DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大策略應(yīng)用的研究進(jìn)展

俞 蓓，陳時(shí)建，徐天雄，占忠旭，賴(lài)衛(wèi)華，許恒毅*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330029)

基于核酸的檢測(cè)技術(shù)因其高特異性和靈敏度被廣泛用于生物小分子、無(wú)機(jī)金屬離子、核酸和蛋白質(zhì)分子的分析檢測(cè)，然而實(shí)際樣品中的被檢物往往痕量，核酸探針與靶標(biāo)物間通常以1∶1的比例結(jié)合，導(dǎo)致傳統(tǒng)利用功能核酸鏈檢測(cè)靶物的技術(shù)受到限制。近幾年，為進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，研究者建立了一系列基于核酸信號(hào)放大的檢測(cè)方法，將目標(biāo)物的識(shí)別轉(zhuǎn)化為DNA的擴(kuò)增。

根據(jù)酶的參與與否，信號(hào)放大方式可分為基于酶介導(dǎo)的信號(hào)放大和無(wú)酶介導(dǎo)的信號(hào)放大兩類(lèi)(圖1)?；诿附閷?dǎo)的信號(hào)放大主要通過(guò)酶的一些特殊功能對(duì)核酸進(jìn)行復(fù)制、剪接及修飾以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物活性分子的檢測(cè)，該策略可分為熱循環(huán)放大型和等溫?cái)U(kuò)增放大型[1]。其中，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為代表的熱循環(huán)放大型技術(shù)作為核酸檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可將靶標(biāo)的量放大108～109倍以利于常規(guī)方法的檢測(cè)[2]，但該方法需使用昂貴的儀器設(shè)備，且易出現(xiàn)交叉污染，從而造成假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果[3]。等溫?cái)U(kuò)增放大型技術(shù)如鏈置換擴(kuò)增(Strand displacement amplification，SDA)[4]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[5]、滾環(huán)復(fù)制(Rolling circle amplification，RCA)[6]和核酸外切酶Ⅲ酶切循環(huán)放大(Exonuclease Ⅲ-aided amplification)[7]等雖可進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，無(wú)需特殊加熱設(shè)備，但該類(lèi)方法所用酶的價(jià)格昂貴，保存時(shí)間較短，且酶活性易受環(huán)境影響。

圖1 基于核酸信號(hào)放大策略分類(lèi)Fig.1 Classification of signal amplification based on nucleic acid

相對(duì)于酶介導(dǎo)的信號(hào)放大，無(wú)酶介導(dǎo)的信號(hào)放大因操作簡(jiǎn)便、選擇性多、反應(yīng)穩(wěn)定而在現(xiàn)代分析領(lǐng)域中被廣泛關(guān)注。其中，基于DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝的信號(hào)放大技術(shù)因具有無(wú)需酶催化、常溫下可發(fā)生反應(yīng)、無(wú)需專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員及擴(kuò)增設(shè)備、檢測(cè)特異性強(qiáng)以及靈敏度與PCR相當(dāng)[8]等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在生化、食品和臨床等領(lǐng)域得到迅速發(fā)展。本文針對(duì)DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大方法在致病菌、核酸腫瘤標(biāo)記物、蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)金屬離子及生物小分子檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)其未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大方式的分類(lèi)

DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝反應(yīng)無(wú)需酶催化，DNA鏈可通過(guò)吉布斯自由能或位形熵的驅(qū)動(dòng)自行組裝，實(shí)現(xiàn)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的雜交反應(yīng)。常用的DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝反應(yīng)主要有雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)和熵驅(qū)動(dòng)催化反應(yīng)。

