強(qiáng)直性脊柱炎患者血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平與附著點(diǎn)病變的相關(guān)性研究

黃嫻倩 陳勇 應(yīng)銀燕 彭勇 干敏芝 耿保慶 朱夢(mèng)雅 應(yīng)穎

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確的慢性炎性關(guān)節(jié)炎，以骶髂關(guān)節(jié)炎、附著點(diǎn)炎及脊柱融合為特征[1]。炎癥、骨破壞、新骨形成是AS發(fā)展過程中3個(gè)典型病理改變[2]。附著點(diǎn)炎是AS病理改變過程的特征性改變。近年有研究表明，在AS炎性骨破壞過程中，某些炎性細(xì)胞因子并非直接參與破骨細(xì)胞的分化和激活，而是通過調(diào)節(jié)TNF-α、細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）、骨保護(hù)素（OPG）等分子間接發(fā)揮作用[3-4]。新近研究表明IL-34也參與了破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化[5]。

近年來，肌肉骨骼超聲廣泛應(yīng)用于患者肌腱、關(guān)節(jié)病變的評(píng)估。由于附著點(diǎn)部位表淺，同時(shí)高頻灰階超聲具有分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，操作者可觀察到附著點(diǎn)部位肌腱、軟骨及骨表面的細(xì)微改變。與MRI相比，肌肉骨骼超聲在觀察附著點(diǎn)肌腱結(jié)構(gòu)、滑囊炎及骨侵蝕等方面同樣敏感，且超聲對(duì)疾病早期附著點(diǎn)鈣化的發(fā)現(xiàn)優(yōu)于MRI[6-7]。目前超聲檢查聯(lián)合 TNF-α、RANKL、OPG 和IL-34血清學(xué)相關(guān)性分析的研究較少。本研究旨在通過檢測血清TNF-α、RANKL、OPG和 IL-34水平聯(lián)合超聲評(píng)估AS患者外周關(guān)節(jié)附著點(diǎn)病變，探討上述細(xì)胞因子與超聲評(píng)估附著點(diǎn)病變、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和臨床指標(biāo)的相關(guān)性，初步了解TNF-α、RANKL、OPG和 IL-34在AS患者骨破壞中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年1月1日至2018年1月1日在本院風(fēng)濕科住院或門診的AS患者21例作為AS組，所有患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）1984年修訂的紐約AS診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，Bath強(qiáng)直性脊柱炎病情活動(dòng)指數(shù)（BASDAI）≥4分，患者3個(gè)月內(nèi)均未進(jìn)行生物制劑、關(guān)節(jié)內(nèi)糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑治療，并排除感染、腫瘤及其他自身免疫性疾病。其中男6例，女15例；年齡14～78（44.48±19.77）歲。選取同期在本院風(fēng)濕科住院或門診的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者21例作為RA組，所有患者均符合ACR 1987年修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[9]，28個(gè)關(guān)節(jié)的疾病活動(dòng)度評(píng)分（DAS28）≥2.6 分。其中男 3 例，女 18 例；年齡 31～72（47.62±9.17）歲。選取同期在本院體檢中心體檢的健康者41例作為健康對(duì)照組，其中男15例，女26例；年齡23～80歲（46.24±17.79）歲。3組性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 血清TNF-α、RANKL、OPG和 IL-34水平檢測 收集所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血，以3 000r/min離心5min，取上清液分裝至試管后立即放入－80℃低溫冰箱保存?zhèn)錅y。嚴(yán)格按照 TNF-α、RANKL、OPG和 IL-34 ELISA試劑盒（上海橋杜生物科技有限公司，201803，96T）說明書進(jìn)行操作，采用ELISA法檢測血清TNF-α、RANKL、OPG和 IL-34水平。

