應(yīng)對(duì)豬胸膜肺炎：類毒素疫苗保護(hù)的重要性

一、簡(jiǎn)介

豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌（AP）引起的豬的呼吸道疾病，能引起各個(gè)年齡段豬的急性和慢性感染，是一種致死性和高度接觸性的傳染病。以急性出血性纖維素性胸膜炎和出血性肺炎為主要特征，急性病例死亡率可達(dá)80%以上，慢性經(jīng)過者生長(zhǎng)發(fā)育受阻，易引發(fā)其他病原感染而死亡。自1957年P(guān)attison首次報(bào)道后，此后該病逐漸擴(kuò)散至世界各地，在美洲、歐洲、澳大利亞、亞洲等地均有流行，但各地方所流行的血清型不盡相同，給該病的防治帶來相當(dāng)?shù)睦щy。目前該病在全世界很多國(guó)家廣泛流行，是國(guó)際公認(rèn)的危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著我國(guó)引進(jìn)豬不斷增多，該病在我國(guó)也開始流行起來。

二、區(qū)分血清型

由于其病原菌是放線桿菌，所含血清型較多。胸膜肺炎放線桿菌根據(jù)其生長(zhǎng)是否需要V因子（V因子為輔酶I，即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD或輔酶II，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADP）和尼克酰胺腺呤二核苷酸，可將其分為兩個(gè)生物型，依賴外源V因子才能生長(zhǎng)的是生物1型（ biotype I），不需要V因子就能培養(yǎng)生長(zhǎng)的是生物Ⅱ型（ biotype II）。到1999年，AP已經(jīng)被分離鑒定出了15種血清型（1～15血清型），根據(jù)可溶性英膜多糖（CPS）和脂多糖（LPS）的特性，將生物I型分為13個(gè)血清型，其中5型又分為5a和5b兩個(gè)亞型，將生物Ⅱ型分為2個(gè)血清型，且生物 I型致病性強(qiáng)于生物型Ⅱ。

準(zhǔn)確區(qū)分此病原菌的不同血清型是研制有效預(yù)防疫苗的前提。各種血清學(xué)方法仍是現(xiàn)階段對(duì)胸膜肺炎放線桿升感血清型定的主要手段，但不足之處是，存在一定程度的交叉反應(yīng)以及不能對(duì)新分離的原菌進(jìn)行分型。而采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)不同基因進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行血清型鑒定基因分型方法，具有準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可克服傳統(tǒng)血清學(xué)方法的不足，己經(jīng)逐成為胸膜肺類放線桿菌研完中的新的分型方法。

在不同的國(guó)家，血清型的再劃分是高度可變的。某些血清型可能在某一地區(qū)更為普遍，被視為“特定國(guó)家”，但通常在同一國(guó)家會(huì)出現(xiàn)很多種血清型。(表1)

表1 不同國(guó)家主要血清型的類型

隨著時(shí)間的推移，各種血清型的存在也會(huì)發(fā)生變化，過去不存在或存在較少的血清型可能成為最主要的血清型。例如，在聯(lián)合國(guó)，2004年以3型為主，2009年以8型為主。

在一個(gè)畜群中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)多種血清型，而且可以從一些農(nóng)場(chǎng)的母豬和育肥豬中分離出不同的血清型。即使在穩(wěn)定的、病毒流行率低的農(nóng)場(chǎng)中，也存在病毒暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。(圖 1)。

圖1 對(duì)血清型2型的血清型陽性率和胸膜炎發(fā)病率(Busch E，2010 年 )。

三、流行病學(xué)