1.1 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization chain reaction，HCR)是一種無(wú)需酶催化，常溫下發(fā)夾型探針即可被目標(biāo)DNA鏈“激活”，并不斷雜交產(chǎn)生一條帶有切口的長(zhǎng)DNA雙鏈的信號(hào)放大方法[9]。其原理如圖2所示，反應(yīng)體系中兩個(gè)發(fā)夾型探針H1和H2均由粘性末端(a/c*)、莖部區(qū)(b和b*的配對(duì)區(qū))及環(huán)狀區(qū)(c/a*)3部分構(gòu)成。在無(wú)目標(biāo)鏈存在的情況下，這兩個(gè)發(fā)夾型探針均以莖環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定存在；當(dāng)目標(biāo)鏈a*b*存在時(shí)，目標(biāo)鏈中的a*b*與H1中粘性末端a和莖部b互補(bǔ)，在自由能的驅(qū)動(dòng)下，目標(biāo)鏈可與H1雜交，并打開(kāi)H1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而暴露出cb*序列；同樣地，cb*與H2中粘性末端c*和莖部b互補(bǔ)，然后在自由能的驅(qū)動(dòng)下，將H2的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，從而暴露出與目標(biāo)鏈相同的a*b*序列，其可作為目標(biāo)鏈繼續(xù)打開(kāi)H1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，反應(yīng)依次循環(huán)進(jìn)行，產(chǎn)生帶有切口的H1、H2交替互補(bǔ)雜交的長(zhǎng)DNA雙鏈。因?yàn)榉磻?yīng)物的自由能高于生成物的自由能，因此在自由能的驅(qū)動(dòng)下可自發(fā)進(jìn)行該反應(yīng)，以增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。

圖2 HCR原理圖Fig.2 The principle of HCR

1.2 催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)

催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)(Catalyzed hairpin assembly，CHA)是在HCR基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新型的自由能驅(qū)動(dòng)的發(fā)夾型DNA組裝方式。與HCR不同，CHA反應(yīng)中的目標(biāo)鏈可被置換并引發(fā)下一輪反應(yīng)，在整個(gè)反應(yīng)中起類(lèi)似催化劑的作用。根據(jù)放大方式不同，CHA可分為線性放大型和指數(shù)放大型兩種[10]，線性放大型CHA中發(fā)夾型探針通常被目標(biāo)鏈“激活”后依次進(jìn)行自組裝，并將目標(biāo)鏈置換出來(lái)，生成穩(wěn)定的線性雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，置換出的目標(biāo)鏈繼續(xù)引發(fā)下一輪雜交反應(yīng)，使檢測(cè)信號(hào)得到循環(huán)放大[11](圖3)；而指數(shù)放大型CHA中發(fā)夾型探針被目標(biāo)DNA催化自組裝生成中間物，該中間物又可“激活”下一輪發(fā)夾探針同步進(jìn)行自組裝[12]，從而使檢測(cè)信號(hào)得到指數(shù)式放大。在CHA反應(yīng)中，發(fā)夾型探針被目標(biāo)鏈“激活”后組裝，不僅可以增強(qiáng)目標(biāo)鏈的檢測(cè)信號(hào)，還可以根據(jù)不同的設(shè)計(jì)生成不同構(gòu)型的雙鏈DNA納米結(jié)構(gòu)組裝體，如組裝形成“Y”型DNA納米組裝體，以滿(mǎn)足不同的實(shí)驗(yàn)需要[12]。

圖3 CHA原理圖Fig.3 The principle of linear CHA

圖4 EDC原理圖Fig.4 The principle of EDC

1.3 熵驅(qū)動(dòng)催化反應(yīng)

熵驅(qū)動(dòng)催化反應(yīng)(Entropy drive catalysis，EDC)是一種借助熵驅(qū)動(dòng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的DNA自組裝反應(yīng)(反應(yīng)原理見(jiàn)圖4)，引發(fā)鏈C先與底物鏈S雜交，生成中間體I1，經(jīng)重排形成中間體I2，I2因結(jié)構(gòu)域間的結(jié)合力較弱分解生成SB和I3，I3繼續(xù)與底物F雜交生成中間體I4，I4經(jīng)重排后分解成OB和I5，I5經(jīng)重排后置換出引發(fā)鏈C并生成復(fù)合物W[13]。整個(gè)循環(huán)反應(yīng)中因堿基配對(duì)未發(fā)生變化，故可以忽略自由能的變化，利用位形熵的增加自發(fā)進(jìn)行鏈置換-雜交循環(huán)反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。

