醬香型酒曲及窖內(nèi)酒醅揮發(fā)性成分的分析

楊 萍，胡 萍*，樊 敏，謝垚垚，袁再順，田 亞，孫利林

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

醬香型白酒屬于大曲醬香型，其酒體主要部分是乙醇和水，占98%～99%，另外1%～2%為微量成分，包括有機酸類、醇類、酯類、酮類、醛類、縮醛、芳香族化合物、含氮化合物、含硫化合物、呋喃化合物、芳香烴、醚類等，另外還有α-蒎烯、1,3,5-環(huán)庚三烯、內(nèi)酯等成分，雖然這些成分所占比例少，但決定了白酒的口感和風(fēng)格特點[1-3]。目前還不能確定醬香型白酒的主體香，1981年，貴州省輕工科研所提出醬香是一種復(fù)合香，由高沸點的酸性物質(zhì)與低沸點的酯、醛類成分組成，前者由于沸點高，主要起呈味作用，后者主要是呈香[4]；汪玲玲[5]推測醬香型白酒的特征香應(yīng)為酒中含量較低而香氣閾值更低的其他微量成分，并通過添加試驗表明4-乙基愈創(chuàng)木酚、三甲基吡嗪、糠醛和呋喃扭爾都不是醬香型白酒的典型醬香物質(zhì)。

“好曲產(chǎn)好酒”，大曲具有糖化、發(fā)酵、酒化和生香的作用，它能將制曲過程中經(jīng)生物、物理、化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的各種香味物質(zhì)帶入酒中，增加酒的風(fēng)味，其品質(zhì)與酒的出酒率和酒質(zhì)關(guān)系密切[6-7]。酒醅是釀酒原料經(jīng)微生物混合后發(fā)酵的物料，酒醅中的揮發(fā)性物質(zhì)則影響著白酒酒體的風(fēng)味[8]。酒醅的上層產(chǎn)醬香典型體，多含乙醛、乙縮醛、3-羥基丁酮、2,3-丁二酮、雙乙酰、糠醛等羰基化合物；中層產(chǎn)醇甜典型體，以2,3-丁二醇、丙三醇、環(huán)己六醇等多元醇含量最多；底層產(chǎn)窖底香典型體，則以己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸、己酸為主，醬香典型體是決定醬香型白酒風(fēng)味和質(zhì)量的關(guān)鍵[9]。

本研究以兩個醬香型酒廠的成品曲、第四輪次窖內(nèi)酒醅為研究對象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspacesolid-phasemicroextraction-gaschromatographymassspectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)進行揮發(fā)性成分檢測，并運用主成分分析（principal componentanalysis，PCA）法探討不同酒廠酒曲、窖內(nèi)酒醅的異同，以及酒曲與窖內(nèi)酒醅風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性，為解析醬香型白酒醬香風(fēng)味及形成機理提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒曲、窖內(nèi)酒醅樣品：于2015年8月，對貴州省茅臺鎮(zhèn)H、G兩個醬香白酒生產(chǎn)廠的成品曲（儲曲期3個月）、第四輪次的窖內(nèi)酒醅進行采樣。采樣方式為每層中心和四角收集，每100 g混合樣品裝于采樣袋，置于-20℃冰箱中備用。共采集6個樣品，分別為H酒曲、G酒曲、H窖內(nèi)酒醅上層、G窖內(nèi)酒醅上層、H窖內(nèi)酒醅下層、G窖內(nèi)酒醅下層。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀：成都金山化學(xué)試劑有限公司；甲醛溶液：西隴科學(xué)股份有限公司；鹽酸：重慶川東化（集團）有限公司。均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

77-1磁力攪拌器：天津市賽得利新實驗分析儀器制造廠；PHS-3C雷磁pH計：上海儀電分析儀器有限公司；PK100固相微萃取儀采樣瓶及57328-U 50/30μm DVB/CAR/PDMS Stableflex（2 cm）萃取頭：美國Supelco公司；HP6890/5975C GC-MS聯(lián)用儀：美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化指標(biāo)的測定

水分的測定參照國標(biāo)GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》[10]，總酸的測定參照國標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[11]，氨基酸態(tài)氮的測定參照國標(biāo)GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[12]。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定酒曲及窖內(nèi)酒醅的揮發(fā)性風(fēng)味成分[13]。

