降鈣素基因相關(guān)肽對高血壓性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響

葉挺宇 盧湧湧 潘悅 黃錫璽 楊宇 蔡健

高血壓是引起男性陰莖勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）的重要因素之一，臨床流行病學研究表明高血壓人群ED發(fā)病率高達24%～32%，是正常人群的2～3倍[1-2]。高血壓性ED的發(fā)生機制涉及多方面因素，其中陰莖海綿體平滑肌細胞（corpus cavernosum smooth muscle cells，CCSM）表型轉(zhuǎn)化學說是近年來提出的一個全新的研究方向。本課題組前期研究結(jié)果顯示高血壓大鼠CCSM中出現(xiàn)了細胞表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，即收縮型細胞表型標志物堿性調(diào)寧蛋白（calponin1，Cnn1）和合成型細胞表型標志物骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達水平發(fā)生了明顯變化[3]，這種轉(zhuǎn)化達到一定程度最終可能成為ED發(fā)生的機制之一[4]。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）是一種生物活性多肽，其主要作用包括擴張周圍血管、保護缺血心肌以及抑制平滑肌細胞增殖等[5]，在心血管領(lǐng)域的研究中已經(jīng)證實了CGRP可以逆轉(zhuǎn)血管平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)化[6-7]，那么CGRP對于高血壓性ED大鼠CCSM是否發(fā)揮著相似的作用？本研究將CGRP作用于高血壓大鼠CCSM，了解其對高血壓性ED大鼠CCSM表型轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 14周齡雄性SPF級自發(fā)性高血壓Wistar大鼠（SHR）20只（體質(zhì)量 180～250g）及其同系正常血壓健康大鼠（WKY）10 只（體質(zhì)量200～265g），由上海斯萊克實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2010-0005。所有大鼠飲自來水、飼普通大鼠飼料；置于溫度25～32℃，濕度60%～85%，12h晝夜交替環(huán)境中喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑 阿樸嗎啡、MTT、CGRP（美國Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)液、FBS（美國Hyclone公司）；兔抗大鼠平滑肌細胞α-肌動蛋白（α-SM-Actin）單克隆抗體（英國Abcam公司）；SABC免疫試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；DMSO（廣州威佳科技有限公司）；實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Select Master Mix（日本TOYOBO公司）

1.3 方法

1.3.1 體質(zhì)量和血壓測量 在同一時間由同一人對各組大鼠體質(zhì)量和血壓進行測量，其中大鼠血壓的測量方法是通過BP-2000大鼠無創(chuàng)血壓儀（由溫州醫(yī)科大學生理教研室提供）測量大鼠尾部動脈收縮壓。

1.3.2 大鼠勃起功能測定及分組 于大鼠頸部皮膚松弛處皮下注射阿樸嗎啡100μg/kg，觀察、記錄30min內(nèi)大鼠陰莖勃起次數(shù)，計數(shù)陰莖勃起的標準以陰莖體充血、膨大增長及露出末端陰莖為勃起1次。SHR大鼠中無陰莖勃起的歸為高血壓勃起功能障礙（HBP-ED）組，出現(xiàn)陰莖勃起的歸為高血壓（HBP）組，WKY大鼠歸為對照組。

1.3.3 大鼠CCSM的原代培養(yǎng)、鑒定及分組 斷頸椎處死大鼠，在75%乙醇溶液中浸泡約5min。無菌條件下切開皮膚，分離、切取陰莖組織，移入PBS中，剔除陰莖白膜、尿道、血管及周圍結(jié)締組織。將海綿體組織剪成1～2mm大小組織塊，按0.5cm的間隔放置到涂有20%FBS的無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置5h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊與培養(yǎng)液接觸。3～4d后見有較多細胞從組織塊游離出，剔除組織塊，細胞繼續(xù)培養(yǎng)至80%融合時，予以傳代。細胞傳代至第2代后，采用兔抗大鼠平滑肌細胞α-SM-Actin單克隆抗體標記CCSM，并經(jīng)免疫細胞化學染色鑒定。然后將CCSM分為HBPED組、HBP組和對照組3組，加入作用濃度為0（即以PBS液作為陰性對照試劑）、1、10和100nmol/L的CGRP，并進一步檢測CGRP作用后CCSM的活性及Cnn1和OPN mRNA的表達水平。

1.3.4 細胞活性檢測 采用MTT法。細胞按5×103/L密度接種于96孔板中，每孔體積200μl，各組細胞分別設(shè)置5個復孔，置于含0.5%FBS的DMEM液培養(yǎng)中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h。加入各濃度CGRP，繼續(xù)孵育48h。每孔再加入MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，吸出上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶完全溶解。采用酶標儀檢測各組CCSM在570nm處的吸光度（OD）值。細胞增殖抑制率（%）=（OD對照-ODCGRP）/OD對照×100%。

