慢性乙型肝炎患者外周血TRECs與CD45+T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的臨床意義

王琛　張永樂(lè)　潘克女

[摘要] 目的 探討慢性乙型肝炎患者外周血中T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)（TRECs）含量以及CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的臨床意義。 方法 流式細(xì)胞技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)32例輕度慢乙肝患者、42例中度慢乙肝患者、38例重度慢乙肝患者以及30例健康對(duì)照人群外周血中TRECs的含量以及CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)。 結(jié)果 慢性乙型肝炎患者中輕、中、重組以及健康對(duì)照組間相比CD3+/CD4+/CD8+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+變化均無(wú)明顯差異（P>0.05）；CD8+CD45RA+均有不同程度的下降，尤其在重度組中下降最為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），CD8+CD45RO+存在明顯的升高，同樣在重度組中升高最為顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；TRECs含量慢乙肝組較正常對(duì)照組明顯降低（P<0.05）；在慢性乙型肝炎患者中輕、中、重慢乙肝組間TRECs含量也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。 結(jié)論 TRECS是胸腺近期輸出功能指標(biāo)，能夠反映慢性乙型肝炎近期免疫功能，外周血TRECS與CD45+T淋巴細(xì)胞亞群聯(lián)合檢測(cè)較常規(guī)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群更能全面了解慢性乙型肝炎的進(jìn)展及預(yù)后。

[關(guān)鍵詞] T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)；CD45；慢性乙型肝炎；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；流式細(xì)胞技術(shù)

[中圖分類號(hào)] R512.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）23-0008-04

Clinical significance of TRECs and CD45+T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B

WANG Chen1 ZHANG Yongle2 PAN Kenv1 LV Tiefeng1

1.Department of Hepatology， Hangzhou XIXI Hospital， Hangzhou 310023， China； 2.Clinical Laboratory， Tongde Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310012， China

[Abstract] Objective To investigate the content of T cell receptor rearrangement（TRECs） and the expression of CD4+CD45RA+， CD4+CD45RO+， CD8+CD45RA+， CD8+CD45RO+T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B. Methods The content of TRECs and the expression of CD4+CD45RA+， CD4+CD45RO+， CD8+CD45RA+， CD8+CD45RO+T lymphocyte subsets in peripheral blood of 32 patients with mild chronic hepatitis B， 42 patients with moderate chronic hepatitis B， 38 patients with severe chronic hepatitis B and 30 healthy controls were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and flow cytometry. Results There was no significant difference in CD3+/CD4+/CD8+， CD4+CD45RA+， CD4+CD45RO+T lymphocyte subsets between mild， moderate， recombinant and healthy controls in patients with chronic hepatitis B（P>0.05）； CD8+CD45RA+T lymphocyte subsets decreased in all groups， especially in the severe group， and the difference was statistically significant（P<0.05）； CD8+CD45RO+T lymphocyte subsets were significantly increased in all groups， the most significant increase in the severe group was statistically significant（P<0.05）； Compared with the normal control group， the content of TRECs in the chronic hepatitis B group was significantly decreased（P<0.05）； There was also a significant difference in TRECs content between mild， moderate and severe hepatitis B groups（P<0.05）. Conclusion TRECs is a short-term output function of thymus， can respond to the recent immune function of chronic hepatitis B.Compared with conventional CD4+ and CD8+T lymphocyte subsets， TRECs and CD45+T lymphocyte subsets were able to fully understand the progression and prognosis of chronic hepatitis B.

[Key words] T cell receptor rearrangement； CD45； chronic hepatitis B； Real-time fluorescence quantitative PCR； Flow cytometry

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染肝細(xì)胞后，HBV不是直接殺傷肝細(xì)胞，而是誘導(dǎo)被感染者主動(dòng)、被動(dòng)免疫應(yīng)答造成肝細(xì)胞損傷。T淋巴細(xì)胞亞群失衡、功能障礙是導(dǎo)致乙型肝炎慢性化的主要原因；胸腺是人體免疫特別是細(xì)胞免疫的重要器官，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化和成熟，胸腺功能的表達(dá)在HBV感染慢性化的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過(guò)程中具有重要的意義[1]。筆者采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)健康人群、不同程度（輕、中、重）的慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血PBMCs中TRECs的含量及外周血中CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)分析，探討慢性乙型肝炎的病情進(jìn)展與TRECs及CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞亞群間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

