IL—10啟動(dòng)子區(qū)—1082基因多態(tài)性與膿毒血癥易感性的關(guān)系研究

王蕾　謝月群　陳玲瓏　陳新國(guó)　張和

[摘要] 目的 分析膿毒血癥患者IL-10的啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游第1082位點(diǎn)的多態(tài)性，探討其與膿毒血癥易感性之間的關(guān)系。 方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段多態(tài)性（PCR-RELP）檢測(cè)IL-10基因-1082位點(diǎn)多態(tài)性，SPSS17.0分析各位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率。 結(jié)果 IL-10-1082位點(diǎn)的多態(tài)性在膿毒血癥組（AA：58.16%、GA：39.80%、GG：2.04%）與對(duì)照組（AA：73.75%、GA：26.25%）的基因頻率有顯著性差異（P<0.05）。膿毒血癥組中GA基因型的頻率顯著高于對(duì)照組（P=0.038），膿毒血癥組中G等位基因的頻率顯著高于對(duì)照組（P=0.015）。結(jié)論 IL-10-1082 GA基因型攜帶者比AA基因型患者的膿毒血癥風(fēng)險(xiǎn)性高，IL-10-1082的G等位基因比A等位基因患膿毒血癥的風(fēng)險(xiǎn)性高。

[關(guān)鍵詞] 膿毒血癥；疾病遺傳易感性；白細(xì)胞介素10；多態(tài)性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R459.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）24-0001-03

Study on the relationship between locus 1082 gene polymorphism in IL-10 promoter region and susceptibility to sepsis

WANG Lei1 XIE Yuequn1 CHEN Linglong1 CHEN Xinguo1 ZHANG He2

1.Department of Emergency， Wenzhou Peoples Hospital in Zhejiang， Wenzhou 325000， China； 2.Department of Radiotherapy， Wenzhou Central Hospital in Zhejiang， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To analyze the polymorphism at locus 1082 in the upstream of the transcriptional start site in the promoter region of IL-10 in sepsis patients， and to explore its relationship with susceptibility to sepsis. Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment polymorphism（PCR-RELP） was used to detect the IL-10-1082 polymorphism. SPSS 17.0 was used to analyze the genotypic distribution and allele frequencies at each locus. Results The gene frequency of polymorphism of IL-10-1082 in the sepsis group（AA： 58.16%， GA： 39.80%， GG： 2.04%） and the control group（AA： 73.75%， GA： 26.25%） had significant differences（P<0.05）. The frequency of GA genotypes in the sepsis group was significantly higher than that in the control group（P=0.038）. The frequency of G allele in the sepsis group was significantly higher than that in the control group（P=0.015）. Conclusion IL-10 -1082 GA genotype carriers have a higher risk of sepsis than those with AA genotypes. The G-10 allele of IL-10-1082 has a higher risk of sepsis than the A allele.