各種年齡、性別的豬都有易感性，其中6周齡至6月齡的豬較多發(fā)，但以3月齡仔豬最為易感。本病的發(fā)生多呈最急性型或急性型病程而迅速死亡，在豬群中急速暴發(fā)，發(fā)病率和死亡率一般為50%左右，最急性型的死亡可達(dá)80%～100%。病豬和帶菌豬是本病的傳染源。種公豬和慢性感染豬在傳播本病中起著十分重要的作用。APP主要通過空氣飛沫傳播，在感染豬的鼻汁、扁桃體、支氣管和肺臟等部位是病原菌存在的主要場(chǎng)所，病菌隨呼吸、咳嗽、噴嚏等途徑排出后形成飛沫，通過直接接觸而經(jīng)呼吸道傳播。本病的發(fā)生具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生于4～5月和9～11月。飼養(yǎng)環(huán)境突然改變、豬群的轉(zhuǎn)移或混群、擁擠或長(zhǎng)途運(yùn)輸、通風(fēng)不良、濕度過高、氣溫驟變等應(yīng)激因素，均可引起本病發(fā)生或加速疾病傳播，使發(fā)病率和死亡率增加。

四、準(zhǔn)確診斷

總之，血清型的多變性和存在性對(duì)準(zhǔn)確診斷和多血清型重點(diǎn)預(yù)防措施有著巨大的要求。除了與血清型特異性脂多糖決定因素有關(guān)的毒力因子外，還有3種Apx毒素與胸膜肺炎的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

毒素是許多病原性細(xì)菌的毒力因子之一，對(duì)大部分病原性細(xì)菌也是如此。通過對(duì)毒素的特征和作用機(jī)制的研究，給診斷、治療、預(yù)防和控制細(xì)菌性傳染病提供了重要的理論基礎(chǔ)。研究人員通過基因克隆、序列分析、定點(diǎn)突變等技術(shù)的能夠構(gòu)建大量的雜合毒素并得到原始毒素和重組毒素。毒素的研究又出現(xiàn)了氣分子遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)工程等新方法。在前人研究的基礎(chǔ)上，研究人員己經(jīng)不僅能夠推測(cè)毒素的初級(jí)結(jié)構(gòu)，而且對(duì)其細(xì)胞、亞細(xì)胞及分子水平的作用機(jī)制有了更深的了解，另外，對(duì)毒素結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其在致病過程中作為毒力因子的作用方式以及具體作用也有了更明確的認(rèn)識(shí)。ApX毒素作為APP的毒力因子在致病性方面的作用己經(jīng)得到證實(shí)。

Apx毒素屬于RTX毒素之一，具有溶血活性和細(xì)胞毒性作用。它不僅可以溶解紅細(xì)胞，更重要的是它具有調(diào)節(jié)白細(xì)胞活性的功能。這一點(diǎn)對(duì)它的致病性尤為重要。其中APXI和ApX2的活性屬于溶血素，而ApX屬于白細(xì)胞毒素。 APX毒素通常由不同的血清型以不同的組合而產(chǎn)生。因此，對(duì)ApxI、ApxII和ApxIII的主動(dòng)免疫提供了獨(dú)立于感染所涉及的血清型的保護(hù)。

五、APP類毒素疫苗研究

免疫接種是預(yù)防和控制該病的主要措施，目前我國(guó)用于預(yù)防APP的主要疫苗是滅活疫苗。這種滅活疫苗對(duì)于同種血清型的感染可降低死亡率，但不能降低發(fā)病率和慢性感染，不能阻止肺部病變，更不能對(duì)異型菌提供交叉保護(hù)。由于慢性感染影響豬的生長(zhǎng)速度，降低飼料報(bào)酬，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。臨床上迫切需要更加安全、有效的疫苗來預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行。通過對(duì)胸膜肺炎放線桿菌毒力因子的研究，證實(shí)分泌毒素為其最重要的毒力因子，同時(shí)也是其最重要的免疫原性因子，加有類毒素的滅活疫苗保護(hù)力大為提高。

