新型畜禽免疫增強劑天花粉多糖的制備工藝優(yōu)化

諶馥佳，沈澤鈺，管 玉，李 納，崔霄霄，葉建春，燕照玲，李恩中*

(1.黃淮學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000； 2.信陽師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 信陽 464000； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002)

當(dāng)前各種畜禽細(xì)菌、病毒和寄生蟲等引起的感染性疾病依然是限制現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素[1]。隨著現(xiàn)代獸醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)許多動物疾病都與機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的失調(diào)或缺陷有密切的聯(lián)系。所以在動物疾病的預(yù)防中，提高機(jī)體的免疫力和增強抵抗力得到重視。免疫增強劑可提高機(jī)體細(xì)胞的抵抗力及體液免疫能力，臨床上一般和各種疫苗聯(lián)合使用，可以提高機(jī)體對抗原的特異性免疫反應(yīng)，增強免疫力[2]。近年來從中藥中開發(fā)的天然產(chǎn)物越來越多地運用到獸藥開發(fā)領(lǐng)域，其中就包括這些天然的免疫增強劑。比如殼聚糖聯(lián)合新城疫疫苗對SPF雛雞進(jìn)行免疫，提高了雛雞脾臟抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強了黏膜抵抗能力[3]。人們研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖是中藥獸藥中重要的免疫活性物質(zhì)，主要具有調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、白細(xì)胞介素以及提高抗體水平等功能，是當(dāng)今畜禽免疫增強劑研究的方向。天花粉，別名栝樓根，為葫蘆科植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)或雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)的干燥根[4]。天花粉多糖的免疫調(diào)節(jié)功能已被報道[5]，若要進(jìn)一步開發(fā)天花粉多糖為新型畜禽免疫增強劑，需要更加成熟的生產(chǎn)工藝。當(dāng)前天花粉多糖提取主要運用的是傳統(tǒng)的水浴浸提法[6]，該方法存在工藝繁雜、生產(chǎn)周期較長、溶劑耗量比較大、生產(chǎn)成本較高和提取效率比較低等缺點，因此限制了其工業(yè)化生產(chǎn)和大范圍臨床應(yīng)用。近幾年的研究表明，采用超聲波輔助水浴法提取植物多糖，可以減少提取時間、增高提取效率、降低生產(chǎn)成本，并且還可有效降低多糖的降解和多糖活性的損失[7]。為此，運用超聲波輔助水浴法提取天花粉多糖，在固定超聲功率條件下，研究超聲溫度、時間和液料比對多糖得率的影響，通過Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化天花粉多糖超聲輔助提取的工藝參數(shù)，并考察了天花粉多糖對肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響，為新型畜禽免疫增強劑天花粉多糖的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要藥品與試劑

天花粉藥材為市售，無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)、無水乙醇(鄭州凱圣化工有限公司)、蒽酮(上海源葉生物科技有限公司)、硫酸(焦作市鑫海隆有限公司)等試劑均為分析純。

1.2 儀器

紫外-可見分光光度計(UV-mini1240，日本島津公司)、電子分析天平(FA2004，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、超聲清洗儀(VGT-2013QT，深圳威固科技有限公司)、酶標(biāo)儀(DNM-9602G，北京普朗新技術(shù)有限公司)等。

1.3 天花粉多糖的提取和計算方法

1.3.1 天花粉多糖的提取 選取一定量的天花粉藥材，烘干后粉碎，精確稱取1 g天花粉藥粉，采用超聲輔助水浴浸提法提取2次，過濾，合并濾液，濃縮后定容，測定提取液中多糖含量。

1.3.2 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取于105 ℃干燥至恒質(zhì)量的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20.14 mg，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并且稀釋至刻度，搖晃均勻，配成質(zhì)量濃度為0.201 4 mg/mL 的葡萄糖溶液。準(zhǔn)確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加水至標(biāo)準(zhǔn)刻度，搖晃均勻。準(zhǔn)確量取上述溶液各1.0 mL，置于具塞試管中，加0.1% 蒽酮-硫酸溶液5.0 mL，搖晃均勻，水浴放置10 min，然后取出，用流水冷卻，在室溫下放置10 min。以相應(yīng)試劑作為空白對照，用紫外-可見分光光度計在625 nm位置測定其吸光度，然后用質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)(x)，吸光度作為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

