華支睪吸蟲排泄分泌抗原McAb的制備及雙抗夾心ELISA的初步建立

,,,

華支睪吸蟲病是由華支睪吸蟲(ClonorchisSinensis)(又稱肝吸蟲)感染引起重要食源性寄生蟲病[1]。成蟲寄生在肝膽管內(nèi)，其分泌物、代謝產(chǎn)物和機(jī)械刺激等因素可誘發(fā)膽管內(nèi)膜及周圍的慢性炎性反應(yīng)，繼而出現(xiàn)管壁增厚、膽管局限性擴(kuò)張及門脈周圍纖維組織增生[2]。目前臨床常用的實(shí)驗(yàn)診斷是病原學(xué)檢查，主要為涂片法、集卵法、十二指腸引流膽汁等，但總體檢出率較低。免疫學(xué)診斷方法具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，而利用單克隆抗體(McAb)技術(shù)研發(fā)免疫學(xué)診斷試紙盒能夠?yàn)槿A支睪吸蟲病的現(xiàn)癥診斷、蟲荷估計(jì)、療效考核和預(yù)后判斷提供新的手段。應(yīng)用單克隆抗體檢測(cè)寄生蟲抗原比如血吸蟲蟲卵抗原、循環(huán)多糖抗原及特定分子等研究中，都取得較為滿意的結(jié)果[3]。本研究通過(guò)制備抗華支睪吸蟲排泄/分泌抗原(ESA)的單克隆抗體，并進(jìn)一步建立雙抗體夾心的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)方法，以期為臨床提供更為方便有效的診斷手段。

1 材料與方法

1.1主要試劑和耗材 HAT/HT培養(yǎng)基、福氏佐劑、SBA Clone typing TM system/HRP抗體亞類試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；50%聚乙二醇1500購(gòu)自德國(guó)Merck公司；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基等購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；96孔酶標(biāo)板和細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2動(dòng)物和細(xì)胞 健康雌性SPF級(jí)Balb/c小鼠，6～8周齡10只，體重14～17 g，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(蘇)2002—0031]；Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞本室保存。

1.3 方法

1.3.1肝吸蟲排泄/分泌抗原(ESA)制備 分離華支睪吸蟲感染家兔肝臟內(nèi)活動(dòng)良好的成蟲，在DMEM 培養(yǎng)液中37 ℃、5% CO2條件下無(wú)菌培養(yǎng)，12 h后收集培養(yǎng)液，離心取上清，檢測(cè)濃度后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2動(dòng)物免疫 選擇生長(zhǎng)良好的6～8周齡、雌性Balb/c小鼠5只，以上述制備的ESA進(jìn)行免疫，另設(shè)對(duì)照組小鼠3只。將ESA溶于360 μL生理鹽水中，充分混勻，加入等體積的福氏佐劑，100 μg/只小鼠抗原量背部皮下多點(diǎn)注射，0.2 mL/點(diǎn)，2～5點(diǎn)/只，第3輪免疫不再用佐劑，融合前3 d同樣抗原量?jī)?nèi)眥靜脈注射，以加強(qiáng)免疫。對(duì)照組小鼠注射生理鹽水。

1.3.3細(xì)胞融合 經(jīng)過(guò)3輪的基礎(chǔ)免疫和一次加強(qiáng)免疫，取小鼠脾臟，常規(guī)制備單個(gè)細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取1×108脾細(xì)胞與2×107骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0(5∶1)用50% PEG融合劑，按常規(guī)方法融合并對(duì)融合后細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)[4]。選擇生長(zhǎng)良好、抗體分泌量高的雜交瘤細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)并及時(shí)液氮凍存。

1.3.4單克隆抗體的制備及純化 小鼠腹腔內(nèi)注射液體石蠟進(jìn)行預(yù)處理(0.5 mL/只)，將分泌特異McAb的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔，收集腹水，離心去雜質(zhì)后用33%飽和硫酸銨沉淀2次并4 ℃透析24 h純化抗體，利用DEAE-SephadexA52層析柱，收集洗脫液中蛋白并濃縮， SDS-PAGE 檢測(cè)純化IgG的純度。

1.3.5雜交瘤細(xì)胞上清液抗體效價(jià)的測(cè)定 采用間接ELISA法對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定，倍比稀釋成不同的濃度，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照及空白對(duì)照，以P/N>2的抗體最大稀釋度作為效價(jià)終值。