1.3 超聲評(píng)估AS患者外周關(guān)節(jié)附著點(diǎn)病變情況 采用意大利百盛MyLabTMOne超聲診斷儀，線陣探頭，由一位經(jīng)過肌肉骨骼超聲正規(guī)培訓(xùn)的風(fēng)濕科醫(yī)師進(jìn)行超聲檢查。檢查部位參照臨床常見的外周附著點(diǎn)炎部位和格拉斯超聲附著點(diǎn)評(píng)分（GUESS）系統(tǒng)設(shè)定，包括跖底筋膜、跟腱止點(diǎn)、股四頭肌肌腱止點(diǎn)、股骨和脛骨內(nèi)外髁肌腱附著點(diǎn)、髕韌帶起點(diǎn)和止點(diǎn)。檢查跖底筋膜及跟腱止點(diǎn)，要求患者俯臥位，雙足屈曲 90°懸空置床邊緣；檢查股四頭肌肌腱止點(diǎn)、股骨和脛骨內(nèi)外髁肌腱附著點(diǎn)、髕韌帶起點(diǎn)和止點(diǎn)，要求患者仰臥位或坐位，膝關(guān)節(jié)屈曲30°、下肢伸展。對(duì)跖底筋膜、跟腱止點(diǎn)、股四頭肌肌腱止點(diǎn)、髕韌帶起點(diǎn)和止點(diǎn)采用GUESS進(jìn)行判讀，股骨和脛骨內(nèi)外髁韌帶附著點(diǎn)主要記錄附著部位骨侵蝕、骨贅、韌帶厚度改變、韌帶內(nèi)鈣化情況。每個(gè)部位分別行縱向及橫向掃查。然后采用能量多普勒觀察所有受檢附著點(diǎn)處血流分布情況。

1.4 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和臨床指標(biāo) 收集患者ESR、C反應(yīng)蛋白（CRP）等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及BASDAI、Bath強(qiáng)直性脊柱炎功能指數(shù)（BASFI）、Bath強(qiáng)直性脊柱炎計(jì)量指數(shù)（BASMI）、Maastricht強(qiáng)直性脊柱炎附著點(diǎn)炎評(píng)分（MASES）、強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)度評(píng)分（ASDAS）、夜間疼痛視覺模擬評(píng)分等臨床指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。采用ROC曲線分析RANKL和IL-34對(duì)AS的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組血清 TNF-α、RANKL、OPG 和 IL-34水平比較 AS組患者血清TNF-α、RANKL和 IL-34水平均高于RA組患者及健康對(duì)照組，血清OPG均低于RA組患者及健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表 1。

表1 3組血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平比較（pg/m l）

2.2 超聲檢查AS患者外周附著點(diǎn)病變情況 21例AS患者均發(fā)現(xiàn)肌腱端異常。GUESS評(píng)分中位數(shù)2（1～3）分，關(guān)節(jié)積液個(gè)數(shù)30個(gè)，骨侵蝕關(guān)節(jié)數(shù)29個(gè)，骨贅關(guān)節(jié)數(shù)15個(gè)，采集到能量多普勒信號(hào)關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)1個(gè)，存在附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)數(shù)30個(gè)。

2.3 AS患者血清 TNF-α、RANKL、OPG 和 IL-34水平與超聲評(píng)估AS患者外周關(guān)節(jié)炎附著點(diǎn)病變指標(biāo)相關(guān)性分析 AS患者血清RANKL和IL-34水平與超聲評(píng)估附著點(diǎn)骨侵蝕關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)（r=0.564和0.482，均P＜0.05）及附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)（r=0.634和0.545，均P＜0.05）均呈正相關(guān)，與GUESS評(píng)分、關(guān)節(jié)積液個(gè)數(shù)、骨贅關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)、采集到能量多普勒關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)均無相關(guān)性（均P＞0.05）。AS患者血清TNF-α和OPG水平與超聲評(píng)估附著點(diǎn)GUESS評(píng)分、關(guān)節(jié)積液個(gè)數(shù)、骨侵蝕關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)、骨贅關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)、采集到能量多普勒關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)、附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)均無相關(guān)性（均P＞0.05），見表2。

表2 AS患者血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平與超聲評(píng)估附著點(diǎn)病變的相關(guān)性（r值）

