王 勇,魏金旺*
(北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司 牛欄山酒廠,北京 101301)
牛欄山酒廠地處北京市順義區(qū)牛欄山鎮(zhèn),在釀造二鍋頭的工藝過(guò)程中,一直保持著制曲、立茬、發(fā)酵等一系列工序。牛欄山二鍋頭以高粱為釀酒原料,采用清香型低溫大曲或麩曲為糖化發(fā)酵劑,低溫入缸(池)的清蒸清茬地缸發(fā)酵,清蒸二次清和瓷磚池發(fā)酵,混蒸續(xù)茬老五甑工藝,發(fā)酵期為21~30d[1-4]。在質(zhì)量上保持了傳統(tǒng)的清香純正、口味甘洌、酒體醇厚、酒力強(qiáng)勁的特點(diǎn)[5-6],牛欄山二鍋頭酒作為我國(guó)清香型的典型代表性白酒之一,在國(guó)內(nèi)外也具有較高的知名度,逐漸成為北京的一種城市名片[7-9]。牛欄山二鍋頭獨(dú)特的風(fēng)味特征由上百種風(fēng)味物質(zhì)共同作用形成,王勇等[10-11]采用浸入式固相微萃取、液液萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-massspectrometer,GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)牛欄山二鍋頭的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了定性研究,并采用保留指數(shù)法對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,共獲得了101種香氣化合物的確切定性結(jié)果,其中包括35種酯類、13種酸類、15種醇類、5種醛類、1種酮類、15種芳香族及酚類、5種呋喃類、2種吡嗪類、3種縮醛類、1種硫化物、6種其他類化合物;采用氣相色譜-聞香-質(zhì)譜(gaschromatography-olfactorymass spectrometry,GC-O-MS)聯(lián)用儀方法解析了牛欄山二鍋頭中重要的香氣組分特征,采用液液萃取法提取牛欄山二鍋頭白酒中的香氣化合物,進(jìn)行聞香分析GC-O和GC-MS分離鑒定,一次性檢出92種香氣化合物,其中對(duì)牛欄山二鍋頭白酒整體香氣貢獻(xiàn)大的香氣成分有25種。但目前關(guān)于牛欄山二鍋頭中不揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究還很少有報(bào)道,“無(wú)酸不成味”,有機(jī)酸類物質(zhì)是白酒的重要風(fēng)味物質(zhì),白酒中有機(jī)酸的種類和含量對(duì)白酒的風(fēng)味特征具有重要的影響,對(duì)白酒中有機(jī)酸種類、含量和生成規(guī)律的分析研究對(duì)于評(píng)價(jià)酒體質(zhì)量、優(yōu)化釀造工藝具有重要意義。
目前,飲料酒中有機(jī)酸的分析方法主要有分光光度法、反向高效液相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法、氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用法、離子色譜(ion chromatography,IC)法等。其中離子色譜法因其靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單成為飲料酒中有機(jī)酸分析廣泛采用的方法。近年來(lái),該方法開(kāi)始應(yīng)用于白酒中有機(jī)酸的分析檢測(cè)。劉瓊[12]選用濃香型白酒為樣品,進(jìn)行分析方法應(yīng)用的探討,并與氣相色譜分析方法作對(duì)比。離子色譜法分析白酒樣品中6~8個(gè)有機(jī)酸組分,只需約15 min,方法回收率98%~100%,重復(fù)實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)在5%以下。卜宇宏[13]運(yùn)用離子交換分析方式加上抑制型電導(dǎo)檢測(cè),作出白酒中有機(jī)酸的特征圖譜,結(jié)果表明乳酸、乙酸、丁酸、己酸的線性范圍分別為15~35 mg/L、25~45 mg/L、5~25 mg/L、30~50 mg/L,4種有機(jī)酸樣品加標(biāo)回收率為98%~103%,說(shuō)明該分析方法具有靈敏度高、分析速度快的特點(diǎn)。潘丙珍等[14]建立用離子色譜/電導(dǎo)檢測(cè)法測(cè)定酒類中有機(jī)酸和無(wú)機(jī)陰離子的分析方法,對(duì)11種有機(jī)酸和5種無(wú)機(jī)陰離子具有良好的線性,相關(guān)系數(shù)在0.990 9~0.9997;準(zhǔn)確度和精密度良好,樣品加標(biāo)回收率在81.0%~117.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandaral deviation,RSD)<5.0%;檢出限低,在0.015~0.152mg/L。但是目前該方法還未見(jiàn)應(yīng)用于清香型白酒原酒中有機(jī)酸類風(fēng)味物質(zhì)的分析檢測(cè)。
本研究建立離子色譜法對(duì)清香型原酒中的有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè),并著重分析研究了牛欄山二鍋頭原酒中的有機(jī)酸類物質(zhì),探明有機(jī)酸在不同原酒中的分布規(guī)律,對(duì)研究濃香型、醬香型等原酒中的有機(jī)酸提供理論研究基礎(chǔ)。