（1）HS-SPME條件：均勻取樣品約3 g，置于15 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝50/30μm DVB/CAR/PDMSStableflex（2 cm）纖維頭的手動進樣器，在80℃條件下頂空萃取40 min，快速移出萃取頭并立刻插入氣相色譜儀（gas chromatograph，GC）進樣口（溫度250℃）中，熱解析3 min后進樣。

（2）GC條件：色譜柱為ZB-5MSI 5%phenyl-95%dimethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱；升溫程序：40℃保留2 min，以5℃/min升溫至270℃，保留48 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦氣（He）（純度99.999%）；載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間1 min。

（3）MS條件：離子源為電子轟擊（electron impact，EI）離子源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6μA；倍增器電壓1 294 V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍29～450 amu。

（4）定性定量分析：總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖核對，對各揮發(fā)性成分進行定性；用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理及主成分分析

經(jīng)HS-SPME-GC-MS技術(shù)對酒曲及窖內(nèi)酒醅的揮發(fā)性風(fēng)味成分測定后，采用Excel2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計制表，應(yīng)用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行降維處理，選取方差累計貢獻率≥85%的主成分進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒曲、窖內(nèi)酒醅的理化指標(biāo)

兩醬香型酒廠酒曲、窖內(nèi)酒醅的部分理化指標(biāo)結(jié)果見表1。

表1 6個樣品的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of 6 kinds of samples

由表1可知，H酒曲的水分含量（11.60 g/100 g）＜G酒曲（12.56 g/100 g），H窖內(nèi)酒醅上、下層的水分含量（56.10 g/100 g、55.80 g/100 g）＞G窖內(nèi)酒醅上、下層（54.85 g/100 g、49.85 g/100 g）；H酒曲的總酸含量（1.58 g/kg）＜G酒曲（2.25 g/kg），H窖內(nèi)酒醅上、下層的總酸含量（6.29 g/kg、6.71 g/kg）＞G窖內(nèi)酒醅上、下層（5.43 g/kg、5.19 g/kg）；H酒曲的氨基酸態(tài)氮含量（0.34 g/100 g）＜G酒曲（0.42 g/100 g），H廠的窖內(nèi)酒醅上、下層的氨基酸態(tài)氮均為0.17 g/100 g，介于G廠上、下層窖內(nèi)酒醅（0.18 g/100 g、0.15 g/100 g）之間。

2.2 酒曲、窖內(nèi)酒醅中揮發(fā)性成分的測定

兩醬香型酒廠的酒曲、窖內(nèi)酒醅中揮發(fā)性成分的總離子流圖見圖1，測定結(jié)果見表2。

圖1 G窖內(nèi)酒醅上層揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of the volatile components in the upper layer of fermented grains from pit G

通過HS-SPME-GC-MS從兩醬香型酒廠酒曲和窖內(nèi)酒醅共6個樣品中檢測到105種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。由表2可知，6個樣品共有的揮發(fā)性風(fēng)味成分有乙醛、3-甲基丁醛、乙醇、乙酸乙酯，且乙醇在各個樣品中的相對含量最高。

2.2.1 酒曲、窖內(nèi)酒醅風(fēng)味物質(zhì)的變化

高溫制曲為醬香風(fēng)味的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。由表2可知，H酒曲含有大量的烷烴類物質(zhì)（35.09%），G酒曲含有大量的醛（4.74%）、酮（1.84%）、酯（14.36%）、吡嗪類物質(zhì)（27.01%）；H窖內(nèi)酒醅的醇類物質(zhì)相對含量（114.61%）高于G窖內(nèi)酒醅（62.11%），而G窖內(nèi)酒醅的酯類物質(zhì)相對含量（116.70%）高于H窖內(nèi)酒醅（73.16%），說明H酒曲對醇類物質(zhì)的生成貢獻較大，而G酒曲對酯類物質(zhì)的生成貢獻較大。

表2 6個樣品的揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量Table 2 Types and contents of the volatile components in 6 kinds of samples