收集2016年1～12月在杭州市西溪醫(yī)院住院治療的慢性乙型肝炎患者112例，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2015中國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南》[2]，排除其他嗜肝病毒感染致肝損以及其他導(dǎo)致肝臟損傷的相關(guān)疾病。其中32例輕度慢乙肝患者、42例中度慢乙肝患者、38例重度慢乙肝患者，男65例，女47例，年齡分布為25～40歲，平均年齡31.9歲；2016年本院職工健康體檢30例為對(duì)照組。各組年齡和性別分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

1.2 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀：美國(guó)Beckman Coulter公司CF 500流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；高速冷凍離心機(jī)和連續(xù)可調(diào)移液器均為德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)AB公司生產(chǎn)型號(hào) Stepone Plus。試劑：美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的淋巴細(xì)胞分離試劑以及CD3+/CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞和CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞試劑；PCR測(cè)定所需Buffer液、DNTP、Taq酶等原料購(gòu)自TaKaRa Biotec；引物、探針由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，廣州藍(lán)博生物科技有限公司生產(chǎn)外周淋巴細(xì)胞分離液及核酸抽提試劑。

1.3 方法

采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行TRECs含量檢測(cè)。

1.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用EDTA抗凝管抽取全血2 mL（每mL新鮮全血中加1.8 mg EDTA抗凝）。吸取CD3+PE/CD4+FTTC/CD8+PC5三色試劑10 μL，試劑批號(hào)為：SWP201602；吸取CD4+ FTTC/CD45RA+ PE/CD45RO+ PC5三色試劑10 μL，試劑批號(hào)為：SWP201605；吸取CD8+ FTTC/CD45RA+ PE/CD45RO+ PC5三色試劑10 μL，試劑批號(hào)為：SWP201604，分別置于三支潔凈試管中，再分別加入50 μL全血，充分混勻，室溫避光放置20 min。加入1 mL細(xì)胞裂解液，充分混勻，避光室溫放置15 min，加入2 mL PBS液充分混勻，1000 rpm離心5 min，棄上清用吸紙吸干殘留液體。向試管中加入0.5 mL PBS液混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)。使用CXP系統(tǒng)設(shè)定檢測(cè)淋巴細(xì)胞數(shù)量>2000個(gè)，對(duì)預(yù)檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行設(shè)門檢測(cè)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TRECs EDTA抗凝血1 mL，用PBS 1：1進(jìn)行稀釋后，輕輕轉(zhuǎn)入1 mL的淋巴分離液中，水平冷凍離心機(jī)2500 rpm離心15 min，吸取中間層漂浮云霧狀物置于1.5 mL離心管，12000 rpm離心10 min棄上清，在沉淀中加入50 μL DNA抽提液100℃，煮沸10 min，12000 rpm離心5 min取上清5 μL為模板進(jìn)行下一步PCR檢測(cè)。TRECs實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)總反應(yīng)體系為50 μL，其中上下游引物各0.5 μmol/L； dNTP各0.2 mmol/L；Taq酶1.5U；熒光探針0.1 μmol/L；Mg2+ 4 mmol/L；模板或標(biāo)準(zhǔn)品5 μL；加雙蒸水補(bǔ)足50 μL；反應(yīng)條件設(shè)置為94℃ 2 min；94℃ 30 sec；56℃ 45 sec運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，保存結(jié)果，自動(dòng)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)間的關(guān)系采用線性相關(guān)分析法，多組數(shù)據(jù)比較采取單因素方差分析法；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞亞群在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康對(duì)照組間比較

外周血CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+T細(xì)胞亞群百分比計(jì)數(shù)在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康對(duì)照組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均>0.05），CD8+CD45RA+T細(xì)胞百分比在健康對(duì)照組以及慢性乙型肝炎輕度、中度、重度組中呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；CD8+CD45RO+T細(xì)胞百分比在健康對(duì)照組以及慢性乙型肝炎輕度、中度、重度組中呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見表2。

2.2 TRECs含量在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康對(duì)照組間比較

TRECs含量在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康對(duì)照組間含量分別為（5.82±1.87）logcopies/106 PBMCs、（5.11±1.42）logcopies/106 PBMCs、（4.05±1.15）logcopies/106 PBMCs、（6.42±2.02）logcopies/106 PBMCs；各組間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見表3。