1.3.6單克隆抗體免疫球蛋白亞類鑒定 采用SBA Clone typing TM system/HRP抗體亞類試劑盒，按說(shuō)明書方法進(jìn)行測(cè)定。取已包被好的酶標(biāo)板，加入雜交瘤細(xì)胞上清，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，封閉后加入工作濃度的羊抗鼠IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌5次，100 mL/孔加入顯色液，37 ℃閉光顯色15 min，加終止液。

1.3.7 雙抗體夾心ELISA法的建立

1.3.7.1辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記單抗 常規(guī)過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記抗體。

1.3.7.2抗體工作濃度的確定 分別對(duì)包被抗體和酶標(biāo)抗體梯度稀釋，棋盤滴定法確定其最佳反應(yīng)條件；磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋單抗后，100 μL/孔包被酶標(biāo)板并4 ℃過(guò)夜；0.05% Tween-20的PBS(PBST)洗板3次，3 min/次；5%脫脂奶粉37 ℃孵育1 h；加入待檢樣品，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板3次，3 min/次；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單抗，37 ℃孵育2 h，洗板；常規(guī)TMB底物顯色，2 mol/L的濃硫酸50 μL/孔終止反應(yīng)，檢測(cè)酶標(biāo)儀450 nm處光密度值(optical density, OD450)。以抗體稀倍數(shù)較高且陽(yáng)性對(duì)照/陰性對(duì)照OD值最大時(shí)，包被抗體和酶標(biāo)抗體的組合作為抗體的工作濃度，初步建立雙抗體夾心ELISA體系。

1.3.7.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 應(yīng)用初步建立的雙抗體夾心ELISA方法，檢測(cè)梯度稀釋的ESA并進(jìn)行做線性回歸分析，以大于陰性對(duì)照2倍為Cutoff值，確定檢測(cè)最佳線性范圍。

1.3.7.4單克隆抗體特異性試驗(yàn) 用建立的ELISA方法檢測(cè)其與日本血吸蟲成蟲抗原、豬囊尾蚴抗原、瘧原蟲抗原交叉反應(yīng)性，確定該ELISA方法的特異性。

2 結(jié) 果

2.1感染小鼠血清抗體效價(jià)經(jīng)過(guò)三輪基礎(chǔ)動(dòng)物免疫后，內(nèi)眥取血法采集免疫小鼠血清，ELISA法檢測(cè)血產(chǎn)生抗體的效價(jià)，檢測(cè)結(jié)果(見表1)顯示，用于融合的小鼠血清抗體效價(jià)至少達(dá)1∶400以上，表明此小鼠的脾臟可作為融合所用脾細(xì)胞的來(lái)源。

表1 免疫小鼠血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果(OD450)Tab.1 Result of determining valence of antibody in the immuned mouse

2.2雜交瘤細(xì)胞的篩選 細(xì)胞融合后，挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞孔進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè)，對(duì)結(jié)果陽(yáng)性值高的細(xì)胞孔鋪板克隆化培養(yǎng)(圖1、圖2)。經(jīng)過(guò)3輪篩選后，最后得到2株雜交瘤細(xì)胞株，命名為B7、F1。

2.3雜交瘤細(xì)胞上清液抗體效價(jià)測(cè)定 對(duì)雜交瘤細(xì)胞株B7上清液進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)，挑選出單細(xì)胞生長(zhǎng)孔對(duì)其進(jìn)行ELISA檢測(cè)(表2)，結(jié)果顯示82個(gè)細(xì)胞孔抗體陽(yáng)性率為100%，且OD450值結(jié)果趨于一致，說(shuō)明其具有較好的穩(wěn)定性。

圖1 雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)第3 d細(xì)胞形態(tài) (A：×100；B：×400)Fig.1 Morphology of hybridoma cell-3d after cloning of cultivation

圖2 雜交瘤細(xì)胞亞克隆化培養(yǎng)第8 d細(xì)胞形態(tài)(A：×100；B：×400)Fig.2 Morphology of hybridoma cell-8d after cloning of cultivation (A: ×100; B: ×400)

表2 雜交瘤細(xì)胞株B7第四輪篩選后ELISA 檢測(cè)結(jié)果Tab.2 values of B7 after the fouths creening by ELISA

2.4單克隆抗體亞類鑒定 吸取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照SBA Clone typing TM system/HRP抗體亞類試劑盒檢測(cè)方法鑒定細(xì)胞株分泌的單克隆抗體的抗體亞類均屬IgG1。

圖3 抗體亞型檢測(cè)(OD450)Fig.3 Identification of antibody subtypes (OD450)

2.5單克隆抗體純化效果分析 對(duì)純化后單抗進(jìn)行SDS-PAGE分析顯示，純化后的兩株單抗均在分子量26 kD大小處出現(xiàn)一條輕鏈，在50 kD左右出現(xiàn)一條重鏈，且無(wú)其他明顯雜帶。結(jié)果表明抗體純化效果較好，純度較高。