2 DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大技術(shù)的應(yīng)用

DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大技術(shù)成為當(dāng)前增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的研究熱點(diǎn)，基于此技術(shù)建立的各種檢測(cè)手段已被廣泛用于致病菌、核酸腫瘤標(biāo)記物、蛋白質(zhì)、生物小分子以及無(wú)機(jī)金屬離子的檢測(cè)。表1詳細(xì)總結(jié)了DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大技術(shù)在不同物質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用。

表1 DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大技術(shù)在不同被檢物檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 The application of DNA self-assembly for the detection of different samples

2.1 致病菌檢測(cè)

2.1.1致病菌全菌檢測(cè)DNA自組裝信號(hào)放大方法主要以?xún)煞N形式實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌全菌的檢測(cè):①根據(jù)目標(biāo)菌的核酸適配子設(shè)計(jì)發(fā)夾探針，實(shí)現(xiàn)自發(fā)組裝，并通過(guò)循環(huán)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。②信號(hào)輸出方式中引入DNA自組裝反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大。Guo等[14]建立了一種HCR參與的檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的雙抗夾心免疫法，抗體和寡核苷酸雙標(biāo)記的納米金探針通過(guò)HCR產(chǎn)生一條長(zhǎng)的帶有大量生物素的雙鏈DNA，通過(guò)生物素-鏈霉親和素的作用力與鏈霉親和素修飾的HRP酶連接，從而增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。該方法對(duì)純培養(yǎng)的大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)限可達(dá)1.08×102CFU/mL，較傳統(tǒng)的ELISA法靈敏度提高了185倍。Chen等[15]結(jié)合CHA信號(hào)放大策略，構(gòu)建了一種基于核酸適配體的檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的過(guò)氧化物模擬酶比色傳感器，其將G-四聯(lián)體序列部分隱藏在發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，在有鼠傷寒沙門(mén)氏菌存在的情況下，核酸適配體與其結(jié)合并釋放CHA引發(fā)序列催化發(fā)夾自組裝，暴露出的完整G-四聯(lián)體序列可與氯化高鐵血紅素結(jié)合形成過(guò)氧化物模擬酶，在H2O2存在下，催化底物2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS2-)顯色。該法在PBS中的檢測(cè)限為103CFU/mL，檢測(cè)僅需2 h。

2.1.2致病菌核酸檢測(cè)利用DNA自組裝信號(hào)放大技術(shù)對(duì)致病菌核酸進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，首先需針對(duì)靶核苷酸序列設(shè)計(jì)兩個(gè)至多個(gè)與之對(duì)應(yīng)的特異性自組裝發(fā)夾型探針，然后加入靶DNA引發(fā)DNA發(fā)夾自組裝，最后通過(guò)不同的檢測(cè)手段對(duì)反應(yīng)終產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。Ying等[16]以沙門(mén)氏菌的16S rRNA基因?yàn)榘行蛄校Y(jié)合膠體金免疫層析法和HCR信號(hào)放大的方法對(duì)其檢測(cè)，該方法對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)限為3×103CFU/mL；對(duì)靶DNA的檢測(cè)限可達(dá)1.76 pmol/L，比未經(jīng)HCR放大的檢測(cè)限低2個(gè)數(shù)量級(jí)。Ma等[17]利用納米金聚集與分散而引起顏色變化的性質(zhì)，結(jié)合指數(shù)放大型CHA(EHA)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)副溶血性弧菌基因組DNA中部分保守序列的裸眼檢測(cè)，15 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)裸眼檢測(cè)且對(duì)靶DNA的檢測(cè)限達(dá)25 pmol/L，較傳統(tǒng)的納米金比色法的靈敏度提高了約400倍。Chen等[15]構(gòu)建了基于CHA信號(hào)放大的過(guò)氧化物模擬酶比色傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺炎鏈球菌lytA的超靈敏檢測(cè)，在純培養(yǎng)液中肺炎鏈球菌的檢測(cè)限為156 CFU/mL，對(duì)靶DNA的檢測(cè)限達(dá)32 pmol/L，可實(shí)現(xiàn)裸眼檢測(cè)。Yu等[37]以產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的嘔吐毒素編碼基因(cesB)部分片段為靶序列，結(jié)合HCR信號(hào)放大方法和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其檢測(cè)，在純培養(yǎng)液中產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)限為7.6×100CFU/mL，牛奶加標(biāo)樣中的檢測(cè)限為9.2×102CFU/mL。