[Key words] Sepsis； Disease genetic predisposition； IL-10； Polymorphism

膿毒血癥是當(dāng)今危重癥醫(yī)學(xué)的研究焦點(diǎn)和棘手問(wèn)題。在全世界，膿毒血癥每年的病死率高達(dá)36800例，其死亡率與心肌梗死相近，已成為老年人十大死因之一[1]。近年來(lái)眾多研究者正在研究膿毒血癥的易感因素。膿毒血癥是一種常見(jiàn)危重癥患者較為嚴(yán)重的感染性、多器官損傷疾病，多種炎癥介質(zhì)參與其發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，期間分泌大量炎癥細(xì)胞因子[2]。IL-10基因定位于1號(hào)染色體q31-32區(qū)域[3]，-1082 G/A（rs18 00896）為其基因多態(tài)性之一。有研究顯示白細(xì)胞介素10（Interleukin-10，IL-10）啟動(dòng)子區(qū)的基因多態(tài)性能夠影響IL-10的啟動(dòng)子活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)IL-10的表達(dá)[4-6]。IL-10是重要的抗炎癥的細(xì)胞因子，IL-10通過(guò)Th1細(xì)胞機(jī)制調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，拮抗促炎癥細(xì)胞因子如TNF-α，從而促進(jìn)膿毒血癥的發(fā)生[7]。此外，IL-10在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、病毒性心肌炎的發(fā)生與發(fā)展中也扮演著重要的角色，其通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)疾病的發(fā)生與發(fā)展[8]。研究顯示，與IL-18及腫瘤壞死因子-α相比，IL-10對(duì)老年膿毒血癥患者的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值更佳[8]。然而IL-10-1082的基因多態(tài)性對(duì)膿毒血癥發(fā)生的易感性至今還不明確，本文采用 PCR 限制性酶切多態(tài)性（PCR-RFLP）的方法研究 IL-10 的基因啟動(dòng)子區(qū)-1082位點(diǎn)的多態(tài)性與膿毒血癥發(fā)生的關(guān)系，旨在探討其對(duì)膿毒血癥易感性的影響，為膿毒血癥的預(yù)防研究提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究收集2016年1月～2017 年9月于我院住院并確診的膿毒血癥患者98例，診斷依據(jù)“2001年危重病醫(yī)學(xué)會(huì)/歐洲危重病醫(yī)學(xué)會(huì)/美國(guó)胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)/外科感染學(xué)會(huì)關(guān)于全身性感染的定義會(huì)議”診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。健康對(duì)照組選自2017年1～9月在溫州市人民醫(yī)院體檢健康的80名志愿者，最大年齡90歲，最小年齡37歲，中位年齡61 歲。膿毒血癥組最大年齡86歲，最小年齡27歲，中位年齡65歲。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板的制備 取所有受試者靜脈血3 mL，EDTA抗凝，用改良碘化鈉法提取白細(xì)胞DNA，保存在-20°C條件下。

1.2.2 IL-10多態(tài)性分析 采用鏈合酶聯(lián)反應(yīng)-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chainreaction with restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)，檢測(cè)IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-1082位點(diǎn)的基因型。根據(jù)參考文獻(xiàn)并應(yīng)用Primer Premier 5.0來(lái)設(shè)計(jì)引物。IL-10-1082位點(diǎn)的引物序列，正向鏈： 5‘-GACAACACTACTAAGGCTCCTTTGGGA-3 反向鏈： 5‘-GTGAGCAAACTGAGGCACAGA AAT-3[10]。擴(kuò)增條件為55℃ 45 s，72℃ 60 s，94℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。PCR 的反應(yīng)體系為50 μL，包括以下組分：DNA聚合酶1.25 U，上下游引物各1.0 μL，10×buffer 5.0 μL，MgCl2 3.0 μL，dNTPs 3.0 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至50 μL，模板50 ng，則進(jìn)行下一步酶切實(shí)驗(yàn)。取PCR產(chǎn)物10 μL，加Bsl Ⅰ 10 U，10×NEBuffer3 3.0 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至30 μL，水浴55℃ 2 h，酶切后于3%的瓊脂糖凝膠上電泳，鑒定結(jié)果。

1.2.3 IL-10 -1082位點(diǎn)PCR擴(kuò)增及酶切分析 IL-10-1082位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)BslⅠ酶切電泳后產(chǎn)生278 bp及37 bp 2 個(gè)片段為 AA型，產(chǎn)生278 bp、253 bp、37 bp、25 bp 4個(gè)片段為GA型，253 bp、37 bp、25 bp 3個(gè)片段為GG型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各組IL-10-1082位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較，其分布符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)人群具有群體代表性，該人群的IL-10基因分布可反映整體人群基因的分布情況。計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算比數(shù)比（OR），進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本基本情況

膿毒血癥組與對(duì)照組在性別、年齡及吸煙情況比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 IL-10-1082各基因型分布與膿毒血癥相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析

IL-10-1082的基因分型和等位基因頻率與膿毒血癥易感性的關(guān)系中，膿毒血癥組IL-10-1082位點(diǎn)GA基因型分布頻率顯著高于對(duì)照組（OR=2.018，95%CI：1.053～3.868，P=0.038），對(duì)照組中未檢測(cè)到 IL-10-1082GG基因型，等位基因分析結(jié)果顯示膿毒血癥組G等位基因分布頻率顯著高于對(duì)照組（OR=2.014，95%CI：1.168～3.473，P=0.015）。見(jiàn)表2。

