一株高酶活力米曲霉菌株的選育及其在醬油生產中的應用

童 星，彭 勃

（1.佛山市海天（高明）調味食品有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市海天調味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；3.廣東海天創(chuàng)新技術有限公司，廣東 佛山 528000）

醬油是以大豆、面粉等糧食作為主要原料，經微生物發(fā)酵釀造而成的具有獨特風味的傳統(tǒng)調味品。目前，我國醬油每年生產量超過600萬t[1]。制曲在我國傳統(tǒng)醬油釀造食品的生產工藝中廣泛使用[2]，在制曲過程中，米曲霉（Aspergillus oryzae）、酵母等多種微生物的生長，使原料被分解，對醬油的風味和品質的提高具有重要意義[3]。米曲霉是醬油發(fā)酵過程中起主要作用的微生物，在發(fā)酵過程中可以通過分解淀粉和蛋白質原料，為其他微生物的代謝作用提供物質基礎[4]，同時形成的小分子多肽和氨基酸類物質也是醬油中風味物質形成的前提[5]。

目前，國內醬油生產用米曲霉菌株都有獨立的發(fā)酵特性，在生長速度、產孢數(shù)及主要酶系的分布等方面都有較為顯著的差異[6]。米曲霉滬釀3.042是國內醬油廠家廣泛使用的發(fā)酵菌種，具有生產周期短、抗性好、管理粗放等優(yōu)點，為了獲得更高的產量，對該菌種的最佳產酶條件[7]和菌株改造[8]進行研究。雖然篩選出的新菌株的蛋白酶活越來越高，但同時也打破了該菌株原來的酶系分布，而醬油釀造是一個多酶系共同作用的過程，酶系的改變容易造成利用純曲霉菌株發(fā)酵出的醬油質量下降[9]。因此，可以通過多菌種混合發(fā)酵[10-11]、發(fā)酵過程加酶處理或菌種改良等方法解決，但因多菌種混合發(fā)酵過程中多菌株的競爭性生長、發(fā)酵過程中加酶處理引入外源物質，容易造成成本的增加和食品安全隱患。因此，只有通過菌種改良，選育出綜合酶活力高、制曲過程原料消耗少的菌株，才能從根本上提高醬油生產時發(fā)酵原油的品質。

本研究通過常壓室溫等離子體（atmospheric roomtem-peratureplasma，ARTP）對米曲霉菌株As3.951進行誘變，篩選一株高酶活力的誘變菌株應用于醬油釀造，提高醬油品質，節(jié)省原料，為釀造醬油品質的提升提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.951：佛山市海天（高明）調味食品有限公司菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

酪蛋白培養(yǎng)基：干酪素6 g，KH2PO40.36 g，Na2HPO40.58 g，MgSO40.244 g，瓊脂粉20 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH 6.0，121℃滅菌15 min。

大豆蛋白培養(yǎng)基：大豆分離蛋白10g，MgSO4·7H2O0.5g，木糖30g，KH2PO41 g，瓊脂粉15 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH 6.4，121℃滅菌15min。

制曲培養(yǎng)基：麩皮200 g，豆粉200 g，面粉50 g，蒸餾水550 g，混合均勻后121℃滅菌15 min。

豆汁培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，酵母膏20 g，瓊脂20 g，豆汁（100 g黃豆，用1 000 mL蒸餾水浸泡24 h，煮沸30 min，過濾，取汁定容至1 000 mL）100 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，混勻，pH自然，121℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂（均為分析純）：廣州化學試劑廠；木糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限責任公司；干酪素（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉（生化試劑）：上海環(huán)凱微生物科技有限公司；大豆分離蛋白（生化試劑）：日本和光純藥工業(yè)株式會社；大豆、麩皮、面粉（均為食品級）：佛山市海天（高明）調味食品有限公司。

1.2 儀器與設備

SHP-250型生化培養(yǎng)箱：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BX53型光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司；759S型紫外分光光度計：上海棱光技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種誘變

（1）取米曲霉As3.951菌株的成熟斜面孢子制成孢子懸液，濃度為1×108CFU/mL，并對孢子懸液進行ARTP誘變。用0.85%的無菌生理鹽水將誘變后的孢子懸液梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，制成孢子稀釋液。

（2）取0.2mL孢子稀釋液涂布于酪蛋白培養(yǎng)基平板上，31℃避光培養(yǎng)96 h。

（3）挑取與出發(fā)菌種As3.951相比具有菌絲生長旺盛、透明圈大、產孢時間延遲特點的單菌落劃線于大豆蛋白培養(yǎng)基上，31℃條件下培養(yǎng)60h，再次挑取與出發(fā)菌種As3.951相比菌落直徑大、菌絲生長旺盛的單菌落，轉接于大豆蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)，成熟后進行菌種保藏。