2.2 核酸腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)

微小核糖核酸(miRNAs)是一類(lèi)具有調(diào)控功能的內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA分子。miRNAs的異常表達(dá)與一些癌癥(肺癌、胃癌、乳腺癌等)的發(fā)生密切相關(guān)，已被當(dāng)作新型的腫瘤標(biāo)記物。Northern印跡雜交雖作為miRNAs檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[38]，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力且靈敏度低。DNA自組裝信號(hào)放大技術(shù)簡(jiǎn)單易操作且特異性強(qiáng)，被引入易突變的miRNAs檢測(cè)體系中。Wu等[39]將G-四聯(lián)體序列一分為二，分別設(shè)計(jì)在兩個(gè)自組裝發(fā)夾型探針中，當(dāng)let-7a存在時(shí)，可引發(fā)HCR反應(yīng)，從而將G-四聯(lián)體的兩部分結(jié)合形成完整序列，并與氯化血紅素結(jié)合形成具有辣根過(guò)氧化物酶活性的DNA模擬酶，催化H2O2和ABTS2-顯色，該方法在let-7a濃度為10 fmol/L～10 nmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，對(duì)let-7a的檢測(cè)限為7.4 fmol/L，且可以識(shí)別單堿基突變。Zhai等[18]將HCR輔助的信號(hào)放大與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，將捕獲探針固定在納米金修飾的電極上，捕獲miRNA-21引發(fā)擴(kuò)增的HCR反應(yīng)產(chǎn)物，并將其作為電化學(xué)信號(hào)的載體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA-21的超靈敏檢測(cè)。該方法具有良好的特異性，線性范圍為1 fmol/L～100 pmol/L，對(duì)miRNA的檢測(cè)限可達(dá)0.56 fmol/L，檢測(cè)時(shí)間為2.5 h。Miao等[40]建立了一種基于帶正電納米金和HCR信號(hào)放大的miRNA檢測(cè)方法，只有miRNA-21存在時(shí)才可啟動(dòng)HCR形成很長(zhǎng)的dsDNA，其可通過(guò)靜電吸附與帶正電的納米金結(jié)合，從而使納米金沉淀，并根據(jù)此變化實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的檢測(cè)。該方法特異性強(qiáng)，對(duì)miRNA-21的檢測(cè)限為6.8 pmol/L，線性范圍為20 pmol/L～10 nmol/L。

2.3 蛋白質(zhì)檢測(cè)