M: 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；B7/F1: 純化的B7/F1 McAbs圖4 純化單克隆抗體的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of purified McAb

2.6抗體工作濃度的確定 對(duì)包被抗體及酶標(biāo)標(biāo)記抗體進(jìn)行梯度稀釋，利用棋盤滴定法確定其工作濃度，實(shí)驗(yàn)表明以抗體B7 包被，以F1 標(biāo)記HRP做酶標(biāo)抗體效果較好，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)，確定包被抗體濃度為10 μg/mL，酶標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù)為1∶2 000，此條件下陽(yáng)性/陰性值最大。

2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及體系靈敏度的確定 將ESA進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋，應(yīng)用初步建立的雙抗體夾心ELISA方法，以稀釋的ESA濃度值的對(duì)數(shù)值為自變量，以測(cè)得OD450值的對(duì)數(shù)值為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖5，分析得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.078 9x-2.174 8，R2=0.996 9，檢測(cè)最佳線性范圍為0.014～0.248 μg/mL，最低檢出值0.014 μg/mL。

表3 包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的確定Tab.3 Conformation of the optimal antibody concentration

圖5 雙抗體夾心法檢測(cè)ESA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of double antibody sandwich method to detect ESA

2.8ELISA法特異性測(cè)定 以建立的雙抗夾心ELISA法檢測(cè)與其他寄生蟲抗原的反應(yīng)性，結(jié)果顯示， 3種寄生蟲檢測(cè)OD450值均小于0.1，表明建立的ELISA法與其他抗原無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較強(qiáng)。

表4 抗體特異性檢測(cè)Tab.4 Specificity of antibodies

3 討 論

華支睪吸蟲成蟲寄生于人或其它終宿主的肝膽管內(nèi)，可引起膽管的炎癥反應(yīng)，甚至誘發(fā)肝膽管癌，防治工作刻不容緩，而提高華支睪吸蟲病的診斷水平是開展流行病學(xué)調(diào)查以及開展臨床檢測(cè)的重要環(huán)節(jié)。隨著近代免疫學(xué)的高速發(fā)展，免疫診斷方法在臨床輔助診斷以及流行病學(xué)調(diào)查中占據(jù)越來(lái)越重要的地位，研制開發(fā)快速、方便、敏感性高、特異性強(qiáng)的肝吸蟲病診斷工具是及時(shí)治療患者的重要保障。目前，華支睪吸蟲病的免疫診斷還面臨著諸如假陽(yáng)性、假陰性和交叉反應(yīng)等許多問(wèn)題影響診斷結(jié)果，故檢測(cè)方法必須具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)，而單克隆抗體基本可以滿足這些要求。雖然近年來(lái)出現(xiàn)了一些如轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)[5]、嵌合單抗技術(shù)[6]、核糖體展示技術(shù)[7]、噬菌體展示技術(shù)[8]等新型抗體制備手段，但是這些技術(shù)目前尚未發(fā)展成熟，且傳統(tǒng)雜交瘤細(xì)胞的制備技術(shù)成熟穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，因而本研究仍采用傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)，利用三輪基礎(chǔ)免疫和一次加強(qiáng)免疫，提高免疫效果及抗體效價(jià)，安全可靠。

寄生蟲的排泄分泌抗原(ESA)主要由蟲體排泄或分泌的物質(zhì)釋放到蟲體外寄生部位，與其宿主細(xì)胞直接接觸，能夠引起一系列的生物效應(yīng)，具有重大的臨床診斷意義[9]。華支睪吸蟲ESA在幼蟲移行至肝膽管最終導(dǎo)致膽管及肝臟致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。我們利用制備的ESA免疫小鼠，經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合、克隆化培養(yǎng)、抗體制備及純化后，得到兩株高效、特異的單克隆抗體B7/F1，在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步利用這兩株單抗建立了雙抗體夾心ELISA法，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其其靈敏度達(dá)到0.014 μg/mL，且特異性較高，為ESA的有效檢測(cè)提供了參考。雙抗夾心ELISA的免疫學(xué)檢測(cè)方法因其靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用如病毒[11]、細(xì)菌[12]、人體激素[13]、食品安全[14]等檢測(cè)領(lǐng)域。我們將利用建立的雙抗體夾心ELISA法進(jìn)行初步的臨床應(yīng)用，有望將其開發(fā)成為華支睪吸蟲檢測(cè)試劑盒，為華支睪吸蟲病的臨床檢測(cè)提供新的手段。