TLR4信號通路在重癥急性胰腺炎大鼠中介導(dǎo)腸黏膜炎癥反應(yīng)機(jī)制的研究

張婷婷　曾軍　蘇偉　陳偉明

【摘要】 目的：研究TLR4信號通路在重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）大鼠中介導(dǎo)腸黏膜炎癥反應(yīng)機(jī)制。方法：將20只SD大鼠隨機(jī)分成SAP組和對照組，每組10只。SAP組采用4.5%牛磺膽酸鈉逆行注射胰膽管建模（1 mL/kg），對照組則采用0.9%氯化鈉溶液注射。比較兩組大鼠小腸的NF-κB活性、TLR4蛋白和mRNA水平，血清TNF-a、IL-6、IL-10水平，以及胰腺、小腸組織病理評分。結(jié)果：SAP組大鼠的胰腺、小腸組織病理評分、血清炎癥因子（TNF-a、IL-6、IL-10）水平、小腸NF-κB活性、TLR4蛋白和mRNA水平均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

結(jié)論：TLR4信號通路在SAP的發(fā)展起到了重要的作用，作為炎癥反應(yīng)的“閘門”，可通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控炎性介質(zhì)的釋放和引起SAP各器官損傷，可能作為治療SAP并腸黏膜屏障功能障礙的潛在靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 重癥急性胰腺炎； 腸黏膜屏障功能障礙； 炎癥介質(zhì)； TLR4信號通路

Study on the Mechanism of TLR4 Signaling Pathway to Induce Intestinal Mucosa Inflammation in Rats with Severe Acute Pancreatitis/ZHANG Tingting，ZENG Jun，SU Wei，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（26）：0-036

【Abstract】 Objective：To study the mechanism of TLR4 signaling pathway mediated intestinal mucosal inflammation in rats with severe acute pancreatitis（SAP）.Method：Twenty SD rats were randomly divided into SAP group and control group，10 rats in each group.In SAP group，4.5% sodium taurocholate retrograde injection of pancreaticobiliary duct（1 mL/kg） was used，the control group was treated with 0.9% Sodium Chloride Solution.The activity of NF-κB and the levels of TLR4 protein and mRNA in the small intestine，the level of IL-10 in serum TNF-α and IL-6 in the small intestine，and the pathological score of pancreas and small intestine were compared between the two groups.Result：The pathological scores of pancreas and small intestine，the levels of TNF-a，IL-6 and IL-10 in serum，and the NF-κB activity and levels of TLR4 protein and mRNA in small intestine in SAP group were significantly higher than those in the control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：TLR4 signaling pathway plays an important role in the development of SAP，as a “gate” of inflammatory response，it can regulate the release of inflammatory mediators through a series of signal transduction and induce the injury of various organs of SAP，it may be a potential target for the treatment of SAP with intestinal barrier dysfunction.

【Key words】 Severe acute pancreatitis； Intestinal mucosal barrier dysfunction； Inflammatory mediators； TLR4 signaling pathway

First-authors address：Guangzhou NO.1 Peoples Hospital，Guangzhou 510180，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.008

