HPLC測定胃康寧顆粒中5種指標(biāo)成分含量

郭琳 倪健 杜梓萱 張海英 尹興斌

摘要：目的 建立胃康寧顆粒中指標(biāo)成分表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量測定方法，為胃康寧顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法 采用HPLC，色譜柱Agilent Eclipse Plus C18為（4.6 mm× 250 mm，5 ?m）。黃連生物堿流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50，每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0），檢測波長為345 nm；黃芩苷流動相為乙腈-0.2%磷酸（21∶79），檢測波長為280 nm。結(jié)果 黃連生物堿及黃芩苷測定均無陰性干擾，表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿及黃芩苷的進(jìn)樣量分別在0.005 26～0.211 ?g（r=0.999 6）、0.005 37～0.215 ?g（r=1）、0.005 55～0.222 ?g（r=1）、0.028 06～1.123 ?g（r=1）、0.096 5～1.930 ?g（r=0.999 8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性均良好，平均回收率分別為97.63%（RSD=2.32%）、99.05%（RSD=2.21%）、97.66%（RSD=1.94%）、101.50%（RSD=1.92%）、100.31%（RSD=1.12%）。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于胃康寧顆粒中表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量測定。

關(guān)鍵詞：胃康寧顆粒；表小檗堿；黃連堿；鹽酸巴馬??；鹽酸小檗堿；黃芩苷；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.020

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）12-0083-05

Abstract： Objective To establish an HPLC method for content determination of epiberberine， coptisine， palmatine， berberine and baicalin； To provide the basis for the quality control standard of Weikangning Granules. Methods Agilent Eclipse Plus C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） was used. For rhizoma coptidis alkaloids， mobile phase was acetonitrile - 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （50：50， 0.4 g sodium dodecyl sulfate was added in each 100 mL， to adjust the pH 4.0 with phosphoric acid）， and detection wavelength was 345 nm； For baicalin， mobile phase was acetonitrile - 0.2% phosphoric acid solution （21：79）， and detection wavelength was 280 nm. Results No negative interference was found in determination of rhizoma coptidis alkaloids and baicalin. Epiberberine， coptisine， palmatine， berberine and baicalin showed good liner relationship in the range of 0.005 26– 0.211 ?g （r=0.999 6）， 0.005 37–0.215 ?g （r=1）， 0.005 55–0.222 ?g （r=1）， 0.028 06–1.123 ?g （r=1）， 0.096 5–1.930 ?g （r=0.999 8）； degree of precision of instrument and the stability of samples were good. The average recovery rates were 97.63% （RSD=2.32%）， 99.05% （RSD=2.21%）， 97.66% （RSD=1.94%）， 101.50% （RSD=1.92%） and 100.31% （RSD=1.12%）， respectively. Conclusion The method is accurate， stable and reproducible. It can be used for the content determination of epiberberine， coptisine， palmatine， berberine and baicalin of Weikangning Granules.

Keywords： Weikangning Granules； epiberberine； coptisine； palmatine； berberine； baicalin； content determination

胃康寧方是中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方，由黃連、黃芩等組成，具有消痞散結(jié)、益氣養(yǎng)陰、活血解毒等功效，用于治療寒熱互結(jié)、氣陰不足、毒瘀互阻所致的慢性萎縮性胃炎。經(jīng)長期臨床驗證，療效確切，且無毒副作用。該方長期以湯劑形式應(yīng)用于臨床，患者服用、貯存、攜帶很不方便。為方便患者使用而制成顆粒。黃連為方中君藥，主要含有生物堿類成分，包括表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿等，現(xiàn)代藥理研究表明，黃連生物堿具有明顯的抗炎作用以及胃黏膜的保護(hù)作用，其中小檗堿對于免疫系統(tǒng)具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用[1-3]。黃芩為方中臣藥，主要含有黃酮類成分，包括黃芩苷、黃芩素等?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩苷抗炎作用較強(qiáng)，可顯著影響白細(xì)胞的多種功能，如抑制白細(xì)胞內(nèi)白三烯B4、白三烯C4的生物合成，抑制趨化肽（fMLP）激發(fā)的白細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，并促進(jìn)內(nèi)環(huán)磷腺苷水平提高[4]。為了更好地控制胃康寧顆粒質(zhì)量，本研究建立測定該制劑指標(biāo)成分表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和黃芩苷含量的方法。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津，SPD-M20A PDA檢測器），BT125D分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-4型恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