1.3.2 誘變菌株篩選

（1）誘變菌株的初篩

將誘變獲得的目標菌種轉接于大豆蛋白培養(yǎng)基斜面上活化，30℃培養(yǎng)4 d。刮取斜面上孢子至無菌水中，使最終孢子濃度為1×108CFU/mL，按接種量為制曲培養(yǎng)基質量的10%分別接種于制曲培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑選菌絲生長和孢子著生正常的菌株制曲，并對制曲完成后的成熟曲料進行質量分析（孢子數(shù)、中性蛋白酶活力、淀粉酶活力），優(yōu)選生長正常和綜合酶活力高的菌株進行復篩。

（2）誘變菌株的復篩

將初篩獲得的菌株依次轉接斜面活化后，進行三角瓶擴大培養(yǎng)，然后繼續(xù)進行制曲和發(fā)酵試驗。通過檢測成曲（孢子數(shù)、原料消耗率、中性蛋白酶、谷氨酰胺酶和淀粉酶酶活）以及發(fā)酵原油（氨基酸態(tài)氮、全氮、全氮收得率、還原糖、谷氨酸）的質量，優(yōu)選出最佳菌株。

1.3.3 菌落形態(tài)觀察

挑取最優(yōu)菌株的單菌落接種于豆汁培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h后，觀察菌落生長狀態(tài)。

1.3.4 成曲及原油制備工藝

成曲制備工藝[2]：將大豆?jié)櫵铀繛榇蠖官|量的1.2倍，115℃蒸料15 min。熟料快速冷卻至37～40℃，拌入30%的面粉，按原料質量接入0.15%菌種，拌勻。按照通風制曲培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，溫度控制在30～35℃，培養(yǎng)42 h后制曲結束，獲得成曲。

原油制備工藝[12]：采用我國傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)發(fā)酵法。4 kg成熟曲料與8 kg鹽水（18%）均勻混合，于30℃條件下恒溫發(fā)酵50 d，過濾去除醬醪得到原油。

1.3.5 選育菌株醬油生產效果驗證

將誘變篩選的新菌株與出發(fā)菌株同步應用于醬油生產的制曲及發(fā)酵階段。制曲結束后抽樣檢測成曲的孢子數(shù)、原料消耗率、中性蛋白酶活力、淀粉酶活力及谷氨酰胺酶活力，發(fā)酵結束后檢測原油的氨基酸態(tài)氮、全氮、全氮收得率、還原糖及谷氨酸含量，并對原油進行感官評定。

1.3.6 指標測定

孢子數(shù)測定采用顯微鏡計數(shù)法[13]；全氮含量的的測定采用凱氏定氮法[14]；全氮收得率=原油全氮（g/100 mL）/原料全氮（g/100mL）×100%；氨基酸態(tài)氮含量的測定采用GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》中甲醛滴定法；中性蛋白酶活力的測定按照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》；淀粉酶活力的測定按照GB/T 5521—2008《糧油檢驗谷物及其制品中α-淀粉酶活性的測定比色法》；還原糖含量的測定按照GB/T 5009.7—2003《食品中還原糖的測定》；谷氨酰胺酶活力的測定參照鄒敏娟等[15]的方法。

感官評定[16]：隨機選出30人組成感官評定小組，對使用菌株As3.951和ZA189釀造的原油進行品鑒，并針對色澤、香氣、鮮味、甜味、苦澀味、鮮味、酸味、綜合口感以及體態(tài)進行比較及打分，評分范圍為1～5分（滿分為5分），分數(shù)越高表示喜愛度越高，具體評分標準見文獻[16]。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 初篩菌株成曲質量分析

挑選菌絲生長和孢子著生正常的菌株ZA189、ZA191、ZA192、ZA193、ZA194分別制曲，并對成曲質量進行分析，結果見表1。

由表1可知，通過誘變獲得的5株菌株的成曲質量與米曲霉As3.951相比，孢子數(shù)均降低；中性蛋白酶活力均提高，其中菌株ZA192成曲的中性蛋白酶活力最高，為3158.64U/g；除菌株ZA193（416.53 U/g）外，其他菌株的淀粉酶活力均高于出發(fā)菌株As3.951。因此，優(yōu)選生長正常和綜合酶活力高的菌株ZA189、ZA191、ZA192、ZA194進行復篩。

表1 初篩菌株成曲的質量分析Table 1 Quality analysis of finished kojimade with initial screening strains

2.1.2 復篩菌株的成曲質量分析

采用初篩獲得的4株誘變菌株（ZA189、ZA191、ZA192和ZA194）制曲和發(fā)酵。檢測成曲及發(fā)酵原油的質量，結果分別見表2和表3。

表2 復篩菌株成曲的質量分析Table 2 Quality analysis of finished kojiwith rescreening strains

由表2可知，4株誘變菌株中，菌株ZA189的孢子數(shù)較少，為2.18×108CFU/g，原料消耗率（5.79%）最低，而谷氨酰胺酶活力最高（3.43 U/g）；菌株ZA192的中性蛋白酶活力和淀粉酶活力最高，分別為3 210.07 U/g和525.80 U/g，但其谷氨酰胺酶活力低于菌株ZA189；菌株ZA191和ZA192在所有指標中未見明顯優(yōu)勢。