3討論

乙肝病毒（HBV）感染可導(dǎo)致患者呈現(xiàn)急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝硬化甚至肝癌的發(fā)生[3]。實(shí)驗(yàn)表明HBV感染的病情進(jìn)展與患者特異性的T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)弱有著密切關(guān)系[4]。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，它能夠負(fù)向調(diào)節(jié)針對(duì)自身和外來(lái)抗原的免疫反應(yīng)[5-6]。在調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞中又可分為原始幼稚性CD45RA+T淋巴細(xì)胞（原始T淋巴細(xì)胞）和記憶性CD45RO+T淋巴細(xì)胞。CD45RO+T細(xì)胞表現(xiàn)為記憶細(xì)胞的特性，具有輔助誘導(dǎo)作用；而CD45RA+T細(xì)胞卻表現(xiàn)為初始的T細(xì)胞特點(diǎn)，具有抑制免疫的作用[7-8]。因此CD45RA+T淋巴細(xì)胞和CD45RO+T淋巴細(xì)胞常用來(lái)作為疾病活動(dòng)、復(fù)發(fā)和療效的判斷，具有很重要的臨床意義[9]。

本文對(duì)慢性乙型肝炎輕度、中度、重度以及健康對(duì)照者的外周血中CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)外周血CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+細(xì)胞亞群百分比計(jì)數(shù)在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康對(duì)照組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。慢性乙型肝炎輕度、中度、重度感染者與健康對(duì)照者相比CD8+CD45RA+T細(xì)胞明顯減低，CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞明顯增高，而CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+T細(xì)胞無(wú)明顯改變，這一結(jié)論提示，在慢性乙型肝炎感染中常規(guī)檢測(cè)CD3+/CD4+/CD8+細(xì)胞亞群并不能反映疾病感染的狀態(tài)，與俞立飛等[10]報(bào)告一致。而CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞在乙型肝炎的慢性化過(guò)程中起到重要作用，與慢性乙型肝炎患者病情進(jìn)展呈正相關(guān)[11]。這一現(xiàn)象可能與CD8+CD45RA+T原始幼稚淋巴細(xì)胞的持續(xù)存在，當(dāng)乙肝病毒持續(xù)感染肝細(xì)胞時(shí)大量CD8+CD45RA+T原始幼稚淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為CD8+CD45 RO+T記憶性淋巴細(xì)胞，因此出現(xiàn)隨著肝病程度的加重CD8+CD45RA+T百分比下降，而CD8+CD45RO+T百分比上升。CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞的增多發(fā)揮其免疫誘導(dǎo)作用，進(jìn)而致使機(jī)體殺傷感染HBV肝細(xì)胞，導(dǎo)致更多的肝細(xì)胞壞死，加重肝臟的嚴(yán)重程度。

在臨床實(shí)踐中獲取胸腺組織了解胸腺功能變化并不現(xiàn)實(shí)。因此，胸腺功能的評(píng)估通常使用能夠反映胸腺近期輸出功能的間接指標(biāo)[12]。TRECs是一種可穩(wěn)定存在的游離基因，其不隨T細(xì)胞分裂增殖而擴(kuò)增，而是隨著T細(xì)胞分裂增殖而逐漸稀釋，所以測(cè)定TRECs含量可以了解初始T細(xì)胞的含量[13]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)（TRECs）含量能反映機(jī)體近期胸腺輸出功能。如早在1998年，Douek等[14]首先報(bào)道使用TRECs來(lái)評(píng)價(jià)HIV-1感染者的胸腺功能；馬旭明等[15]發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者Treg細(xì)胞中TREC的數(shù)量明顯減少?；颊逤D31+ Treg比例的下調(diào)與Treg細(xì)胞中TRECs數(shù)量的減少呈正相關(guān)；李文言等[16]利用TRECs含量評(píng)價(jià)丙種球蛋白缺乏血癥患兒的胸腺輸出功能；李曉勇等[17]通過(guò)切除小鼠胸腺后檢測(cè)TRECs含量證實(shí)胸腺切除后TRECs明顯降低，這一現(xiàn)象不僅發(fā)生在幼鼠對(duì)成年小鼠的影響也極其大。

本文對(duì)慢性乙型肝炎輕度、中度、重度以及健康對(duì)照組的外周血進(jìn)行TRECs含量的檢測(cè)，結(jié)果分別為（5.82±1.87）logcopies/106 PBMCs、（5.11±1.42）logcopies/106PBMCs、（4.05±1.15）logcopies/106PBMCs、（6.42±2.02）logcopies/106PBMCs，健康對(duì)照組的TRECS含量明顯高于慢性乙型肝炎患者（輕、中、重），在慢乙肝患者輕、中、重度組中也存在差異，隨著肝炎程度的加重TRECs含量也明顯降低，這一結(jié)論與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致[18-20]，表明慢性乙型肝炎患者外周血T細(xì)胞數(shù)量減少與胸腺近期輸出功能降低有關(guān)，并且肝臟炎癥程度越重機(jī)體免疫輸出功能越低。

