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    干擾BAG-1表達對黑素瘤B16F10細胞放射敏感性的影響

    2018-12-17 10:45:38金德蕙王占想宋亞麗
    中國麻風皮膚病雜志 2018年12期
    關(guān)鍵詞:放射線黑素瘤細胞株

    金德蕙 王占想 宋亞麗

    惡性黑素瘤(malignant melanoma)是一種高度惡性的黑素細胞腫瘤,早期手術(shù)徹底切除后預后尚可,一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,對放療、化療均不敏感,5年生存率不超過14%。因此探討如何提高黑素瘤對放療、化療的敏感性,成為黑素瘤研究的熱點之一。

    Bcl-2-associated athanogene 1(BAG-1)基因位于染色體9p12,其編碼蛋白BAG-1蛋白通過與多種靶分子結(jié)合,參與調(diào)節(jié)細胞生物學的多個環(huán)節(jié)。BAG-1蛋白主要通過其C末端與熱休克蛋白(HSP)70的肽結(jié)合區(qū)結(jié)合,促進細胞增殖;還可通過激活Raf-1信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖;在細胞表面,BAG-1與酪氨酸激酶受體如干細胞生長因子HGF/血小板衍生生長因子PDGF受體結(jié)合能增強細胞對生長因子誘導的凋亡;在細胞漿內(nèi),可與Bcl-2結(jié)合以調(diào)節(jié)細胞凋亡;在細胞核內(nèi),可與多個核激素受體如維生素D3受體、維A酸受體結(jié)合而調(diào)節(jié)相應核激素的表達與活性[1-3]。

    臨床研究發(fā)現(xiàn)BAG-1蛋白在正常組織幾乎不表達或低水平表達,而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高度表達。腫瘤細胞BAG-1基因表達上調(diào)可增強腫瘤細胞的抵抗轉(zhuǎn)移能力,增加對凋亡刺激及化療的耐藥性;而下調(diào)其表達則增加腫瘤細胞對凋亡刺激、化療的敏感性[1,2]。

    一般認為黑素瘤對放療不敏感,但在某些特殊情況下放療仍是一項重要的治療手段。目前尚未見有關(guān)BAG-1對黑素瘤放射治療反應影響的相關(guān)文獻報道。本研究通過體外實驗探討RNA干擾黑素瘤B16F10細胞BAG-1基因表達對放射線X線的敏感性的影響,并進行細胞凋亡率檢測及相關(guān)機制探討。

    1 材料和方法

    1.1 細胞培養(yǎng)及試劑 黑素瘤B16F10、M14細胞株購自南京凱基公司, RMPI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品,LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司; 兔抗鼠BAG-1多克隆抗體 為Santa Cruz公司產(chǎn)品,兔抗鼠Caspase3、8、9、PARP一抗及聚合HRP標記羊抗兔IgG二抗(貨號BA1056)購自武漢博士德公司。

    1.2 構(gòu)建干擾質(zhì)粒pGCsi-BAG-1并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染黑色素瘤細胞,檢測轉(zhuǎn)染效率 構(gòu)建干擾質(zhì)粒pGCsi-BAG-1[4]。脂質(zhì)體Lipo2000轉(zhuǎn)染人黑素瘤細胞M14及鼠黑素瘤細胞B16F10,陰性對照組(NC-shRNA)黑素瘤細胞轉(zhuǎn)染插入無關(guān)序列的干擾載體。具體操作如下:轉(zhuǎn)染前一天,將人黑素瘤細胞M14及鼠黑素瘤細胞B16F10接種到6孔培養(yǎng)板上,接種密度(3~4)×105/mL。轉(zhuǎn)染時,細胞要達到90%~95%的融合。溶液1:按照無血清RMPI 1640培養(yǎng)基與lipofectamine 2000按照每孔240 μL∶10 μL比例混合,溫育5 min。溶液2:無血清RMPI 1640培養(yǎng)基與質(zhì)粒按照每孔240 μL∶4 μg比例混合。將溶液1與溶液2混合,室溫下置20 min。6孔培養(yǎng)板中的細胞用無血清RMPI 1640培養(yǎng)基沖洗兩遍,加入2 mL無血清培養(yǎng)基。將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中,搖動培養(yǎng)板,輕輕混勻,37℃、5% CO2中保溫5~6 h后更換含有血清的全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,G418(600 μg/mL)篩選,獲得BAG-1表達沉默的B16F10細胞株,G418篩選后存活細胞擴增用于后續(xù)實驗,提取其RNA及蛋白,RT-PCR檢測BAG-1 mRNA變化,Western blot檢測BAG-1蛋白變化。

