創(chuàng)傷弧菌FrsA蛋白的純化及生化表征

鮑玲玲，李至敏，王小琴，湯亞蘭，許文武，李志敏*

(1．江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院，江西 南昌 330045；2．江西農(nóng)業(yè)大學 理學院，江西 南昌 330045)

創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)是一種嗜鹽革蘭氏陰性細菌，多存在于溫帶沿海地區(qū)的軟體貝類體內(nèi)[1]，該菌屬于條件致病菌，在合適的條件下會感染魚和人類[2]。人類感染創(chuàng)傷弧菌主要是通過生食帶有該菌的海鮮或傷口接觸了帶菌的海水，從而導(dǎo)致腸胃炎、原發(fā)性敗血癥、慢性肝炎或肝硬化、軟組織感染等疾病[3-4]。創(chuàng)傷弧菌的生物多樣性復(fù)雜，可分為3大類型，其中生物類型Ⅰ普遍感染人類[5]，生物類型Ⅱ主要感染魚類貝類[6]，生物類型Ⅲ于1996年首次在以色列被分離得到，是由來源于自然環(huán)境的類型Ⅰ和其他細菌通過基因重組進化而來[7-8]。

在大腸桿菌中， FrsA蛋白通過和去磷酸化的IIAGlc蛋白結(jié)合可以提高葡萄糖的發(fā)酵水平[9]。研究表明，當用葡萄糖作為碳源時，敲除FrsA基因會提高大腸桿菌的呼吸水平，而過表達FrsA基因會提高發(fā)酵導(dǎo)向的代謝水平[9]。盡管FrsA蛋白在葡萄糖代謝方面具有生理意義，但有關(guān)重組FrsA蛋白的體外生化功能的研究報道較少。2011年，Lee等[10]首次表達純化了創(chuàng)傷弧菌的FrsA蛋白(VvFrsA)，并研究了重組VvFrsA蛋白的體外生化功能，發(fā)現(xiàn)VvFrsA可在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行可溶性表達，同時VvFrsA是一種不依賴于焦磷酸硫胺素(TPP)輔因子的丙酮酸脫羧酶，在體外能夠催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛和二氧化碳[10]。然而，Kellet等[11]指出，VvFrsA蛋白并不是一種丙酮酸脫羧酶，當以丙酮酸作為底物時，并未檢測到乙醛和二氧化碳的產(chǎn)生。與此同時，計算化學的研究也證明，重組VvFrsA蛋白不具備丙酮酸脫羧功能[11]。目前，僅有乳清苷5′-單磷酸脫羧酶和2-氧-4-羥基-4-羧基-5-脲基咪唑啉脫羧酶等兩類不依賴輔因子的脫羧酶被報道[12-13]。因此，重組VvFrsA蛋白的體外生化功能依然存在爭議。

通過氨基酸序列同源比對發(fā)現(xiàn)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中和VvFrsA的氨基酸序列同源的蛋白質(zhì)大多數(shù)被標注為酯酶。此外，已有的重組VvFrsA蛋白的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明，VvFrsA中存在α/β水解酶結(jié)構(gòu)域[10-11]。因此，筆者猜測重組VvFrsA蛋白可能具有催化某些酯類水解功能。為了驗證這一假設(shè)，本研究通過分子生物學手段將化學法合成的VvFrsA基因連接到pET-28a載體上，構(gòu)建了pET28a-VvFrsA表達質(zhì)粒，探究了VvFrsA蛋白的表達條件及純化步驟，并初步闡明了其作為酯酶的催化特性，為進一步探索VvFrsA蛋白的體外生化特征奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

創(chuàng)傷弧菌的FrsA基因(VvFrsA)由上海祥音生物技術(shù)有限公司合成；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞、表達載體pET-28a由江西農(nóng)業(yè)大學生物化學與分子生物學實驗室保存；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶、5k核酸Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)Marker購自Thermo Scientific公司；對硝基苯酚乙酸酯(pNPA)、對硝基苯酚丁酸酯(pNPB)和對硝基苯酚棕櫚酸酯(pNPP)均為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pET28a-VvFrsA質(zhì)粒構(gòu)建 化學法合成包含NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點的VvFrsA基因。該基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，利用瓊脂糖凝膠回收片段，將該片段與同樣酶切的pET-28a載體用T4連接酶在16 ℃下過夜連接。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，用含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板培養(yǎng)基篩選陽性克隆。將陽性克隆提取質(zhì)粒后用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,驗證陽性克隆并送檢測序。

1.2.2 重組VvFrsA蛋白的誘導(dǎo)表達與純化 將測序正確的pET28a-VvFrsA質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)中，挑取陽性單克隆點接種于含卡那霉素終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，次日按1%的接種量接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約為0.6時，立即冰水浴30 min，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，于25 ℃、180 r/min的培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)表達24 h。然后于4 ℃、5 000 r/min離心15 min收集菌體。將菌體用10倍體積的20 mmol/L PBS緩沖液重懸后于冰水浴中超聲破碎，然后于4 ℃、12 000 r/min離心破碎后的細胞全菌液2 h。將經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后的上清液樣品流穿事先用結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5)平衡好的Ni-NTA柱，隨后用含20～200 mmol/L咪唑的緩沖液進行濃度梯度洗脫，分別收集每個濃度的洗脫液進行SDS-PAGE檢測目的蛋白。合并含有重組VvFrsA蛋白的洗脫液，濃縮脫鹽處理，最終得到的VvFrsA蛋白用Bradford方法進行定量。