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是臨床常見的消化系統(tǒng)急腹癥，主要由于高三酰甘油血癥、腸道疾病、不規(guī)范飲食等多種因素導(dǎo)致胰腺內(nèi)的胰酶被激活，從而引起胰腺組織水腫、壞死、出血等炎性反應(yīng)，容易繼發(fā)多器官功能不全（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1-3]。該病具有起病急、進(jìn)展迅速、并發(fā)癥多、病死率高等特點(diǎn)[4-5]。腸道屏障功能可防止腸道內(nèi)細(xì)菌、細(xì)菌產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至腸道外進(jìn)入機(jī)體[6]。腸黏膜炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腸道屏障功能受損，通透性增加，細(xì)菌、毒素的體內(nèi)遷移引發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征（systematic inflammation response syndrome，SIRS），從而引起壞死的胰腺組織繼發(fā)感染和MODS。Toll樣受體（Toll-likereceptors，TLRs）中的TLR4可通過介導(dǎo)一系列信號途徑調(diào)控特定基因的表達(dá)，控制原發(fā)性致炎因子（TNF-α、IL-1等）的產(chǎn)生和釋放，從而調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)，可能作為SAP時的SIRS、MODS的一個重要環(huán)節(jié)。因此本文將通過實(shí)驗(yàn)研究TLR4信號通路在SAP大鼠腸黏膜屏障功能障礙發(fā)病中的作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 20只SD大鼠由廣州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供；?；悄懰徕c、PBS、甲醇、二甲苯等均購自Sigma公司；熒光定量PCR儀購自Thermofisher公司；WZ-50c型微量注射泵購自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將20只SD大鼠隨機(jī)分為SAP組和對照組，各10只。兩組SD大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。稱重后于腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.5 mL

/100 g）（生產(chǎn)廠家：上海新亞藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31021725）。動物麻醉后取仰臥位固定于手術(shù)臺上并消毒，于上腹正中切口3 cm左右進(jìn)腹，提取十二指腸并找到膽總管，隨后用4號鈍性針頭對穿膽胰管乳頭對側(cè)十二指腸壁并插入膽胰管約5 mm，用無血管夾夾住針頭。然后觀察組以0.2 mL/min的速度注入5%?；悄懰徕c溶液

（0.1 mL/100 g）（生產(chǎn)廠家：美國Sigma公司，批號：T0750-25），對照組以相同的速度注射相同體積的0.9%氯化鈉溶液（生產(chǎn)廠家：河北天成藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H13022575），注射完成后保留3 min。最后依次松開血管夾，拔出針頭，縫合關(guān)腹。兩組均在造模成功后24 h活殺動物，鼠尾靜脈留取外周血，取胰腺組織送病理檢查，取小腸組織進(jìn)行TLR4 mRNA、TLR4蛋白水平、NF-κB活性檢測以及病理檢查。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 胰腺和小腸組織病理評分 取胰腺組織和小腸組織送病理檢查，采用Grewal法對胰腺、小腸組織的炎癥、水腫、壞死、出血進(jìn)行評分，其中炎癥、水腫、壞死程度劃分為5級，得分為0～4分，出血得分為0分（不出血）或者1分（出血），總分為13分，得分越高說明胰腺組織損傷越嚴(yán)重[7]。

1.3.2 小腸組織TLR4 mRNA 采用rizol法分離溶解小腸組織并提取RNA，經(jīng)過處理后采用熒光定量PCR儀檢測TLR4 mRNA在小腸組織中的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參照，結(jié)果以TLR4 mRNA與β-actin的比值表示。

1.3.3 小腸組織TLR4蛋白水平 常規(guī)方法烤片40 min，經(jīng)過脫蠟處理、封閉、孵育、標(biāo)記、顯色等操作后，最后蘇木精復(fù)染，組織透明，樹膠封片，取正常大鼠小腸組織作為陰性對照。光鏡下隨機(jī)選取5個視野，利用圖像分析系統(tǒng)分析TLR4蛋白與內(nèi)參蛋白灰度比值。

1.3.4 小腸組織NF-κB活性檢測 取小腸組織，經(jīng)過勻漿、離心等操作后取上清，采用Mercury轉(zhuǎn)錄因子ELISA法測定試劑盒測定NF-κB活性，以小腸組織細(xì)胞質(zhì)、核染成棕黃色視為陽性，以400倍視野下陽性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分率為陽性率。