續(xù)表

兩醬香型酒廠的酒曲與窖內(nèi)酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相比較，H酒曲醛類物質(zhì)相對含量為3.46%，高于H窖內(nèi)酒醅上、下層（2.48%、0.92%），G酒曲醛類物質(zhì)相對含量為4.74%，高于G窖內(nèi)酒醅上、下層（2.20%、0.44%）；H酒曲烷烴類物質(zhì)相對含量為35.09%，高于H窖內(nèi)酒醅上、下層（1.25%、0.90%），G酒曲烷烴類物質(zhì)相對含量為14.82%，高于G窖內(nèi)酒醅上、下層（1.61%、0.17%）；H酒曲醇類物質(zhì)的相對含量為8.10%，低于H窖內(nèi)酒醅上、下層（42.35%、72.26%），G酒曲醇類物質(zhì)的相對含量為28.55%，低于G窖內(nèi)酒醅上層42.88%；在H、G廠的酒曲中未檢測到酸類物質(zhì)，但其窖內(nèi)酒醅中含有酸類物質(zhì)；H酒曲酯類物質(zhì)的相對含量為5.81%，低于H窖內(nèi)酒醅上、下層（48.36%、24.79%），G酒曲酯類物質(zhì)相對含量為14.36%，低于G窖內(nèi)酒醅上、下層（46.98%、69.72%）?？梢妰删茝S酒曲中的醛類、烷烴類物質(zhì)的相對含量高于其窖內(nèi)酒醅，而醇類、酸類、酯類物質(zhì)的相對含量低于其窖內(nèi)酒醅。在G酒曲中相對含量低的酮類和相對含量高的吡嗪類物質(zhì)只在上層窖內(nèi)酒醅中少量存在。由此可知，酒曲中含有的各種物質(zhì)，在經(jīng)過發(fā)酵作用后，烷烴類物質(zhì)經(jīng)微生物代謝產(chǎn)生酸類物質(zhì)，而醛類、酮類物質(zhì)經(jīng)氧化作用轉(zhuǎn)化成醇類、酸類物質(zhì)，再經(jīng)酯化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)，從而使窖內(nèi)酒醅的酸、醇、酯類物質(zhì)相對含量增加、種類豐富。

2.2.2 兩酒廠酒曲風(fēng)味物質(zhì)的差異

從H酒曲中共檢測到24種風(fēng)味成分，主要以烷烴類為主，其中以十一烷的相對含量最高，為13.05%。G酒曲中檢測到24種風(fēng)味成分，主要以吡嗪類、醇類為主，分別以2,3,5,6-四甲基吡嗪（25.48%）、1,3-丁二醇（16.95%）的相對含量最高。2,3,5,6-四甲基吡嗪具有烘烤花生、榛子和可可的香氣，還有治療心血管疾病、改善學(xué)習(xí)障礙等作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)2,3,5,6-四甲基吡嗪在醬香型白酒吡嗪類物質(zhì)中含量最高，因此被認(rèn)為可能是醬香型白酒中重要的香味物質(zhì)。范文來等[15]研究指出，吡嗪類化合物不是醬香物質(zhì)的主體香或關(guān)鍵香氣成分，但它卻是醬香型白酒的特征成分，是白酒的健康因子。雖然H、G酒曲之間檢測到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量相等，但H酒曲除烷烴類物質(zhì)外，其醛類、醇類、酯類物質(zhì)相對含量均低于G酒曲，且H酒曲不含酮類、吡嗪類物質(zhì)。說明即使同是醬香型白酒生產(chǎn)大曲，但不同酒廠的大曲所含揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量差異較大。

兩酒廠酒曲共性的揮發(fā)性風(fēng)味成分有8種，分別為乙醛、異丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、乙醇、乙酸乙酯、4,8-二甲基-4-（E）,8（E）-癸二烯內(nèi)酯和十一烷。其中，以十一烷的相對含量最高，在H、G酒曲中分別達(dá)到13.05%、11.91%，表明十一烷是酒曲中重要風(fēng)味物質(zhì)組成。研究表明乙醛與乙醇縮合，生成的乙縮醛是賦予白酒清香以及柔和感的重要風(fēng)味物質(zhì)，此外，乙縮醛和乙醛還具有明顯的提香和助香的作用[1，6]。8種共性成分在H、G酒曲的揮發(fā)性成分中占比分別為49.58%、26.12%。

2.2.3 兩酒廠窖內(nèi)酒醅風(fēng)味物質(zhì)的差異

H窖內(nèi)酒醅上層中共檢測到54種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要以醇類、酯類為主（醇酯相對含量之比為0.88），分別以乙醇（37.43%）、乳酸乙酯（17.41%）的相對含量最高。H窖內(nèi)酒醅下層中檢測到51種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要以醇類、酯類為主（醇酯相對含量之比為2.91），分別以乙醇（51.28%）、己酸乙酯（4.73%）的相對含量最高。乳酸乙酯和己酸乙酯分別是清香型、濃香型白酒的主體風(fēng)味物質(zhì)。