1.2.3 重組VvFrsA蛋白底物特異性測定 重組VvFrsA蛋白對pNPA、pNPB和pNPP 3種對硝基苯酚脂肪酸酯底物的催化活性根據(jù)Vorderwülbecke等[14]提出的酯酶檢測方法適當修改后測定。首先將上述3種底物分別溶解于異丙醇中構(gòu)成溶液1，底物濃度均為1 mmol/L。同時配置含有0.4%Triton X-100的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.5)構(gòu)成溶液2。測定前將溶液1和2均置于37 ℃恒溫水浴。測定時將溶液1和溶液2按1∶9的比例混合后加入終濃度為20 μmol/L的重組VvFrsA蛋白，于37 ℃開始反應(yīng)，使用紫外分光光度計連續(xù)監(jiān)測410 nm處吸收值。根據(jù)對硝基苯酚在410 nm處的摩爾消光系數(shù)計算生成的產(chǎn)物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-VvFrsA表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將從陽性單克隆菌落中提取的重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)2個條帶，如圖1所示，接近5 000 bp的大片段為pET-28a載體片段，小片段基因約為1 200 bp，與VvFrsA基因理論大小(1 248 bp)相符?；驕y序發(fā)現(xiàn)該1 200 bp片段基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄號為HM172799的FrsA基因序列一致。可見，成功構(gòu)建了pET28a-VvFrsA重組表達質(zhì)粒。

M：5k核酸Marker；1：pET28a-VvFrsA表達

2.2 重組VvFrsA蛋白的表達與純化

VvFrsA基因的堿基數(shù)為1 248 bp，編碼含有415個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)測其分子質(zhì)量為47.014 ku，與圖2中泳道1、2、3中條帶基本一致。由圖2可知，重組VvFrsA蛋白的表達量較高，且在上述表達條件下重組蛋白的溶解性較好。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：細胞破碎液全菌；

將含有目的蛋白的上清液用Ni-NTA親和層析柱純化。用含有20～200 mmol/L咪唑的緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH值為7.5)進行洗脫(圖3)。當咪唑濃度增加到80 mmol/L時，有少量重組VvFrsA蛋白被洗脫。然后用含200 mmol/L咪唑的緩沖液將重組VvFrsA蛋白全部洗脫。合并圖3中泳道8—9的洗脫液后濃縮脫鹽，得到純度大于95%的重組VvFrsA蛋白。用Bradford方法對濃縮后的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度進行測定，最終得到蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為20 mg/mL，蛋白質(zhì)回收率約為15 mg/g菌體。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：離心后上清液；2：流穿液；

2.3 重組VvFrsA蛋白的底物特異性

按照上述測定方法，當分別用pNPA、pNPB和pNPP作為底物時，加入重組VvFrsA蛋白后，反應(yīng)體系在410 nm處的吸收值逐漸增加。由此可知，重組VvFrsA蛋白可以催化pNPA、pNPB和pNPP 3種對硝基苯酚脂肪酸酯的水解反應(yīng)，生成對硝基苯酚。由圖4可知，當用pNPA作為底物時，重組VvFrsA蛋白的催化活性最高。重組VvFrsA蛋白催化pNPB、pNPP水解的活性分別是催化pNPA水解活性的75%、22%?？梢?，重組VvFrsA蛋白傾向于催化對硝基苯酚短鏈脂肪酸酯水解。

圖4 重組VvFrsA蛋白催化不同底物的相對活性

3 結(jié)論與討論

首個被報道的FrsA蛋白來自于大腸桿菌[9]。研究人員發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中FrsA蛋白以1∶1的比例特異性地結(jié)合去磷酸化的IIAGlc蛋白形成復(fù)合物，從而調(diào)控細胞中葡萄糖的發(fā)酵水平[9]。盡管FrsA蛋白在大腸桿菌中的生理功能已被闡明，然而FrsA蛋白的體外生化功能依然不清楚。

本研究將構(gòu)建的pET28a-VvFrsA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達，成功實現(xiàn)了重組VvFrsA蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達。通過Ni-NTA親和層析法一步純化得到純度較高的重組VvFrsA蛋白。

一般認為，丙酮酸脫羧酶的催化活性依賴于TPP輔因子[15]。Lee等[10]研究表明，VvFrsA蛋白是一個不依賴TPP輔因子的丙酮酸脫羧酶。這一發(fā)現(xiàn)顛覆了傳統(tǒng)的對于丙酮酸脫羧酶的認識。本研究以丙酮酸為反應(yīng)底物時，沒有檢測到VvFrsA在體外具有催化丙酮酸脫羧生成乙醛和二氧化碳的活性。進一步的酶催化活性研究發(fā)現(xiàn)，VvFrsA蛋白是一個酯酶，可以催化對硝基苯酚脂肪酸酯的水解，其最適底物是對硝基苯酚短鏈脂肪酸酯。這一發(fā)現(xiàn)與VvFrsA蛋白的晶體結(jié)構(gòu)特征及氨基酸序列比對結(jié)果相一致。研究表明，VvFrsA蛋白具有酯酶的催化三聯(lián)體[16-18]，并且pNPA可以在VvFrsA的活性中心穩(wěn)定存在長達300 ns(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本研究結(jié)果為后續(xù)對重組VvFrsA蛋白進行生化表征和對硝基苯酚乙酸酯水解的酶動力學與催化機制奠定了基礎(chǔ)。