蛋白質(zhì)作為生命體內(nèi)重要的生物大分子，不僅能夠調(diào)控細(xì)胞代謝，還能作為生物標(biāo)志物監(jiān)控疾病的發(fā)生。蛋白質(zhì)的常用檢測(cè)方法主要是基于抗原-抗體的特異性識(shí)別的標(biāo)記免疫分析法，但其操作復(fù)雜、成本高且需專(zhuān)業(yè)操作人員[41]。隨著指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)的發(fā)展，越來(lái)越多的靶標(biāo)蛋白適配體被成功篩選出來(lái)。作為新型的分子識(shí)別元件，核酸適配體在蛋白質(zhì)檢測(cè)的應(yīng)用中受到廣泛關(guān)注。Wang課題組[42-43]依據(jù)核酸適配體與癌胚抗原(CEA)間的親和力，分別構(gòu)建了基于納米金-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物信號(hào)放大的膠體金適配子試紙條，以及基于適配體-納米金探針與石墨烯-鏈霉親和素納米復(fù)合物的夾心型電化學(xué)適配體型傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CEA的靈敏檢測(cè)。然而，核酸適配體與目標(biāo)物通常以1∶1結(jié)合，導(dǎo)致檢測(cè)限高，故DNA自組裝信號(hào)放大技術(shù)被引入以增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，提高靈敏度。Yang等[44]基于核酸適配體的HCR和CHA雙重信號(hào)放大策略，構(gòu)建了檢測(cè)CEA的熒光傳感器，其檢測(cè)限可達(dá)0.3 pg/mL。Lu等[45]將基于核酸適配體的CHA和Exo-Ⅲ酶切循環(huán)放大策略與熒光傳感器相結(jié)合，通過(guò)熒光信號(hào)變化實(shí)現(xiàn)了對(duì)CEA的檢測(cè),該方法對(duì)CEA的檢測(cè)限達(dá)58 fg/mL。Wang等[23]利用基于核酸適配體的HCR信號(hào)放大，結(jié)合氧化石墨烯建立了血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)的靈敏檢測(cè)方法，其將PDGF-BB的核酸適配體隱藏在發(fā)夾DNA中，當(dāng)PDGF-BB存在時(shí)，核酸適配體與其結(jié)合并暴露出能引發(fā)HCR的序列，催化發(fā)夾結(jié)構(gòu)的自組裝，形成長(zhǎng)的雙鏈DNA，隨后加入熒光染料SYBR Green I嵌入dsDNA間，產(chǎn)生熒光信號(hào)。該方法靈敏度高，檢測(cè)限為1.25 pmol/L。Zhao等[8]構(gòu)建了一種HCR參與的檢測(cè)葉酸受體的雙鏈DNA-銅納米顆粒生物傳感器，將捕獲探針固定在納米金修飾的電極上，捕獲葉酸受體引發(fā)擴(kuò)增的HCR反應(yīng)產(chǎn)物，并將其作為dsDNA-CuNPs復(fù)合物產(chǎn)生的模板，進(jìn)而合成CuNPs。電極表面的CuNPs被硝酸溶解后，產(chǎn)生的銅離子催化底物o-鄰苯二胺(OPD)生成具有電活性的2,3-二氨基吩嗪(DAP)，并通過(guò)電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)葉酸受體。該方法特異性強(qiáng)，檢出限為3 pg/mL，線性范圍為0.01～100 ng/mL。Bai等[46]發(fā)明了一種基于核酸適配體和CHA輔助放大的檢測(cè)α-凝血酶的過(guò)氧化物模擬酶比色傳感器，該方法對(duì)α-凝血酶的檢測(cè)限為0.68 pmol/L，線性范圍為1 pmol/L～2.5 nmol/L。

2.4 生物小分子檢測(cè)

DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大策略主要通過(guò)結(jié)合核酸適配體技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子的檢測(cè)。Gao等[47]建立了一種基于核酸適配體和HCR輔助下信號(hào)放大的方法用于ATP檢測(cè)，ATP可與核酸適配體結(jié)合，使非適配體部分序列暴露出來(lái)，從而引發(fā)HCR反應(yīng)，形成的長(zhǎng)鏈DNA分子可使納米金聚集，從而產(chǎn)生顏色變化實(shí)現(xiàn)ATP的檢測(cè)，該方法對(duì)ATP的檢測(cè)限為1 nmol/L。Sun等[48]基于核酸適配體的HCR和核酸外切酶Ⅲ(Exo-Ⅲ)雙重信號(hào)放大策略，構(gòu)建了檢測(cè)腺苷的過(guò)氧化物模擬酶比色傳感器，檢測(cè)限可達(dá)4.2×10-7mol/L。Huang等[29]將基于核酸適配體的CHA信號(hào)放大策略與熒光傳感器相結(jié)合，在發(fā)夾型探針H1的5′端標(biāo)記了芘分子，以CHA產(chǎn)物作為載體，通過(guò)熒光信號(hào)變化實(shí)現(xiàn)了對(duì)腺苷的檢測(cè)。該方法對(duì)腺苷的檢測(cè)限達(dá)42 nmol/L，并成功應(yīng)用于人血清樣本中腺苷的檢測(cè)。Wang等[49]結(jié)合HCR信號(hào)放大策略，構(gòu)建了一種基于核酸適配體的過(guò)氧化物模擬酶比色傳感器來(lái)檢測(cè)赭曲霉毒素A(OTA)，其檢測(cè)限可達(dá)0.01 nmol/L，線性范圍為0.01～0.32 nmol/L。