1.3.5 Cnn1和OPN mRNA表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR法。將各組細胞接種于50ml培養(yǎng)瓶，待細胞完全貼壁后，加入各濃度CGRP，繼續(xù)孵育48h。0.25%胰酶消化、吹打、重懸各組細胞，使用Trizol提取細胞總RNA，檢測RNA的含量和純度。所有引物均由上海Invitrogen（中國）公司設(shè)計合成。內(nèi)參基因為三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。OPN上游引物：5′-ACATCAGAGCCAGAGTT-3′，下游引物：5′-TACATGGTGTCTGCATG-3′；Cnn1 上 游 引 物 ：5′-ACACGCT －CAACGTCAGCTT-3′，下游引物：5′GCTCGTCCAGCTCTGGATAT 3′；GAPDH 上游引物：5′-GCCAGCCTCGTCTCATAGACA-3′，下游引物：5′-AGAGAAGGCAGCCCTGGTAAC-3′。按照SYBR Select Master Mix試劑盒說明書制備cDNA和PCR體系。PCR擴增條件：95℃預變性 3min、95℃變性 30s、60℃退火 30s、72℃延伸 30s，共40個循環(huán)。儀器自動進行熔解曲線分析。每個樣品中目的基因相對于空白對照組樣品的表達量以2-ΔΔCt表示。同一實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。計數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠實驗中情況 所有實驗大鼠中，SHR大鼠有1只在飼養(yǎng)過程中死亡，其余19只測量尾動脈收縮壓均在180mmHg以上；所有WKY大鼠尾動脈收縮壓均未超過140mmHg。SHR和WKY大鼠體質(zhì)量和血壓比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表1。

表1 SH R和W KY大鼠體質(zhì)量和血壓比較

2.2 大鼠勃起功能測定及分組結(jié)果 注射阿樸嗎啡30min后，SHR大鼠中有8只未見陰莖勃起，歸為HBPED組；其余11只SHR大鼠可見陰莖勃起，歸為HBP組。對照組10只WKY大鼠注射阿樸嗎啡后均能誘導出陰莖勃起。SHR大鼠勃起率為57.9%，明顯低于WKY大鼠的勃起率100.0%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 大鼠CCSM培養(yǎng)結(jié)果及鑒定 傳代至第2代的大鼠CCSM形態(tài)上呈梭形，SHR和WKY大鼠CCSM免疫細胞化學染色陽性率為（91.12±1.53）%，鏡下可見梭形平滑肌細胞淺黃色胞質(zhì)，其內(nèi)可見染成深黃色的肌動蛋白，結(jié)果提示經(jīng)原代培養(yǎng)所獲得的CCSM純度較高。

2.4 CGRP對細胞活性的影響 HBP-ED組、HBP組和對照組在不同濃度CGRP作用下增殖抑制率比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。CGRP對HBP-ED組、HBP組和對照組3組大鼠CCSM的增殖抑制率依次遞減，提示CGRP對高血壓性ED大鼠CCSM的抑制作用最明顯，見表2。3組大鼠CCSM在100nmol/L濃度下的增殖抑制率顯著高于在1和10nmol/L濃度下的增殖抑制率，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；但3組大鼠CCSM在1和10nmol/L濃度下的增殖抑制率比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），提示達到一定濃度后細胞增殖抑制率隨著CGRP濃度增加而升高，CGRP作用的最佳濃度可能是100nmol/L。

表2 CGRP對各組大鼠CCSM增殖抑制率比較（%）

2.5CGRP對Cnnl和OPN mRNA表達水平的影響 當CGRP作用的終濃度為1、10nmol/L時，3組大鼠CCSM的Cnnl和OPN mRNA表達水平與各自組內(nèi)0nmol/L濃度比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。當CGRP作用的終濃度為100nmol/L時，對照組Cnnl和OPN mRNA表達水平與組內(nèi)0nmol/L濃度比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但HBP組和HBP-ED組Cnnl mRNA表達水平較組內(nèi)0nmol/L濃度均上調(diào)（均P＜0.05），OPN mRNA表達水平較組內(nèi)0nmol/L濃度均下調(diào)（均P＜0.05），提示CGRP達到一定濃度（100nmol/L）后可使高血壓性ED大鼠CCSM表型從合成型向收縮型轉(zhuǎn)變，見表3。