    1.3 細胞放射敏感性試驗

    1.3.1 克隆形成實驗檢測細胞放射敏感性 人胚腎上皮細胞HEK293的基因表達類似于神經(jīng)系統(tǒng)細胞,對電離輻射較敏感,是輻射機制基礎研究的常用細胞株。本實驗以HEK293細胞作為對照,研究M14、B16F10細胞對X射線照射的敏感性。將HEK293、M14、B16F10細胞置于含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基、5% CO2孵箱37℃孵育,2~3 d傳代1次。取指數(shù)生長期細胞株,用胰酶消化后制成單細胞懸液,培養(yǎng)24 h后美國Varian Trilogy醫(yī)用直線加速器照射。根據(jù)不同的X射線照射劑量將細胞接種于直徑為100 mm培養(yǎng)皿中,照射X射線0、1、2、4、6、8 Gy的每皿1000個細胞,6、8 Gy的每皿2000個細胞,每組設三個平行皿。照射24 h后細胞繼續(xù)培養(yǎng)14 d,至有克隆形成;倒去上清培養(yǎng)液,用PBS洗滌2次,加入75%甲醇固定液,鋪滿培養(yǎng)皿底面,固定5 min。棄去固定液,待稍干燥后加入0.5%結(jié)晶紫(甲醇配制)染色5 min,顯微鏡(低倍鏡)下檢查染色程度,當克隆著色足夠時用水洗去殘余染液,以每團細胞數(shù)>50個作為一個克隆計數(shù),計算克隆形成率(克隆形成率=生成克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%) 和存活分數(shù)(SF=受照射細胞的克隆形成率/對照細胞克隆形成率×100%)。描繪出的細胞存活曲線。

    1.3.2 BAG-1基因沉默后黑素瘤細胞對放射線的敏感性 將未轉(zhuǎn)染的B16F10細胞(Control組)、陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞(NC-shRNA組) 和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA的細胞(BAG-1-shRNA組)暴露于0、1、2、4、6、8Gy的 X 射線,于照射后24 h進行克隆形成實驗,比較細胞放射敏感性差異。

    1.3.3 細胞凋亡檢測 流式細胞儀檢測細胞凋亡:將Control組、NC-shRNA組和BAG-1-shRNA組細胞濃度調(diào)整為5×106/mL,培養(yǎng)24 h后收集細胞。參照Annexin V/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒操作說明,流式細胞儀分析。在Annexin V高染而PI低染區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞。

    Western blotting檢測BAG-1沉默對黑素瘤細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、8、9、PARP表達的影響:提取Control組、NC-shRNA組和BAG-1-shRNA組細胞蛋白,SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后按半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜(NC膜),5%的脫脂奶粉中封閉2 h, 1∶1000稀釋一抗孵育,室溫下于搖床孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min,加入1∶5000稀釋的二抗,室溫下,搖床孵育45~60 min,TBST洗膜3次,每次10 min,用LI-COR掃膜儀掃膜,紅外激光成像系統(tǒng)對待測蛋白進行分析。

    2 結(jié)果

    2.1 檢測干擾BAG-1表達效率 如圖1所示,與Control組相比,BAG-1-shRNA組BAG-1 mRNA和蛋白表達明顯降低,分別下降了68%、71%(P<0.05)。為驗證質(zhì)粒的干擾效率,同時檢測了黑素瘤M14細胞轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA后BAG-1mRNA表達,顯示下降程度為70%,干擾效率類似于B16F10細胞。

    2.2 黑素瘤細胞放射敏感性體外試驗

    2.2.1 黑素瘤細胞放射敏感性檢測 見圖2。細胞存活曲線顯示人胚腎HEK293細胞對放射線較敏感,X線 8Gy劑量照射時存活率接近0,而黑素瘤細胞M14細胞和B16F10細胞的存活率分別為1.5%和1.9%(P<0.05)。

    2.2.2 BAG-1基因沉默后黑素瘤細胞對放射線的敏感性 見圖3。BAG-1-shRNA組對X放射線敏感性增高,8 Gy照射存活率為0.32%,相比Control組1.9%,NC-shRNA組1.75%,存活率顯著降低(P<0.05)。

    2.3 黑素瘤B16F10細胞凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響

    2.3.1 細胞凋亡率測定 見圖4。Control黑素瘤B16F10細胞組在X線照射后凋亡率由2.5%升高至7.1%,在轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA聯(lián)合X線照射后,BAG-1-shRNA組的凋亡率達到25.3%, NC-shRNA組9.2%,差異顯著(P<0.05)。