2.5 無(wú)機(jī)金屬離子檢測(cè)

重金屬離子Pb2+和Hg2+等廣泛存在于自然界中，能通過(guò)生物富集作用以不同途徑嚴(yán)重危害人體健康?；贒NA自組裝信號(hào)放大的檢測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)無(wú)機(jī)金屬離子的痕量檢測(cè)而被廣泛應(yīng)用。Zhuang等[50]將Pb2+特定的脫氧核酶固定在磁珠上，當(dāng)Pb2+存在時(shí)，其可與脫氧核酶發(fā)生特異性作用，通過(guò)切割rRNA序列將功能酶底物剪切成兩部分，其中連接在磁珠表面的殘余核酸序列可通過(guò)HCR反應(yīng)形成連有大量二茂鐵的雙鏈DNA，并通過(guò)電化學(xué)信號(hào)的改變實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+的定量檢測(cè)。該方法對(duì)Pb2+的檢測(cè)限為37 pmol/L，線性范圍為0.1～75 nmol/L。根據(jù)相同原理，Chen等[36]建立了一種基于脫氧核酶和CHA信號(hào)放大的Pb2+檢測(cè)的膠體金免疫層析法，檢測(cè)限為10 pmol/L，較未經(jīng)信號(hào)放大的試紙條法，其檢測(cè)限降低4個(gè)數(shù)量級(jí)。Huang等[51]構(gòu)建了一種基于HCR輔助的信號(hào)放大策略檢測(cè)Hg2+的熒光傳感器，并引入氧化石墨烯作為猝滅劑降低背景信號(hào)，當(dāng)加入Hg2+時(shí)，利用T-Hg2+-T配對(duì)連接在引發(fā)鏈和發(fā)夾型探針H1間，啟動(dòng)HCR反應(yīng)并產(chǎn)生帶有大量熒光基團(tuán)FAM的雙鏈DNA，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)放大，該方法對(duì)Hg2+的檢測(cè)限達(dá)0.3 nmol/L，且具有良好的特異性。Wang等[52]建立了一種基于HCR信號(hào)放大的納米金比色檢測(cè)方法，當(dāng)Hg2+存在時(shí)，其利用T-Hg2+-T配對(duì)打開(kāi)發(fā)夾型探針H0，進(jìn)而觸發(fā)HCR反應(yīng)，從而使納米金聚集，并通過(guò)顏色變化實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的裸眼檢測(cè)。該方法對(duì)Hg2+的檢測(cè)限為30 nmol/L，較未經(jīng)修飾的納米金比色法，其檢測(cè)限低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。

3 總結(jié)與展望

DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝作為近幾年迅速發(fā)展的信號(hào)放大方法，因具有無(wú)酶參與、等溫和識(shí)別序列能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在致病菌、核酸腫瘤標(biāo)記物、蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)金屬離子等分析檢測(cè)方面展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。然而在基于DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大策略的生物分子檢測(cè)中，仍存在一些問(wèn)題亟待解決:①DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大效率與發(fā)夾探針的設(shè)計(jì)有關(guān)[16]，目前針對(duì)發(fā)夾探針設(shè)計(jì)的具體操作鮮見(jiàn)報(bào)道，開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)并評(píng)估發(fā)夾探針效果的軟件尤為迫切；②單獨(dú)使用DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大策略實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)的研究不多，未來(lái)可將幾種DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大策略聯(lián)用或與其他無(wú)酶信號(hào)放大方法結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的多重放大；③探尋其他檢測(cè)手段或信號(hào)放大技術(shù)(如共聚焦顯微鏡、拉曼散射等)與DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大策略聯(lián)用，以提高檢測(cè)的靈敏度及特異性，為目標(biāo)物檢測(cè)提供一個(gè)無(wú)酶、免標(biāo)記、高特異性和靈敏度的檢測(cè)平臺(tái)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝信號(hào)放大策略將朝著即時(shí)、靈敏、高特異性的方向發(fā)展，最大程度地實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用價(jià)值。