3 討論

IL-10是公認(rèn)的炎癥抑制因子，主要是由Th2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等分泌，它的主要功能是抑制Th1細(xì)胞，是調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的重要的抗炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子TNF-α及一氧化氮的合成，炎癥細(xì)胞的凋亡和巨噬細(xì)胞活化的抑制等[11-12]。在人類(lèi)中，血循環(huán)中IL-10水平升高與膿毒血癥性休克、損傷的嚴(yán)重性以及死亡率相關(guān)。人類(lèi)IL-10基因包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，位于1號(hào)染色體q31-32區(qū)域，IL-10的表達(dá)可受轉(zhuǎn)錄水平[13-14]和轉(zhuǎn)錄后水平[15-16]的調(diào)節(jié)，研究表明，IL-10主要是受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，且IL-10分泌很大程度上受到遺傳因素的影響[17]，其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5 kb的區(qū)域內(nèi)，至少有23個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，其中研究最多的是啟動(dòng)子上游第1082位點(diǎn)（G/A）SNP[18]。IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)特定的SNP可正向或負(fù)向影響IL-10的分泌水平[18-19]，從而影響對(duì)某種特定疾病的易感性。研究表明IL-10基因多態(tài)性可能影響腫瘤的易感性與IL-10-1082基因位點(diǎn)等位基因G有關(guān)，如子宮頸癌、肺癌等，其影響機(jī)制可能與下調(diào)IL-1B、TNF-α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的活性有關(guān)[20]。在IL-10基因中，-1082位置處的G單核苷酸啟動(dòng)子多態(tài)性在IL-10的調(diào)節(jié)中是重要的。對(duì)于G等位基因純合的個(gè)體（-1082 GG）在體外刺激后具有更高的循環(huán)IL-10，更高的IL-10 mRNA表達(dá)和更高的IL-10產(chǎn)生[21]。

本文研究結(jié)果顯示兩組患者IL-10-1082位點(diǎn)基因型分布頻率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.038），膿毒血癥組IL-10-1082 GA 基因型頻率高于對(duì)照組，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)為2.018（1.053～3.868）；等位基因分析結(jié)果顯示膿毒血癥組G等位基因分布頻率高于對(duì)照組，有顯著性差異（P=0.015），相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)為2.014（1.168～3.473），提示-1082 位點(diǎn)G等位基因與膿毒血癥的發(fā)生有相關(guān)性。體內(nèi)外的研究表明 IL-10-1082 A等位基因的 IL-10 表達(dá)較低[18，22，23]，而 IL-10-1082 G等位基因的IL-10表達(dá)較高[18]，這表明-1082位點(diǎn)多態(tài)性影響IL-10的表達(dá)水平，IL-10作為一種抑制炎癥因子，是其促進(jìn)膿毒血癥的發(fā)生，是-1082位點(diǎn)與膿毒血癥易感性相關(guān)的遺傳學(xué)依據(jù)，本研究結(jié)果也與之相一致。但有關(guān)IL-10-1082基因多態(tài)性與膿毒血癥發(fā)生的相關(guān)報(bào)告較少，其關(guān)系尚不明確，仍有待進(jìn)一步的深入研究來(lái)闡明。

本研究分析IL-10 基因啟動(dòng)子-1082位點(diǎn)基因多態(tài)性，結(jié)果顯示：IL-10-1082 GA基因型攜帶者比AA基因型患者的膿毒血癥風(fēng)險(xiǎn)性高，IL-10-1082的G等位基因比A等位基因患膿毒血癥的風(fēng)險(xiǎn)性高。此研究結(jié)果與之前體內(nèi)外研究數(shù)據(jù)相一致，為膿毒血癥的病因?qū)W和遺傳學(xué)研究提供了有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，提示IL-10可作為防治膿毒血癥的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Griffiths B，Anderson ID. Sepsis，Sirs and Mods[J]. Surgery（Oxford），2009，27（10）：446-449.

[2] 龍濤，李智，白蓉蓉，等. 外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)對(duì)膿毒血癥患者的預(yù)后分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015，（14）：3125-3126.

[3] Eskdale J，Kube D，Tesch H，et al. Mapping of the human IL10 gene and further characterization，of the 5 flanking sequence[J]. Immunogenetics，1997，46（2）：120.

[4] Edwards-Smith CJ，Jonsson JR，Purdie DM，et al. Interleukin-10 promoter polymorphism predicts initial response of chronic hepatitis C to interferon alfa[J]. Hepatology，1999，30（2）：526-530.

[5] Lazarus M，Hajeer AH，Turner D，et al. Genetic variation in the interleukin 10 gene promoter and systemic lupus erythematosus[J]. Journal of Rheumatology，1997，24（12）：2314-2317.