1.3.5 外周血炎癥介質(zhì)水平檢測 取外周血，低速離心后取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA試劑盒）檢測TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況比較 SAP組10只，雌5只，雄5只，體重180～200 g，平均（191.22±3.34）g；對照組10只，雌5只，雄5只，體重180～200 g，平均（190.14±3.16）g。兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組大鼠的胰腺、小腸組織病理評分情況比較 SAP組大鼠采用?；悄懰徕c逆行注射胰膽管建模后24 h的胰腺、小腸組織病理評分均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 兩組大鼠的血清炎癥因子水平比較 兩組大鼠的血清炎癥因子水平存在顯著差別，其中SAP組的TNF-α、IL-6、IL-10水平均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.4 兩組大鼠的小腸組織指標(biāo)檢測結(jié)果比較 SAP組大鼠小腸組織的NF-κB活性、TLR4蛋白和mRNA水平均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3 討論

SAP產(chǎn)生時，腸黏膜細(xì)胞會因缺血、缺氧而引起炎癥介質(zhì)大量釋放入血，從而導(dǎo)致腸道炎癥反應(yīng)和屏障通透性升高，腸道內(nèi)細(xì)菌、毒素大量進(jìn)入體內(nèi)會造成全身性內(nèi)毒素血癥，繼而引發(fā)SIRS、MODS等[8]。其中，NF-κB信號通路是內(nèi)毒素活化的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，當(dāng)大量內(nèi)毒素刺激細(xì)胞時，NF-κB會通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥相關(guān)介質(zhì)及蛋白的表達(dá)[9-10]。而NF-κB調(diào)節(jié)產(chǎn)物的正反饋效應(yīng)又能激活NF-κB，最終加重病情的惡化，從而誘發(fā)肺、胃腸道等組織器官的損傷[11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路在調(diào)控下游炎癥介質(zhì)的同時，又受到TLRs等上游信號分子的調(diào)控[12]。其中，TLR4介導(dǎo)的信號通路通過髓樣化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的依賴性途徑介導(dǎo)NF-κB的活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生[13]。即：TLR4只有通過識別配體（G-菌的脂多糖）后活化NF-κB，引起以TNF-α等為中心的前炎癥因子激活，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[14-15]。因此TLR4信號通路在調(diào)控SAP時的腸黏膜炎癥反應(yīng)中具有重要作用。

本研究結(jié)果顯示，SAP組大鼠的胰腺、小腸組織病理評分均顯著高于對照組（P<0.05），說明SAP組大鼠胰腺、小腸組織存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織出血、水腫、壞死等損傷嚴(yán)重。SAP組大鼠小腸組織的TLR4蛋白和mRNA水平均顯著高于對照組大鼠（P<0.05），表明大鼠TLR4信號通路被活化后，通過MyD88依賴性途徑介導(dǎo)下游NF-κB的活化，使得NF-κB活性顯著高于對照組大鼠，而NF-κB的活化又能促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子、炎癥相關(guān)介質(zhì)的表達(dá)，從而使得SAP組大鼠血清炎癥因子水平顯著高于對照組。由于炎癥因子的正反饋效應(yīng)，進(jìn)一步活化NF-κB，使得SAP組大鼠血清炎癥因子水平進(jìn)一步增加。胰腺、小腸組織受到大量炎癥因子的侵襲，最終使大鼠組織病理評分惡化。已有研究報道，羅格列酮、白藜蘆醇抑制重癥SAP大鼠NF-κB活性后，可有效降低血清TNF-α、IL-1、IL-6等的產(chǎn)生[16-17]，烏司他丁可能中斷SAP大鼠胰腺組織中的TLR4、高遷移率族蛋白-1的信號通路而降低炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，大黃可降低大鼠TLR4 mRNA、TLR2 mRNA的表達(dá)，從而對胰腺炎腸黏膜炎癥有一定的療效[18-20]。故而推測TLR4可能作為炎癥反應(yīng)的啟動閘門，為治療SAP并腸黏膜屏障功能障礙提供潛在的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，TLR4信號通路在SAP的發(fā)展起到了重要的作用，作為炎癥反應(yīng)的“閘門”，可通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控炎性介質(zhì)的釋放和引起SAP各器官損傷，可能作為治療SAP并腸黏膜屏障功能障礙的潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]陳東嬌，龔曼芹.連續(xù)性腎臟替代治療術(shù)對重癥急性胰腺炎生化及生理指標(biāo)的影響[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2018，39（5）：555-558.