表3 復篩菌株發(fā)酵原油的質量分析Table 3 Quality analysis of crude soy sauce fermented with rescreening strains

由表3可知，復篩菌株發(fā)酵得到的原油的質量指標中，菌株ZA189的全氮收得率、還原糖和谷氨酸含量均高于其他3種菌株。綜合成曲和發(fā)酵原油質量分析結果，米曲霉誘變菌株ZA189為最優(yōu)菌株。

2.2 米曲霉菌株ZA189的菌落形態(tài)

米曲霉誘變菌株ZA189在豆汁培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖1所示。

米曲霉孢子數(shù)和菌絲的生長旺盛程度與醬油制曲的效果直接相關，張賀迎等[17]認為，大量孢子不利于蛋白酶活力的提高。

由圖1可知，米曲霉誘變菌株ZA189的菌落在豆汁培養(yǎng)基上生長快，培養(yǎng)60h后，成熟菌落形態(tài)單薄，直徑達38mm，色澤青黃綠色，幾乎無明顯菌絲，透明圈清晰，菌落表層覆蓋孢子厚度為（1.0±0.1）mm，而醬油生產用米曲霉孢子厚度在0.5～1.5mm范圍內[18]。因此該菌株孢子著生適量，適宜用于醬油生產中。

圖1 菌株ZA189的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain ZA189

2.3 選育菌株ZA189釀造醬油過程指標分析

2.3.1 菌株ZA189成曲質量分析

采用誘變篩選的新菌株ZA189與出發(fā)菌株As3.951同步制曲，制曲結束后抽樣檢測曲料的各項指標，結果見表4。

由表4可知，在制曲過程中，菌株ZA189的孢子數(shù)和原料消耗率顯著低于出發(fā)菌株As3.951（P＜0.05），酶活力明顯提高，中性蛋白酶活力和淀粉酶活力分別達到3 210.21 U/g和480.29 U/g，谷氨酰胺酶活力達到3.48 U/g，較出發(fā)菌株提高38%。米曲霉的谷氨酰胺酶活性能夠直接影響釀造醬油中的谷氨酸含量[19]，因此谷氨酰胺酶活力的提高對醬油鮮味的增加具有直接關聯(lián)。

表4 菌株ZA189與出發(fā)菌株As3.951成曲質量的比較Table 4 Quality comparison of finished kojimade with strain ZA189 and starting strain As3.951

2.3.2 菌株ZA189發(fā)酵原油質量分析

將制曲完成后的曲料進行發(fā)酵，并檢測經發(fā)酵壓榨后原油的各項理化指標，結果如表5所示。

由表5可知，選育菌種ZA189發(fā)酵原油的氨基酸態(tài)氮含量為1.16 g/100 mL、全氮含量為1.94 g/100 mL、還原糖含量為11.05 g/100 mL、谷氨酸含量為13.69 g/kg，均高于出發(fā)菌株As3.951，表明采用該選育菌株發(fā)酵原油的品質明顯提高。

表5 菌株ZA189與出發(fā)菌株As3.951發(fā)酵原油質量對比Table 5 Quality comparison of crude soy sauce fermented with strain ZA189 and starting strain As3.951

2.3.3 發(fā)酵原油的感官評定

將原油加熱處理后，對原油進行感官鑒評，結果見圖2。

圖2 原油的感官評定Fig.2 Sensory evaluation of crude soy sauce

由圖2可知，相比出發(fā)菌株米曲霉As3.951，菌株ZA189所得原油味道更濃郁，色澤更鮮明，具備醬香濃郁、鮮甜突出、滋味醇厚持久的特征，綜合口感達到3.66分，高于米曲霉As3.951（3.21分）。

3 結論

本研究采用ARTP對米曲霉As3.951進行誘變，選育出一株高酶活誘變菌株ZA189，與對照菌株As3.951相比，該菌株成曲的中性蛋白酶、淀粉酶和谷氨酰胺酶3種酶活力均得到明顯增強，分別為3 210.21 U/g、4 80.29 U/g、3.48 U/g，同時孢子數(shù)減少，原料消耗率下降，能夠改善現(xiàn)有米曲霉菌株普遍存在的主要問題；利用該菌株發(fā)酵得到的原油中氨基酸態(tài)氮、全氮、還原糖及谷氨酸含量增加，分別為1.17 g/100 mL、1.94 g/100 mL、11.05 g/100 mL和13.69 g/kg；菌株ZA189發(fā)酵得到的原油味道濃郁、色澤鮮明，能夠明顯提升釀造醬油發(fā)酵品質，對釀造醬油的發(fā)展具有積極意義。