(qū)分不同品牌卷煙。3個卷煙品牌的硅烷化成分差異主要在于糖和酸含量的不同，而糖和酸均是卷煙料液中常用的原料，其種類的選擇、用量及協(xié)調(diào)性對料液的處理效果具有重要影響[17]。相同品牌聚成一類，可能是由于同一品牌廠家的煙葉庫存結(jié)構(gòu)相同，加之主流料液的應(yīng)用，使得相同品牌產(chǎn)品煙絲糖、酸成分的含量及比例整體上具有相似性，導(dǎo)致同一品牌樣品在聚類圖及主成分分析圖中聚成一團。反之，不同品牌卷煙由于各廠家的葉組配方和添加料液存在較大差異，因此煙絲中糖、酸的成分含量和比例差異大，使不同品牌卷煙可以很好地相互區(qū)分開。

3 結(jié) 論

本文運用硅烷化衍生化法對卷煙煙絲樣品中的主要化學(xué)成分進行檢測，得到了21個樣品的硅烷化GC-MS指紋圖譜，并通過箱線圖、聚類分析及主成分分析對實驗得到的煙絲硅烷化成分含量進行了處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)21個樣品被分成3類，相同品牌聚成一類，而不同品牌卷煙樣品在聚類分析樹狀圖和主成分分析得分圖中均能很好地相互區(qū)分，說明不同品牌卷煙的硅烷化成分存在較大的差異，表明煙絲硅烷化GC-MS指紋圖譜可以有效表征和區(qū)分卷煙品牌，從而為卷煙品牌風(fēng)味表征、質(zhì)量評價及控制提供有益的參考。