[6] Crawley E，Kay R，Sillibourne J，et al. Polymorphic haplotypes of the interleukin-10 5' flanking region determine variable interleukin-10 transcription and are associated with particular phenotypes of juvenile rheumatoid arthritis[J]. Arthritis & Rheumatology，1999，42（6）：1101-1108.

[7] Couper KN，Blount DG，Riley EM. IL-10：the master regulator of immunity to infection[J]. Journal of Immunology，2008，180（9）：5771-5777.

[8] 覃紅梅，甘枚，劉柯. 血清白細(xì)胞介素-18、-10與腫瘤壞死因子-α在老年膿毒血癥患者預(yù)后中的預(yù)測(cè)價(jià)值[J].中國(guó)老年學(xué)，2016，36（12）：2993-2994.

[9] Levy MM，F(xiàn)ink MP，Marshall JC，et al. 2001 sccm/esicm/accp/ats/sis international sepsis definitions conference[J]. Intensive Care Medicine，2003，29（4）：530-538.

[10] Mohebbatikaljahi H，Menevse S，Yetkin I，et al. Study of interleukin-10 promoter region polymorphisms（-1082A/G，-819T/C and-592A/C）in type 1 diabetes mellitus in Turkish population[J]. Journal of Genetics，2009，88（2）：245-248.

[11] Chen YX，Man K，Ling GS，et al. A crucial role for dendritic cell（DC） IL-10 in inhibiting successful DC-based immunotherapy：superior antitumor immunity against hepatocellular carcinoma evoked by DC devoid of IL-10[J]. Journal of Immunology，2007，179（9）：6009-6015.

[12] Oberholzer A，Oberholzer C，Moldawer LL. Interleukin-10：A complex role in the pathogenesis of sepsis syndromes and its potential as an anti-inflammatory drug[J]. Critical Care Medicine，2002，30（1）：S58-S63.

[13] Brightbill HD，Plevy SE，Modlin RL，et al. A prominent role for Sp1 during lipopolysaccharide-mediated induction of the IL-10 promoter in macrophages[J]. The Journal of Immunology，2000，164（4）：1940-1951.

[14] Lobo-Silva D，Carriche GM，Castro AG，et al. Balancing the immune response in the brain： IL-10 and its regulation[J]. Journal of neuroinflammation，2016，13（1）：297.

[15] Govender U，Corre B，Bourdache Y，et al. Type I interferon-enhanced IL-10 expression in human CD4 T cells is regulated by STAT3，STAT2，and BATF transcription factors[J]. Journal of Leukocyte Biology，2017，101（5）：1181-1190.

[16] Takuse Y，Watanabe M，Inoue N，et al. Association of IL-10-regulating MicroRNAs in peripheral blood mononuclear cells with the pathogenesis of autoimmune thyroid disease[J]. Immunological Investigations，2017，46（6）：590-602.

[17] Rosenwasser LJ.Genetics of atopy and asthma. The rationale behind promoter-based candidate gene studies[J]. American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine， 1997，156（4 Pt 2）：S152-S155.

[18] Turner DM，Williams DM，Sankaran D，et al. An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter[J]. International Journal of Immunogenetics，1997， 24（1）：1-8.

[19] Eskdale J，Gallagher G，Verweij CL，et al. Interleukin 10 secretion in relation to human IL-10 locus haplotypes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（16）：9465-9470.

[20] 張曉杰，王瑩. 兒童潰瘍性結(jié)腸炎血清IL-1、IL-6、IL-10及TNF-α水平變化[J]. 中國(guó)婦幼保健，2015，30（20）：3413-3415.

[21] Gallagher PM，Lowe G，F(xiàn)itzgerald T，et al. Association of IL-10 polymorphism with severity of illness in community acquired pneumonia[J]. Thorax，2003，58（2）：154-156.

[22] Rad R，Dossumbekova A，Neu B，et al. Cytokine gene polymorphisms influence mucosal cytokine expression，gastric inflammation，and host specific colonisation during Helicobacter pylori infection[J]. Gut，2004，53（8）：1082-1089.

[23] Craven NM，Jackson CW，Kirby B，et al. Cytokine gene polymorphisms in psoriasis[J]. British Journal of Dermatology，2001，144（4）：849-853.

（收稿日期：2017-11-24）