[2]王健.彩超、CT平掃與增強(qiáng)CT檢查在急性胰腺炎診斷中的臨床對比研究[J].影像研究與醫(yī)學(xué)應(yīng)用，2018，2（6）：22-24.

[3]江發(fā)良，林彩虹.增強(qiáng)CT和彩超在急性胰腺炎診斷中的應(yīng)用比較[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2016，23（26）：106-108.

[4]熊波，張勁夫，張興文.重癥急性胰腺炎合并腸動力障礙相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（2）：226-230，235.

[5]張明敏，杜建文.大承氣湯對急性重癥胰腺炎大鼠血清IL-6 sIL-2R誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2018，34（3）：352-354，357.

[6]劉麗，劉大晟，吳先林.桃核承氣湯對重癥急性胰腺炎大鼠腸道功能的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，35（1）：106-111.

[7] Grewal H P，Mohey el Din A，Gaber L，et al.Amelioration of the physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti-TNF-alpha polyclonal antibody[J].Am J Surg，1994，167（1）：214-219.

[8] Fealy N，Aitken L，Toit E D，et al.Blood flow rate and circuit life in continuous renal replacement therapy（CRRT）：a randomised controlled trial （RCT）[J].Australian Critical Care，2016，29（2）：114.

[9]湯建軍，李恒平，韓小樂，等.花椒毒酚對重癥急性胰腺炎大鼠腦損傷保護(hù)作用及NF-κB/iNOS通路的影響[J].實(shí)用藥物與臨床，2018，21（3）：252-257.

[10] Piao X，Liu B，Guo L，et al.Picroside II Shows Protective Functions for Severe Acute Pancreatitis in Rats by Preventing NF-κB-Dependent Autophagy[J].Oxidative Medicine & Cellular Longevity，2017（5）：7085709.

[11]金巖柏，鄔林泉，張成雷，等.茵陳承氣湯對大鼠重癥急性胰腺炎NF-κB活性表達(dá)的影響[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2011，11（2）：84-85.

[12]田喆，謝曉晶，孫書林，等.黃連素對重癥急性胰腺炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響[J].海南醫(yī)學(xué)，2018，29（4）：448-451.

[13] Li G，Wu X，Yang L，et al.TLR4-mediated NF-κB signaling pathway mediates HMGB1-induced pancreatic injury in mice with severe acute pancreatitis[J].Int J Mol Med，2016，37（1）：99-107.

[14]王彬，吳曉尉，許小兵，等.Toll樣受體4在重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織中的表達(dá)和作用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2016，21（11）：1215-1220.

[15]崔旻，吳浩，姚萍.大黃對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜TLR2、TLR4的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（12）：4006-4008.

[16]陸貝，于源泉，殷俊杰，等.NF-κB/TLR4信號通路在急性胰腺炎大鼠肝損傷中的表達(dá)及PPAR-γ激動劑的保護(hù)作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（33）：30-33，169.

[17]徐剛潮，莫曉華，孫敏.白藜蘆醇對大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷NF-κB活性影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2010，5（15）：17-18.

[18]胡吉富，陳秀金，徐靜，等.烏司他丁聯(lián)合大黃、芒硝治療大鼠急性壞死性胰腺炎效果觀察[J].山東醫(yī)藥，2018，58（4）：37-39.

[19]王靜，王烜，鄧明明，等.HMGB1、TLR4在重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織中的表達(dá)及烏司他丁的干預(yù)效應(yīng)[J].重慶醫(yī)學(xué)，2015，44（4）：450-452.

[20]王靜，黃忠，魏尉，等.HMGB1在重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷中的表達(dá)及烏司他丁的干預(yù)效應(yīng)[J].西部醫(yī)學(xué)，2018，30（2）：174-177，181.

（收稿日期：2018-05-03） （本文編輯：張爽）