1.3.3 天花粉多糖得率測定 取10 mL天花粉提取液，利用蒽酮-硫酸法測定，按照多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出天花粉多糖的質(zhì)量濃度。天花粉多糖得率的計算公式為：

其中，C為天花粉提取液多糖的質(zhì)量濃度，V為天花粉提取液的體積，W為干樣品的質(zhì)量。

1.4 天花粉多糖提取單因素試驗

1.4.1 提取溫度 固定液料比為30 mL/g，提取時間為30 min，提取功率為固定功率200 W，每管中加入0.5 g天花粉藥粉，分別以不同的溫度(40、50、60、70、80 ℃)進(jìn)行超聲輔助提取，重復(fù)3次，計算多糖得率。

1.4.2 提取時間 選取最適超聲溫度，固定液料比為30 mL/g，提取功率為固定功率200 W，每管中加入0.5 g天花粉藥粉，分別以不同時間(10、20、30、40、50 min)進(jìn)行超聲輔助提取，重復(fù)3次，計算多糖得率。

1.4.3 液料比 選取最適溫度和時間，提取功率為固定功率200 W，每管中加入0.5 g 天花粉藥粉，分別以不同的液料比(10、20、30、40、50 mL/g)進(jìn)行超聲輔助提取，重復(fù)3 次，計算多糖得率。

1.5 天花粉多糖提取響應(yīng)面試驗

依照Box-Behnken試驗設(shè)計的原理，選定超聲提取的溫度、時間、液料比3個因素作為自變量，各單因素試驗結(jié)果中的最佳條件為中心點，天花粉多糖得率作為響應(yīng)值，運用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，以優(yōu)化多糖提取的條件參數(shù)。分別以A、B、C表示超聲提取的溫度、時間、液料比，編碼1、0、-1代表自變量的高、中、低水平，對應(yīng)多糖得率Y為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平

1.6 天花粉多糖的動物免疫試驗

1.6.1 天花粉精制多糖制備 將1.3.1中所得提取濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至適宜濃度，加入4倍體積乙醇(體積分?jǐn)?shù)80%)，低溫靜置24 h，制取粗多糖。采用Sevage試劑法除去粗多糖中的蛋白質(zhì)。將樣品放置冰箱內(nèi)低溫透析48 h，冷凍干燥，得天花粉精制多糖。

1.6.2 試驗設(shè)計與動物飼養(yǎng) 選擇150只1 日齡的艾維茵肉仔雞，隨機(jī)分為3 組，每組設(shè)5 個重復(fù)，每個重復(fù)10 只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，其養(yǎng)分含量符合美國國家委員會(NRC)標(biāo)準(zhǔn)[9]。試驗組1、2飼料分別為基礎(chǔ)飼料加0.1%天花粉多糖、基礎(chǔ)飼料加0.3%天花粉多糖。試驗雞從1 日齡起，均采取自由采食、飲水等常規(guī)飼養(yǎng)管理方法。飼養(yǎng)試驗期為42 d。

1.6.3 免疫器官指數(shù)測定 試驗結(jié)束時，每組隨機(jī)抽取4只雞稱空腹活體質(zhì)量，頸部放血后屠宰，摘取脾臟、胸腺、法氏囊，剔除附著組織,用吸水紙拭去表面液體，準(zhǔn)確稱質(zhì)量，計算胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)[10]。免疫器官指數(shù)(g/kg)=器官質(zhì)量/活體質(zhì)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，回歸方程為y=0.004 3x+0.009 3，R2=0.994 6。無水葡萄糖質(zhì)量濃度在0～120.84 μg/mL內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于多糖含量的測定。

圖1 多糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 天花粉多糖提取單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取溫度對多糖得率的影響 從圖2可知，當(dāng)溫度在40～60 ℃時，天花粉多糖的得率隨著提取溫度的升高而逐漸升高，當(dāng)溫度為60 ℃時，多糖的得率達(dá)最大值3.21%，之后隨著溫度的升高，天花粉多糖的得率反而降低，這可能是由于高溫破壞了天花粉多糖的組成結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致部分水解變成單糖等小分子物質(zhì)或其他成分[11]，從而改變了天花粉多糖的得率。