目前APP的疫苗一般是采用肌肉注射的方法進(jìn)行免疫。注射免疫操作困難，而且肌注普通的細(xì)菌滅活苗往往對(duì)注射部位造成損傷，易引起豬群緊張，及伴隨的炎癥反應(yīng)、肌體發(fā)熱等副作用，特別對(duì)初生仔豬往往造成很大傷害。與其他呼吸道病原菌一樣，胸膜肺炎放線桿菌也是通過黏膜表面進(jìn)入宿主。研究發(fā)現(xiàn)，用口服疫苗劑量就能夠誘導(dǎo)很高的免疫反應(yīng)，當(dāng)?shù)?次免疫時(shí)加大10倍的劑量，動(dòng)物能夠克服免疫耐受，維持很高的系統(tǒng)免疫。人們期望開發(fā)一種能誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)的疫苗，同時(shí)盡可能地解決上述問題，于是開始嘗試開發(fā)豬胸膜肺炎的口服疫苗作為一種新的防治手段。

六、COGLAPIX疫苗的強(qiáng)免疫反應(yīng)

COGLAPIX是一種以細(xì)菌類毒素為基礎(chǔ)的疫苗，它對(duì)所有的血清型都有很強(qiáng)的保護(hù)作用。面對(duì)現(xiàn)存血清型的可變性，只有類毒素疫苗可以為其提供保障。COGLAPIX疫苗既可以保障安全，又可以保障功效。

將提取的三種毒素乳化后分別免疫小兔，共免疫三次，間隔時(shí)間為兩周，對(duì)照組用PBS乳化后同時(shí)進(jìn)行免疫。每免疫兩周后斷尾采血并分離血清，將血清做十倍稀釋后再作倍比稀釋。

結(jié)果表明，Coglapix對(duì)Apx類毒素有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。免疫后兩周，在兔血清中接種有顯著抗Apx的抗體。根據(jù)特異性單克隆抗體，采用3種室內(nèi)Apx特異性競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法對(duì)誘導(dǎo)抗體滴度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

已在許多實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，Coglapix所誘導(dǎo)的高度的臨床保護(hù)作用，與血清型特異性無關(guān)，這項(xiàng)研究將在24周內(nèi)使用疫苗以抵御APP血清型1、2和7的挑戰(zhàn)。與未接種疫苗對(duì)照組相比，Coglapix疫苗接種豬肺病變的發(fā)生率和范圍明顯降低(表3和表4)

在飼養(yǎng)豬群的農(nóng)場(chǎng)，這種持久的免疫力也提供了有效的預(yù)防措施。與其他疫苗的比較試驗(yàn)顯示，Coglapix在預(yù)防APP方面的效果更好(圖2)。類毒素菌苗組具有較高的毒素抗體和間接血凝抗體，類毒素菌苗組攻毒后基本沒有表現(xiàn)出臨床癥狀，剖檢肺部病變輕微；空白對(duì)照組臨床癥狀明顯，剖檢呈現(xiàn)典型的胸膜肺炎病變?？贵w檢測(cè)和攻毒結(jié)果顯示類毒素菌苗對(duì)于強(qiáng)毒APP的感染保護(hù)效果能顯著降低臨床發(fā)病，減輕肺部病變，可以取代細(xì)菌滅活苗用于胸膜肺炎的免疫預(yù)防。攻毒結(jié)果還顯示毒素抗體和保護(hù)力呈正相關(guān)。

表3 肺部病變發(fā)生率(%)

表4 肺損害評(píng)分

圖2 肺損害評(píng)分

七、結(jié)語

豬場(chǎng)有多種血清型存在，而且在某一特定農(nóng)場(chǎng)出現(xiàn)一種不同血清型的新毒株的風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)存在，因此需要對(duì)所有血清型進(jìn)行廣泛的保護(hù)。類毒素疫苗比滅活疫苗具有更高的免疫活性，甚至對(duì)與疫苗同源的血清型也是如此。

Coglapix對(duì)各種血清型的AP菌株具有持久的保護(hù)作用，并能在不同的條件下預(yù)防豬胸膜肺炎。