綜上所述，在慢性乙型肝炎感染患者中常規(guī)的CD3+/CD4+/CD8+細(xì)胞亞群百分比計(jì)數(shù)并不能評(píng)價(jià)患者的免疫狀態(tài)，CD45 RA+/RO+T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)能反映出慢乙肝患者的原始幼稚淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換記憶性淋巴細(xì)胞的過(guò)程，尤其CD8+CD45RO+T對(duì)慢性乙肝肝炎起到重要作用與病情呈正相關(guān)；TRECs含量能反映出慢乙肝患者胸腺近期輸出的功能，因此在慢性乙型肝炎感染患者進(jìn)行CD8+CD45RO+T和TRECs檢測(cè)能全面評(píng)估患者免疫狀態(tài)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 吳銀亞，譚善忠.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用[J].中華傳染病雜志，2012， 30（9）：563-565.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南[J].中華肝臟病雜志，2015，23（12）：888-905.

[3] Lok AS，McMahon BJ，Practice Guidelines Committee，et al.Chronic hepatitis B：update of recommendations[J].Hepatology，2004，39：857-861.

[4] Stoop JN，van der Molen RG，Baan CC，et al.Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection[J]. Hepatology，2005，41：771-778.

[5] Baecher-Allan C，Viglietta V，Hafler DA.Inhibition of human CD4+CD25+highregulatory T cell function[J].J Immunol，2002，169：6210-6217.

[6] Sakaguchi S.Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic selftolerance and negative control of immune responses[J].Annu Rev Immunol，2004，22：531-562.

[7] Lynch KW，Weiss A.A CD45 polymorphisn associated with multiple sclerosis disrupts an exonic splicing silencer[J].J Biol Chem，2001，276（26）：24341-24347.

[8] Wohman AM，van der Kooij SW，de Fijter JW，et al.Maturation resistant dendritic cells induce hyporesponsiveness in alloreactive CD45RA+ and CDRO+T-cell populations[J].Am J Transplant，2006，6（11）：2580-2591.

[9] 呂學(xué)文，陳煥偉，徐瓊，等.外周T細(xì)胞淋巴瘤患者中PD-1的表達(dá)對(duì)CD45RA、CD45RO+T細(xì)胞的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017，25（10）：1643-1646.

[10] 俞立飛，盧丹，張永樂(lè)，等.CD31分子在T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)頻率和慢性HBV感染關(guān)系[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2016，30（6）：499-502.

[11] 邵錦帆，袁曉東，駱必偉，等.慢性乙型肝炎患者外周血中記憶T細(xì)胞亞群分布研究[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015， 26（3）：15-17.

[12] 史慧慧，張小楠，張占卿. T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)定量檢測(cè)及其在慢性乙型肝炎中的應(yīng)用[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2012，6（13）：154-155.

[13] 李美珍，廖苑君，鄭嘉坤，等.異基因造血干細(xì)胞移植合并胸腺移植及CD4-DLI后T細(xì)胞重建情況[J].廣東醫(yī)學(xué)，2016，37（10）：1425-1428.

[14] Douek DC，McFarland RD，Keiser PH，et al.Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV inferential[J].Nature，1998，396（12）：690-695.

[15] 馬旭明，蘇又蘇，方紅成，等.急性冠脈綜合癥患者胸腺新近輸出CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的檢測(cè)及意義[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2011，127（2）：172-176.

[16] 李文言，陳金淑，趙芹，等.以丙種球蛋白缺乏血癥為突出表現(xiàn)的X連鎖淋巴細(xì)胞異常增生癥1型兩家系研究[J].中華兒科雜志，2017，55（5）：377-382.

[17] 李曉勇，安永，李勇剛，等.胸腺切除對(duì)小鼠胸腺功能及外周T淋巴細(xì)胞的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30（10）：1018-1021.

[18] 葛國(guó)洪，陳明，李紅兵，等.慢性乙型肝炎患者抗病毒治療前后TRECs含量變化[J].臨床肝膽病雜志，2007，23（3）：163-165.

[19] 潘克女，張永樂(lè)，俞立飛，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)慢性乙型肝炎患者胸腺近期輸出功能[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2017，27（3）：361-365.

[20] Tessitore MV，Sottini A，Roccaro AM，et al.Detection of newly produced T and B lymphoctes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs[J].J Transl Med，2017，15（1）：70-80.

（收稿日期：2018-01-26）