G窖內(nèi)酒醅上層中共檢測到59種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要以醇類、酯類為主（醇酯相對含量之比為0.91），分別以乙醇（33.91%）、棕櫚酸乙酯（10.67%）的相對含量最高。G窖內(nèi)酒醅下層中檢測到47種物質(zhì)，主要以醇類、酯類為主（醇酯相對含量之比為0.28），分別以己酸乙酯（29.72%）、乙醇（17.43%）的相對含量最高。

雖然4個窖內(nèi)酒醅樣的主要風(fēng)味物質(zhì)均以醇、酯類為主，但上層窖內(nèi)酒醅的主要酯類物質(zhì)不同，下層窖內(nèi)酒醅的醇酯比相差較大。與H窖內(nèi)酒醅下層相比，G窖內(nèi)酒醅下層含有大量的己酸乙酯，且其己酸的相對含量（6.40%）高于H窖內(nèi)酒醅下層（0.28%）。這可能是因為G酒廠的窖池使用的時間較長，含有大量的己酸菌，其代謝的己酸與乙醇進行酯化反應(yīng)，因此消耗較多的乙醇，而生成大量的己酸乙酯。醇酯比的不同可能是導(dǎo)致不同醬香型酒廠生產(chǎn)的白酒風(fēng)味差異的一個因素。

4個窖內(nèi)酒醅的共性風(fēng)味成分有23種，包括乙醛、3-甲基丁醛、乙醇、丙醇、2,3-丁二醇、乙酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯（菠蘿香）、乙酸異戊酯（具有香蕉及水果香）、丁酸丙酯、戊酸乙酯（蘋果香）、己酸乙酯（果香）、己酸丁酯、乙基苯乙酯、癸酸乙酯（水果香）、月桂酸乙酯（具有花果的芳香味）、肉豆蔻酸乙酯（具有椰子、油脂香味）、9-十六酸乙酯、十五酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯（花香、果香）、硬脂酸乙酯，其中亞油酸乙酯、油酸乙酯是醬香型白酒空杯香的主要成分，而亞油酸乙酯對高血壓、冠心病等血管疾病有較好的療效[2，16]。

23種共性揮發(fā)性風(fēng)味成分在H窖內(nèi)酒醅上層、下層、G窖內(nèi)酒醅上層、下層的風(fēng)味物質(zhì)中相對含量分別為72.81%、76.09%、77.03%、83.78%，推測這23種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可能是醬香型白酒風(fēng)味的骨架成分。胡峰等[9]對醬香型習(xí)酒不同層次酒體的風(fēng)味成分分析，同樣以酯類物質(zhì)居多，除乙醇、丙醇、2,3-丁二醇、乙酸異戊酯、乙基苯乙酯、9-十六酸乙酯、硬脂酸乙酯外，其余16種成分均在習(xí)酒中檢測到。此外，2-甲基丁醛、異戊醇、2,6-二甲基-4-庚醇、2-甲酸糠酯、乙酸己酯、苯乙烯、（Z）-3-十四烯僅在H窖內(nèi)酒醅中檢出，而仲丁醇、戊醇、3-甲基丁醇、2-甲基丁醇、異丁酸乙酯僅在G窖內(nèi)酒醅中檢出，窖內(nèi)酒醅所特有的風(fēng)味物質(zhì)可能與不同醬香酒廠生產(chǎn)的酒質(zhì)差異形成有關(guān)。

2.3 酒曲和窖內(nèi)酒醅揮發(fā)性成分的主成分分析

采用SPSS22.0軟件對兩醬香型酒廠的酒曲和窖內(nèi)酒醅中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進行主成分分析，第一主成分、第二主成分和第三主成分的方差貢獻率分別為55.12%、19.52%、和12.60%，累計貢獻率為87.23%（＞85%），說明已包含足夠的信息量，能夠反映樣品的整體信息量，可以用來進行后續(xù)分析。所得主成分的載荷矩陣見表3。

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Loading matrix of the principle components