    2.3.2 細胞凋亡相關(guān)蛋白檢測 見圖5。黑素瘤B16F10細胞BAG-1-shRNA組的pro-PARP、pro-Caspase 3等酶原蛋白較Control組和NC-shRNA組明顯下降(P<0.05),凋亡蛋白c-PARP及細胞凋亡級聯(lián)蛋白c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9表達均較Control組和NC-shRNA組顯著增高(P<0.05),尤其以c-PARP、c-Caspase 3的改變更為顯著。結(jié)果證實Caspase酶解級聯(lián)反應參與了BAG-1誘導的細胞凋亡調(diào)節(jié)過程。

    圖1 a:黑素瘤B16F10細胞轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組BAG-1mRNA表達下降了68%,M14細胞轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組BAG-1mRNA表達下降了70%;b、c:B16F10細胞轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組BAG-1蛋白表達下降了71%

    圖2 不同X線照射劑量,人胚腎HEK293細胞和黑素瘤M14細胞、B16F10細胞的存活曲線圖3 不同X線照射劑量,黑素瘤B16F10細胞Control組、轉(zhuǎn)染NC-shRNA組、轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組的細胞存活曲線圖4 流式細胞儀檢測黑素瘤B16F10細胞Control組、轉(zhuǎn)染NC-shRNA組、轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組X線照射前、后的細胞凋亡率

    圖5 Western blot法檢測黑素瘤B16F10細胞Control組、轉(zhuǎn)染NC-shRNA組、轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組細胞凋亡蛋白c-PARP、c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9及其酶原pro-PARP、pro-Caspase 3的表達

    3 討論

    BAG-1蛋白是一種多功能蛋白,具有多種調(diào)節(jié)功能:(1)抑制細胞凋亡和應激反應;(2)調(diào)節(jié)細胞信號傳導;(3)影響轉(zhuǎn)錄活性;(4)參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯后修飾-重組/降解,影響細胞黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移。干擾BAG-1表達可能通過抑制黑素瘤細胞增殖、促進黑素瘤細胞凋亡從而影響黑素瘤生物學行為及治療反應[3]。Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級聯(lián)反應是細胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié),BAG-1的過度表達能夠抑制Caspase的激活,從而能抑制諸如化學制劑、放射等誘導的凋亡[5]。因此,干擾BAG-1表達有可能通過促進黑素瘤細胞凋亡而發(fā)揮治療輔助效應。

    黑素瘤本質(zhì)上抵抗放療這一觀點最初源于細胞培養(yǎng)研究。臨床上,黑素瘤的輔助放療主要用于淋巴結(jié)清掃和某些頭頸部黑素瘤(尤其是鼻腔)的術(shù)后補充治療,可進一步提高局部控制率[6,7]。放射增敏是指為增強射線對腫瘤細胞的殺傷效應,提高腫瘤的控制率和治愈率,應用一些藥物或物理等方法來提高腫瘤細胞對射線的敏感性的過程[8]。

    本研究顯示X放射線8 Gy劑量照射黑素瘤細胞M14細胞株和B16F10細胞株,其存活率分別為1.5%和1.9%,提示黑素瘤細胞對X放射線相對較抗拒。在RNA干擾BAG-1基因表達后,8 Gy劑量X線照射黑素瘤B16-F10細胞存活率為0.32%,提示RNA干擾BAG-1基因表達可顯著增高黑素瘤細胞對X放射線的敏感性,即具有放射增敏功能。

    流式細胞儀檢測顯示黑素瘤B16F10細胞在X線照射后凋亡率為7.1%, 在干擾BAG-1基因表達聯(lián)合X線照射后其凋亡率則高達25.3%,差異顯著。進一步研究發(fā)現(xiàn)RNA 干擾BAG-1基因表達可顯著增高黑素瘤B16F10細胞c-PARP、c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9等細胞凋亡相關(guān)蛋白的水平,提示促進細胞凋亡可能是干擾BAG-1基因表達所致放射增敏功能的機制之一。干擾黑素瘤細胞BAG-1表達促進細胞凋亡的具體機制有待進一步研究證實。

    本研究提示干擾黑素瘤細胞RNA基因表達可能通過促進細胞凋亡發(fā)揮放射增敏功能,研究為臨床黑素瘤治療提供新的治療靶位和治療思路。

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