1.1.1 材料
牛欄山二鍋頭原酒:北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠。分別選取大茬和二茬酒頭、前段、中段、后段、尾段5個(gè)不同摘酒段,共十個(gè)酒樣。
1.1.2 化學(xué)試劑
有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(甲酸鈉、乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉、丙酮酸鈉、乳酸鈉、琥珀酸鈉、草酸鈉、富馬酸鈉、檸檬酸鈉、異丁酸、異戊酸、2-乙基丁酸、戊酸、己酸、山梨酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、烏頭酸):美國(guó)Sigma公司,母液均配制為1 000 mg/L,儲(chǔ)存于2~8℃。所用溶液均用電阻率為18.2 MΩ·cm超純水配制。
ICS-3000型離子色譜儀(配有EG40淋洗液自動(dòng)發(fā)生器、電導(dǎo)檢測(cè)器和Chromeleon 6.80色譜工作站)、Ionpac AS11-HC型分離柱(250 mm×4 mm)、Ionpac AG11-HC型保護(hù)柱(50 mm×4 mm)、ASRS-ULTRA陰離子抑制器:美國(guó)Dionex公司;0.45μm過(guò)濾膜、Milli-QIQ 7000超純水系統(tǒng):美國(guó)Millipore公司;HGC-12A氮吹儀:重慶中譜科技有限公司。
1.3.1 離子色譜條件
色譜柱:Ionpac AS11-HC型分離柱(250 mm×4 mm),Ionpac AG11-HC型保護(hù)柱(50 mm×4 mm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:EG自動(dòng)產(chǎn)生淋洗液梯度淋洗,KOH梯度淋洗程序見(jiàn)表1;流速:1.0 mL/min;抑制器再生模式:外加水電抑制;電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè);進(jìn)樣量:25μL。首先選擇單一有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè),尋找其出峰時(shí)間及峰面積;其次選擇混合標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)。按照出峰時(shí)間進(jìn)行有機(jī)酸的定性,使用離子色譜自主選擇峰面積進(jìn)行有機(jī)酸的定量。
表1 白酒有機(jī)酸分析KOH梯度淋洗程序Table 1 KOH gradient eluting procedure of organic acid in Baijiu analysis
1.3.2 樣品前處理
將牛欄山二鍋頭酒樣稀釋50倍,過(guò)0.45μm過(guò)濾膜后直接進(jìn)樣,可直接定量濃度較高且保留時(shí)間靠前的部分有機(jī)酸(如乳酸、乙酸等);將8 mL的酒樣在30℃條件下氮吹至1 mL,用超純水定容至2 mL,過(guò)0.45μm過(guò)濾膜后進(jìn)樣檢測(cè),即濃縮4倍進(jìn)樣檢測(cè),可以定量濃度較低且保留時(shí)間靠后的有機(jī)酸(如二元酸等)。
按照上述樣品處理方式進(jìn)行離子色譜檢測(cè),按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中有機(jī)酸含量,回收率是通過(guò)離子色譜檢測(cè)值與已知標(biāo)樣濃度的比值。
根據(jù)離子色譜的檢測(cè),有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、檢出限及回收率結(jié)果見(jiàn)表2,有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖見(jiàn)圖1。
由表2可知,各有機(jī)酸測(cè)得的線性相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上,加標(biāo)回收率除甲酸外(74.90%),在82%~118%之間。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)有機(jī)酸種類多的特點(diǎn),適合于清香型原酒中有機(jī)酸的分析檢測(cè)。
由圖1可知,該方法可在50 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)21種有機(jī)酸類的完全分離,并且在保證各種有機(jī)酸都能出峰的基礎(chǔ)上,每個(gè)峰面都不重合,出峰時(shí)間能夠完全分離開(kāi)。因此,該檢測(cè)方法能有效地檢測(cè)清香型原酒中的有機(jī)酸,并且檢測(cè)有機(jī)酸種類較多。
表2 21種有機(jī)酸離子色譜分析標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、檢出限和回收率Table 2 Standard curves regression equation,linear range,detection limits and recovery rates of 21 organic acids analyzed by ion chromatography