2.4 AS患者血清 TNF-α、RANKL、OPG 和 IL-34水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及臨床指標(biāo)相關(guān)性分析 AS患者血清IL-34水平與 BASDAI呈負(fù)相關(guān)（r=-0.454，P＜0.05），而與 ESR、CRP、BASFI、BASMI、MASES、ASDAS、夜間疼痛視覺模擬評(píng)分均無相關(guān)性（均P＞0.05）。AS患者血清 TNF-α、RANKL 和 OPG 水平與 ESR、CRP、BASDAI、BASFI、BASMI、MASES、ASDAS、夜間疼痛視覺模擬評(píng)分均無相關(guān)性（均P＞0.05），見表3。

表3 AS患者血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及臨床指標(biāo)的相關(guān)性（r值）

2.5 AS患者血清 TNF-α、RANKL、OPG 和 IL-34水平之間相關(guān)性分析 血清RANKL水平與血清OPG水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.461，P＜0.05），而兩者與血清 TNF-α、IL-34水平及血清TNF-α水平與血清IL-34水平均無相關(guān)性（均P＞0.05），見表 4。

2.6 ROC曲線分析 ROC曲線顯示血清RANKL和IL-34水平對(duì)診斷AS有較高的準(zhǔn)確性，AUC分別為0.994和0.941，均P＜0.05。當(dāng)血清RANKL水平≥125.85pg/ml，靈敏度為0.95，特異度為0.95；當(dāng)血清IL-34水平≥728.15pg/ml，靈敏度為0.95，特異度為0.73，見圖1。

表4 AS患者血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平之間的相關(guān)性（r值）

圖1 血清RANKL和IL-34水平診斷AS的ROC曲線

3 討論

AS是一種可嚴(yán)重影響骨平衡過程的炎癥性關(guān)節(jié)疾病。在AS早期，患者主要表現(xiàn)為炎性骨破壞，但隨著疾病進(jìn)展，患者可同時(shí)出現(xiàn)炎性骨破壞和異位骨形成。近年來，研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子在AS骨破壞的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

TNF-α是炎癥過程中最早產(chǎn)生的細(xì)胞因子之一，研究發(fā)現(xiàn)其參與AS骨破壞過程。本研究中AS組患者血清TNF-α高于RA組患者及健康對(duì)照組，其血清水平與 ESR、CRP、BASDAI、BASFI、BASMI、MASES、ASDAS、夜間疼痛視覺模擬評(píng)分均無相關(guān)性，與Gratacos等[10]報(bào)道一致。其血清水平與超聲評(píng)估附著點(diǎn)GUESS評(píng)分、關(guān)節(jié)積液個(gè)數(shù)、骨侵蝕關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)、骨贅關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)、采集到能量多普勒關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)、附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)均無相關(guān)性，提示其水平高低可能不能直接反映AS患者外周附著點(diǎn)病變的情況。

RANKL、OPG為調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性所必需，是造成炎性關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞最重要的影響因素。在RA患者和RA動(dòng)物模型中，許多證據(jù)表明RANKL/細(xì)胞核因子-κB受體活化因子（RANK）/OPG系統(tǒng)參與了局部的骨質(zhì)侵蝕。研究發(fā)現(xiàn)AS滑膜中活化的T細(xì)胞及滑膜成纖維細(xì)胞能夠產(chǎn)生RANKL，并與局部的骨質(zhì)侵蝕有關(guān)[11]。Mori等[12]在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠的局部關(guān)節(jié)通過原位雜交方法檢測RANKL、RANK及OPG的表達(dá)，也得到了類似的結(jié)論。本研究中AS組患者血清RANKL水平高于RA組患者及健康對(duì)照組，其水平與超聲評(píng)估附著點(diǎn)病變骨侵蝕關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)及附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)均呈正相關(guān)，同時(shí)ROC曲線顯示其AUC為0.994，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述理論，當(dāng)血清RANKL水平≥125.85pg/ml，靈敏度為0.95，特異度為0.95；這些提示血清RANKL水平升高可能可以作為反映AS患者存在附著點(diǎn)病變尤其是存在骨侵蝕的有用指標(biāo)。另外本研究中AS患者血清OPG水平低于RA組患者及健康對(duì)照組，而血清水平與超聲評(píng)估附著點(diǎn)GUESS評(píng)分、關(guān)節(jié)積液個(gè)數(shù)、骨侵蝕關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)、存在骨贅關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)、采集到能量多普勒關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)、附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)均無相關(guān)性，提示其水平高低可能不能直接反映AS患者外周附著點(diǎn)病變的情況。而血清 RANKL 和 OPG 水平與 ESR、CRP、BASDAI、BASFI、BASMI、MASES、ASDAS、夜間疼痛視覺模擬評(píng)分均無相關(guān)性義，提示兩者血清水平高低可能不能反映AS疾病的活動(dòng)。