圖2 溫度對天花粉多糖得率的影響

2.2.2 提取時間對多糖得率的影響 由圖3可以看出，超聲時間的長短對天花粉多糖的得率有較大的影響。隨著超聲時間的增加，多糖得率逐漸升高，當(dāng)超聲提取時間為30 min時，天花粉多糖得率最高為3.32%，之后隨著時間的增加多糖得率逐漸下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)提取的時間較短時，多糖溶解不夠完全，在提取時間較長時，溶解的一部分多糖又會逐漸分解，進(jìn)而導(dǎo)致多糖的得率略有下降[4]。所以確定天花粉多糖的最佳提取時間是30 min。

圖3 時間對天花粉多糖得率的影響

2.2.3 液料比對多糖得率的影響 從圖4 可以看出，隨著液料比的升高，天花粉多糖的得率逐漸增高，當(dāng)液料比在30 mL/g時多糖得率最高為3.28%；然后隨著液料比的逐漸升高，多糖得率略有降低，這是由于隨著液料比的升高，溶劑用量增加，雜質(zhì)的溶解量也逐漸增加?？傮w考慮經(jīng)濟(jì)因素和后續(xù)工藝的簡化，得出最佳液料比是 30 mL/g。

圖4 液料比對天花粉多糖得率的影響

2.3 天花粉多糖提取響應(yīng)面試驗結(jié)果

選擇溫度、時間及液料比按表1進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，多糖得率結(jié)果見表2，利用Design Expert 8.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，各因素對天花粉多糖得率的影響程度從大到小依次為A>B>C，即溫度>時間>液料比。模擬的回歸方程為：Y=-13.067 00+0.457 45×A+0.164 85×B-4.65×103×C-2.5×105×AB+1.075×103×BC-2.25×104×AC-4.022 5×103×A2-2.572 5×103×B2-8.725×

104×C2。F模型=38.350，P模型<0.000 1，表明方程顯著；P失擬項=0.543 2>0.05，表明無失擬項的存在；決定系數(shù)R2=0.980 1，表明方程能較好地反映所選參數(shù)與響應(yīng)值之間的關(guān)系；變異系數(shù)CV=1.97%<5%，說明方程具有良好的重現(xiàn)性。此外，PredR2=0.858 9與調(diào)優(yōu)R2=0.954 6較好吻合。

由表3還可以看出，提取溫度(A)對天花粉多糖的得率有顯著影響，提取時間(B)和液料比(C)對天花粉多糖得率的影響不顯著。溫度和時間(AB)、時間和液料比(BC)的相互項影響不顯著，而溫度和液料比(AC)的相互項影響顯著，這表明溫度和時間、時間和液料比的相互作用對天花粉多糖得率均無顯著影響。A2和B2對天花粉多糖得率的影響極顯著，C2對天花粉多糖得率的影響顯著，說明對天花粉多糖得率影響的顯著程度為：A2>C2，B2>C2。

表2 天花粉多糖提取響應(yīng)面試驗結(jié)果

表3 天花粉多糖提取二次多項式模型的方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

利用Design Expert 8.0軟件分析二次多項式模型，將回歸方程中的任意一個因素固定在零水平，對另外2個因素繪制3D響應(yīng)面模型圖(圖5—7)和2D等高線模型圖(圖8—10)，二者可以直觀地反映得率和各變量之間的相互關(guān)系。3D響應(yīng)面模型圖中曲面越陡峭，說明相互項對天花粉多糖的得率影響越顯著，其對應(yīng)等高線模型越接近橢圓。如果2D等高線模型是橢圓形，代表變量之間的相互影響顯著，如果是圓形，代表變量之間的相互影響不顯著[12]。因此，本試驗中溫度和液料比(AC)的相互項影響顯著，A、B、C兩兩之間的相互影響顯著順序是：AC>BC>AB。

圖5 溫度和時間交互作用的響應(yīng)面分析

圖6 溫度和液料比交互作用的響應(yīng)面分析

圖7 時間和液料比交互作用的響應(yīng)面分析

對回歸方程進(jìn)行分析，得到超聲輔助提取天花粉多糖的最佳條件是：溫度60.90 ℃、時間30.39 min、液料比30.94 mL/g，多糖得率為3.30%。在溫度60 ℃、時間30 min、液料比30 mL/g的提取條件下進(jìn)行驗證試驗，天花粉多糖的得率為3.29%，與模型預(yù)測最大響應(yīng)值(表2)吻合，表明模型合理有效。