主成分的載荷系數(shù)反映了樣品與樣品中各揮發(fā)性物質(zhì)對主成分的影響[17]。由表3可知，第一主成分反映的指標(biāo)主要有乙醇、乳酸乙酯，指向醇、酯類，并呈高度正相關(guān)，與己酸乙酯、十一烷呈高度負(fù)相關(guān)，對第一主成分貢獻最大的是乙醇，載荷量為9.14，貢獻最小的是己酸乙酯（-1.46）；第二主成分反映的指標(biāo)有己酸乙酯、棕櫚酸乙酯，主要指向酯類，并呈高度正相關(guān)，與1,2-丙二醇、乳酸乙酯呈高度負(fù)相關(guān)，對第二主成分貢獻最大的是己酸乙酯（8.89），貢獻最小的是1,2-丙二醇（-0.50）；第三主成分反映的指標(biāo)主要有十一烷、大根香葉烯，主要指向烷烴類，并呈高度正相關(guān)，與1,3-丁二醇、2,3,5,6-四甲基吡嗪呈負(fù)相關(guān)，對第三主成分貢獻最大的是十一烷（7.87），貢獻最小的是2,3,5,6-四甲基吡嗪（-1.30）。第一、二、三主成分反映的指標(biāo)乙醇、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、乳酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪等均是醬香型白酒的香氣骨架成分[18]。

取特征值＞1的主成分進行分析。以6個樣品的第一主成分為橫坐標(biāo)，第二主成分為縱坐標(biāo)做散點圖，結(jié)果見圖2。圖2中每個點代表一個樣品，點之間的距離代表樣品之間的特征差異的大小，不同象限的點差異顯著，同一象限內(nèi)的點越接近，表明其香氣組成及含量的相似度越高[19]。

圖2 6個樣品的主成分散點圖Fig.2 Scatter plot of the principal components in 6 kinds of samples

由圖2可知，酒曲樣和窖內(nèi)酒醅樣在不同的象限，說明兩者的風(fēng)味物質(zhì)差異顯著，且酒曲和窖內(nèi)酒醅能很好的區(qū)分開來。兩酒廠的窖內(nèi)酒醅上層點最近，說明不同醬香型酒廠窖內(nèi)酒醅上層的揮發(fā)性風(fēng)味成分相似度高。H酒廠窖內(nèi)酒醅下層與兩個酒廠的窖內(nèi)酒醅上層距離較近，而G酒廠窖內(nèi)酒醅下層與兩個酒廠的窖內(nèi)酒醅上層較遠(yuǎn)，說明H醬香型酒廠的窖內(nèi)酒醅上、下層的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵過程中差異不大，而G醬香型酒廠的窖內(nèi)酒醅上、下層的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化較大，這可能與窖使用時間，即窖齡長短有關(guān)，不同窖齡的窖內(nèi)優(yōu)勢發(fā)酵微生物菌群有差異，對酒醅內(nèi)的風(fēng)味物質(zhì)形成有影響[20]。

3 結(jié)論

通過對兩個醬香型酒廠酒曲、第四輪次窖內(nèi)酒醅的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、共性揮發(fā)性風(fēng)味成分、各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量的分析表明，兩個醬香型酒廠中共檢測到105種揮發(fā)性風(fēng)味成分，共性成分為4種。H酒曲以烷烴類為主要風(fēng)味物質(zhì)，G酒曲則以醇類、吡嗪類為主，共性成分為8種，分別在H、G酒曲中的相對含量為49.58%、26.12%。H、G窖內(nèi)酒醅上、下層均以醇、酯類為主要風(fēng)味物質(zhì)，共性成分為23種，但上層窖內(nèi)酒醅的主要酯類物質(zhì)不同，下層窖內(nèi)酒醅的醇酯比相差較大。對兩酒廠的酒曲和窖內(nèi)酒醅中主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的主成分分析結(jié)果表明，乙醇、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、乳酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪等物質(zhì)均是醬香型白酒的香氣骨架成分。兩酒廠的酒曲和窖內(nèi)酒醅樣中的揮發(fā)性成分具有較大差異。兩醬香型酒廠窖內(nèi)酒醅上層的揮發(fā)性風(fēng)味成分種類相似度高，下層的揮發(fā)性風(fēng)味成分種類具有差異性，H窖內(nèi)上、下層酒醅所含揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類相近，而G窖內(nèi)上、下層酒醅所含揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類差異較大。