IL-34發(fā)現(xiàn)于2008年，屬于IL家族，其功能類似于巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF），IL-34可與M-CSF受體結(jié)合，是破骨細(xì)胞主要的功能性細(xì)胞因子，與破骨細(xì)胞的活化增殖密切相關(guān)。研究表明IL-34參與破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化，具體表現(xiàn)為在RANKL存在的情況下，IL-34可誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞的體外增殖和黏附；同時(shí)，IL-34能發(fā)揮促炎作用，進(jìn)一步導(dǎo)致RA的骨破壞[13]。本研究中AS患者組血清IL-34水平高于RA組患者及健康對(duì)照組，其水平與超聲評(píng)估附著點(diǎn)病變骨侵蝕關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)及附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)均呈正相關(guān)，同時(shí)ROC曲線顯示其AUC為0.941，當(dāng)血清IL-34水平≥728.15pg/ml，靈敏度為0.95，特異度為0.73，提示血清IL-34水平可作為預(yù)測AS患者存在骨侵蝕的可靠指標(biāo)。其血清水平與 ESR、CRP、BASFI、BASMI、MASES、ASDAS、夜間疼痛視覺模擬評(píng)分均無相關(guān)性，雖然其與BASDAI呈負(fù)相關(guān)，但因BASDAI主觀因素較多，因此筆者仍認(rèn)為其水平高低可能不能直接反映AS疾病的活動(dòng)。鄔秀娣等[14]研究發(fā)現(xiàn)AS患者血清IL-34水平明顯升高，與本研究結(jié)果一致；他們的研究還發(fā)現(xiàn)血清IL-34水平與ESR、CRP均呈正相關(guān)，但本研究樣本量較小，該結(jié)論需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來證實(shí)。本研究對(duì)AS患者血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)血清RANKL水平與OPG水平呈負(fù)相關(guān)，而兩者與TNF-α、IL-34水平及血清TNF-α水平與IL-34水平均無相關(guān)性，提示RANKL、OPG與TNF-α、IL-34在AS骨質(zhì)破壞的病理過程中可能各自獨(dú)立發(fā)揮作用。筆者推測IL-34可能直接參與了AS患者破骨細(xì)胞的增殖和分化，其可能存在獨(dú)立于TNF-α的骨破壞機(jī)制，同時(shí)IL-34能在附著點(diǎn)部位發(fā)揮促炎作用，進(jìn)而促進(jìn)AS骨侵蝕的發(fā)生，尤其在局部的骨質(zhì)侵蝕中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，AS患者血清中存在較高水平的IL-34和RANKL，兩者血清水平可能可以作為反映AS患者存在附著點(diǎn)病變的有用指標(biāo)，尤其是預(yù)測AS患者骨侵蝕的可靠指標(biāo)，推測IL-34與RANKL參與了AS骨破壞的過程，是AS發(fā)生骨破壞病理改變過程中的重要因子，且兩者在AS骨質(zhì)破壞的病理過程中可能存在獨(dú)立的骨破壞機(jī)制，進(jìn)一步研究IL-34在AS骨破壞中的具體機(jī)制，可為AS治療提供新靶點(diǎn)。抑制IL-34有望成為TNF-α抑制劑治療無效的AS患者的新選擇。