圖8 溫度與時間交互作用的等高線模型

圖9 溫度與液料比交互作用的等高線模型

圖10 時間與液料比交互作用的等高線模型

2.4 天花粉多糖對肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響

由表4可以看出，與對照組相比，試驗組1、2的脾臟指數(shù)分別提高29.17%和34.72%(P<0.05)，胸腺指數(shù)分別提高5.67%(P>0.05)和15.98%(P<0.05),法氏囊指數(shù)分別提高6.49%和 10.27%(P>0.05)。結(jié)果表明，基礎(chǔ)飼料中添加天花粉多糖能顯著提高肉仔雞的免疫器官指數(shù)，尤其是脾臟指數(shù)，從而提高肉仔雞的免疫機(jī)能。

表4 天花粉多糖對肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響 g/kg

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

本研究運用單因素法和響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助水浴提取天花粉多糖工藝。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，將提取溫度、提取時間以及水與天花粉的液料比作為自變量，天花粉多糖的得率作為響應(yīng)值，做三因素三水平的響應(yīng)面回歸分析。通過分析各因素的顯著性和交互作用，獲得天花粉多糖提取的最佳工藝條件是：提取溫度60 ℃、提取時間30 min、液料比30 mL/g；此時天花粉多糖的得率為3.29%，與理論預(yù)測值無顯著差異。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化的天花粉多糖提取工藝穩(wěn)定可行，為天花粉多糖的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。進(jìn)一步對天花粉多糖進(jìn)行免疫學(xué)方面的試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，天花粉多糖能顯著提高肉仔雞的脾臟指數(shù),從而提高肉仔雞的免疫機(jī)能。

天花粉多糖具有免疫增強活性，本研究通過肉仔雞免疫試驗，比較了肉仔雞3種免疫器官指數(shù)，發(fā)現(xiàn)天花粉多糖能夠顯著提高肉仔雞的脾臟指數(shù)，這與蔣紅等[5]發(fā)現(xiàn)其能夠有效促進(jìn)小鼠脾臟免疫器官細(xì)胞增殖的結(jié)果一致。黃德尚等[13]把黃芪多糖作為佐劑聯(lián)合豬瘟疫苗使用，可明顯提高免疫仔豬血清γ-球蛋白、IgG、IgM和IgA的滴度。蔣偉明等[14]將馬尾藻多糖和豬繁殖與呼吸綜合征滅活抗原配制成疫苗用來免疫豬，結(jié)果表明，馬尾藻多糖佐劑組的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、T淋巴細(xì)胞CD3+亞群數(shù)量高于空白組和普通佐劑疫苗組，馬尾藻多糖可明顯提升免疫豬血清抗體活性。王凱等[15]通過抗體效價及白細(xì)胞吞噬試驗，證明杜仲多糖有增強三黃雞禽流感和新城疫疫苗免疫應(yīng)答的作用。天花粉活性多糖在畜禽免疫中的應(yīng)用與開發(fā)，還需要進(jìn)一步開展血清中抗體滴度和含量測定、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測定、病原抗體效價以及白細(xì)胞吞噬指數(shù)測定等相關(guān)驗證試驗。

理想的免疫增強劑不僅能提升抗原引發(fā)機(jī)體的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，還能促進(jìn)免疫受到抑制的機(jī)體恢復(fù)[1]；具有安全無毒特性，可以用作藥品、保健品或飼料添加劑不產(chǎn)生藥物殘留，以滿足綠色養(yǎng)殖的要求[16]；由于疫苗的劑型、免疫途徑及抗原種類的不斷變化，也要求免疫增強劑具有較為廣泛的適用性[17]。另外，質(zhì)量穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低、可大量生產(chǎn)也是免疫增強劑能夠推廣應(yīng)用的重要條件。超聲波輔助水浴浸提法提取植物多糖，可以明顯縮短提取時間、提高提取效率、降低生產(chǎn)成本，還可有效減少多糖的降解和多糖活性的損失，本研究運用單因素法和響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波輔助水浴提取天花粉多糖工藝，為天花粉多糖開發(fā)為畜禽免疫增強劑提供了條件。