表3 不同濃度CGRP對各組大鼠CCSM Cnn1和OPN m RNA表達水平的影響

3 討論

平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化這一概念最初是在對血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的研究中提出的，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，可以將VSMC分為收縮型和合成型兩種，當機體處于發(fā)育的不同階段或在疾病狀態(tài)下時，VSMC可從收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，同時細胞重新獲得增殖能力，這一系列變化過程即稱為表型轉(zhuǎn)化[8]。細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化及細胞獲得異常增殖能力最終可以導致血管重構(gòu)，這一病理變化是動脈粥樣硬化等血管病變發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。陰莖海綿體組織也具有平滑肌結(jié)構(gòu)，而且其功能與血管平滑肌相類似[9]，因此筆者認為兩者在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中存在著相似的病理學變化基礎(chǔ)。筆者在前期研究中已初步證實了在糖尿病、高血壓性ED動物模型的陰莖海綿體平滑肌組織中存在細胞表型轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，并與ED相關(guān)[4，10]。

CGRP是人類用分子生物學方法發(fā)現(xiàn)的第一個活性多肽，含有37個氨基酸，分子量3 786.91。人類的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中CGRP含量較高，心血管系統(tǒng)中也有廣泛分布的CGRP神經(jīng)纖維，此外在陰莖海綿體平滑肌及其血管周圍也有豐富的CGRP及其受體存在[11]。CGRP是目前已知的人體內(nèi)最強的舒血管物質(zhì)，具有強大的擴張周圍血管、心臟保護、神經(jīng)保護、痛覺調(diào)制、免疫調(diào)節(jié)和抑制平滑肌細胞增生等作用。在心血管系統(tǒng)疾病方面的研究中發(fā)現(xiàn)CGRP對人VSMC的增殖有抑制作用，并且其對VSMC的表型轉(zhuǎn)化有逆轉(zhuǎn)作用，即能夠驅(qū)動VSMC由合成型向收縮型轉(zhuǎn)化[6-7]。筆者的前期研究也已經(jīng)初步證實了在體外培養(yǎng)的糖尿病性ED大鼠CCSM模型中，CGRP可使該CCSM表型從合成型向收縮型轉(zhuǎn)化，即發(fā)生逆轉(zhuǎn)化[12]。

本研究立足于CCSM表型轉(zhuǎn)化在高血壓性ED發(fā)生機制中發(fā)揮著重要作用這一理論基礎(chǔ)，探討CGRP對高血壓性ED大鼠CCSM表型轉(zhuǎn)化的影響。首先，筆者采用不同濃度CGRP作用于高血壓性ED大鼠CCSM，發(fā)現(xiàn)不同濃度CGRP對高血壓性ED大鼠CCSM的增殖均有抑制作用，特別是在100nmol/L濃度下CGRP發(fā)揮的抑制作用尤為明顯。其次，比較各組表型標志物的表達水平，發(fā)現(xiàn)HBP-ED組Cnnl mRNA表達水平最低、OPN mRNA表達水平最高，從而在細胞水平證實了高血壓狀態(tài)下的CCSM存在表型轉(zhuǎn)化。再次，將不同濃度CGRP作用于各組大鼠CCSM，結(jié)果表明CGRP達到一定濃度（100nmol/L）后可使高血壓及高血壓性ED組大鼠CCSM表型從合成型向收縮型轉(zhuǎn)變，即發(fā)生表型逆轉(zhuǎn)化，而CGRP對對照組大鼠CCSM的表型標志物表達水平無明顯影響。

CCSM表型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)機制目前尚未完全明了。在對VSMC表型轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，這一病理變化過程中存在諸多正負調(diào)節(jié)因素，通過影響細胞信號轉(zhuǎn)導機制從而發(fā)揮作用，目前研究較多的信號轉(zhuǎn)導通路有絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）途徑等[13]。陳光慧等[14]研究發(fā)現(xiàn)CGRP可以上調(diào)高血壓相關(guān)基因（HRG-1）表達，從而抑制MAPK途徑，最終起到調(diào)控VSMC增殖的效應。而HRG-1表達產(chǎn)物不僅可以抑制VSMC增殖，還參與了VSMC從處于增殖狀態(tài)的合成型向收縮型轉(zhuǎn)化的病理變化過程。也有研究表明CGRP能顯著抑制VSMC增殖及表型轉(zhuǎn)化，其機制可能與阻滯細胞周期進展、抑制細胞內(nèi)MAPK信號通路中的蛋白磷酸化以及減弱胞質(zhì)中蛋白激酶C的活性等有關(guān)[15]。CCSM在結(jié)構(gòu)、功能方面與VSMC具有很大相似性，筆者推斷或許其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制也是相類似的，下一階段可以此為切入點探索CGRP影響高血壓性CCSM表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制。

本研究通過CGRP作用于體外培養(yǎng)高血壓性ED大鼠CCSM模型，初步證實了CGRP可逆轉(zhuǎn)高血壓性ED大鼠CCSM的表型轉(zhuǎn)化，但其具體作用機制尚不明確，有待進一步研究。