圖1 21種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜圖Fig.1 Ion chromatography of 21 mixed standard solutions of organic acids
采用1.3.2的處理原酒方法,對(duì)牛欄山二鍋頭原酒中有機(jī)酸種類和含量進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,在牛欄山原酒中共檢出9種有機(jī)酸,主要包括乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、己酸、丙酮酸。對(duì)不同原酒中有機(jī)酸定量分析發(fā)現(xiàn),乙酸、乳酸是牛欄山原酒中的主要有機(jī)酸類物質(zhì),其中乙酸質(zhì)量濃度范圍為233.86~2416.98mg/L,占有機(jī)酸總含量的41.1%~79.3%;乳酸質(zhì)量濃度范圍為18.34~6504.96mg/L,占有機(jī)酸總含量的14.5%~57.5%;其他有機(jī)酸濃度較低,占有機(jī)酸總含量的1.3%~9.0%。乙酸和乳酸是牛欄山二鍋頭原酒中重要的風(fēng)味物質(zhì),適量的乙酸和乳酸可賦予酒體酸爽感和協(xié)調(diào)感,平衡酒的苦味,提高酒的后味,同時(shí)有利于儲(chǔ)存過(guò)程中酒體老熟。
表3 牛欄山二鍋頭原酒中有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of organic acids contents in base liquor of Niulanshan Erguotou mg/L
清蒸二次清工藝可分為大茬酒和二茬酒,其中大茬酒采用純糧發(fā)酵,高粱經(jīng)過(guò)破碎、潤(rùn)料、蒸煮糊化、冷散、加曲后入缸發(fā)酵30 d,上甑分段掐酒得大茬酒;大茬蒸餾后的酒醅重新加水、冷散、加曲后二次入缸發(fā)酵30 d,上甑分段掐酒得二茬酒。從表3中可以看出,原酒中的有機(jī)酸中乙酸和乳酸含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),因此本研究著重對(duì)其兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了分析,乙酸變化分析結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 不同茬次原酒中乙酸含量比較Fig.2 Comparison of acetic acids contents in different batch of base liquor
由圖2可知,大茬酒和二茬酒在不同摘酒時(shí)間段乙酸含量的變化趨勢(shì)有差別,隨著摘酒時(shí)間的推移,大茬、二茬乙酸含量呈平緩上升曲線,乙酸在尾段含量最高。在牛欄山原酒酒頭中的乙酸為300 mg/L左右,而在后段、尾段則提高了3倍左右。原因可能是乙酸沸點(diǎn)較高(117.9℃),本身難蒸餾出,但酒中含有較多的醇、酯和醛類物質(zhì),乙酸與這些低沸點(diǎn)的化合物(乙醇為78.4℃)和水形成一定的共沸和拖帶作用,在一定程度上降低了乙酸的沸點(diǎn),使得乙酸也能隨著溫度升高而逐漸餾出。
原酒中的乳酸變化分析結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 不同茬次原酒中乳酸含量比較Fig.3 Comparison of lactic acid contents in different batch of base liquor
由圖3可知,大茬乳酸幾乎呈線性遞增,尾段酒的酸增有一個(gè)突躍;二茬酒的乳酸增加呈平緩上升曲線。在牛欄山原酒中酒頭的乳酸為60 mg/L左右,而在后段、尾段則提高了5倍左右。這主要是因?yàn)殡y揮發(fā)酸在溫度較低的時(shí)候難以蒸餾出[15-16],所以越是難揮發(fā)的物質(zhì)越是集中在溫度較高的后期餾出,這也解釋了隨著摘酒時(shí)間的推移,難揮發(fā)的乳酸增大的現(xiàn)象。
本研究采用離子色譜技術(shù)建立了清香型白酒原酒中21種有機(jī)酸含量的分析方法。該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99,靈敏度高,所測(cè)樣品濃度在線性范圍之內(nèi),適合于白酒原酒中有機(jī)酸的分析檢測(cè)。采用該方法系統(tǒng)分析了不同類別牛欄山原酒中有機(jī)酸的種類、含量和分布規(guī)律。在牛欄山原酒中共檢出9種有機(jī)酸,主體酸類物質(zhì)為乙酸和乳酸。從定量結(jié)果來(lái)看,乙酸、乳酸質(zhì)量濃度在有機(jī)酸中屬于主要酸類物質(zhì),乙酸含量為233.86~2416.98mg/L,占有機(jī)酸總量的41.1%~79.3%;乳酸含量為18.34~6 504.96 mg/L,占有機(jī)酸總量的14.5%~57.5%;其他有機(jī)酸含量較低,占有機(jī)酸總量的1.3%~9.0%。
進(jìn)一步分析乙酸和乳酸在不同原酒中的分布規(guī)律發(fā)現(xiàn),大茬酒和二茬酒在不同摘酒時(shí)間段乙酸含量的變化趨勢(shì)有差別,隨著摘酒時(shí)間的推移,乙酸大二茬含量呈平緩上升曲線。而大茬酒的乳酸幾乎呈線性遞增,尾段酒的酸增有一個(gè)突躍;二茬酒的乳酸增加呈平緩上升曲線,這主要是由乙酸和乳酸結(jié)構(gòu)決定的。