黃連堿（批號112026-201601，純度95.1%）、鹽酸巴馬?。ㄅ?10732-201611，純度86.8%）、鹽酸小檗堿（批號110713-201212，純度86.7%）及黃芩苷（批號110715-201619，純度93.5%），中國食品藥品檢定研究院；表小檗堿對照品（純度98.0%，批號W06M8Z30708），上海源葉生物科技有限公司；水為純凈水，娃哈哈集團(tuán)有限公司；乙腈為色譜純，美國Fisher公司；甲醇、磷酸為分析純，北京化工廠。胃康寧顆粒（批號20171001、20180101，中日友好醫(yī)院制劑室制備；批號20171201，北京中醫(yī)藥大學(xué)中試車間制備），黃連陰性顆粒（批號20171101，自制），黃芩陰性顆粒（批號20171102，自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃連生物堿含量測定

2.1.1 色譜條件

采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50，每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0），流速0.8 mL/min，檢測波長345 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 ?L。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備

取表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿0.021 05、0.021 49、0.022 19、0.112 3 mg的混合對照品溶液，搖勻，備用。

2.1.4 陰性對照溶液的制備

取等量黃連陰性顆粒，按“2.1.2”項下方法制成黃連陰性對照溶液。

2.1.5 專屬性試驗

精密吸取陰性對照溶液、對照品溶液及供試品溶液各10 ?L，分別測定，結(jié)果陰性對照在相同保留時間處未見干擾，說明該方法專屬性強(qiáng)。色譜圖見圖1。

2.1.6 線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mL分別置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得系列對照品溶液。取系列對照品溶液及混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。黃連生物堿在各自濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗

精密吸取各黃連生物堿對照品溶液10 ?L，注入高效液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿RSD分別為0.46%、0.22%、0.45%、0.28%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（批號20171001）約0.2 g，精密稱定，共6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果4種黃連生物堿含量RSD分別為0.85%、0.72%、0.63%、0.67%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗

取制備好的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量RSD分別為0.72%、0.59%、0.60%、0.52%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收率試驗

取同一批已知黃連生物堿含量的胃康寧顆粒樣品（批號20171001）0.1 g，精密稱定，共6份，分別精密加入混合對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，計算回收率，結(jié)果見表2～表5。

2.2 黃芩苷含量測定

2.2.1 色譜條件

采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（21∶79），流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 ?L。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對照品溶液的制備

取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含黃芩苷0.193 0 mg的對照品溶液，搖勻，作為對照品貯備液，備用。

2.2.4 陰性對照溶液的制備

取等量黃芩陰性顆粒，按“2.2.2”項下方法制成黃芩陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗

精密吸取陰性對照溶液、對照品溶液及供試品溶液各10 ?L，分別測定，結(jié)果陰性對照在相同保留時間處未見干擾，說明該方法專屬性強(qiáng)。色譜圖見圖2。

2.2.6 線性關(guān)系考察

精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.5、5.0 mL分別置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得系列對照品溶液。取系列對照品溶液及對照品貯備液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測。以黃芩苷峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=3 167 412X-200 460（r=0.999 8），表明黃芩苷進(jìn)樣量在0.096 5～1.930 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗

精密吸取黃芩苷對照品溶液10 ?L，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算RSD，結(jié)果RSD=0.51%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（批號20180101），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定黃芩苷含量，計算RSD，結(jié)果RSD=1.97%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗

取制備好的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h測定，結(jié)果黃芩苷含量的RSD=0.30%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗

取同一批已知黃芩苷含量的胃康寧顆粒樣品，精密稱定6份，分別精密加入黃芩苷對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件下進(jìn)樣檢測，計算回收率，結(jié)果見表6。

2.3 樣品含量測定

取3批樣品，按上述方法制備供試品溶液并測定黃連生物堿和黃芩苷含量，結(jié)果見表7。根據(jù)所得結(jié)果，將胃康寧顆粒中表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿及黃芩苷最低含量限度分別暫定為0.70、0.92、1.31、4.82、8.78 mg/g。

3 討論

本研究建立了胃康寧顆粒中表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量測定方法，專屬性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性均符合2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則的規(guī)定，能夠準(zhǔn)確測定5種指標(biāo)成分的含量，為胃康寧顆粒的質(zhì)量控制提供含量測定方法。

目前，黃連在復(fù)方中的應(yīng)用非常多，由于表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀較鹽酸小檗堿含量低，因此大多數(shù)研究僅控制鹽酸小檗堿含量，忽略了前3種生物堿，而這3種生物堿的藥效作用不容忽視，同時測定4種生物堿的含量能更全面控制復(fù)方的質(zhì)量，保證療效的穩(wěn)定性。采用HPLC測定生物堿，拖尾因子容易偏大，造成峰形不對稱，影響含量測定的準(zhǔn)確性。本研究的測定方法分離度好，峰形對稱，能夠準(zhǔn)確定量。黃芩常與黃連配伍使用，由于測定生物堿的色譜條件特殊，需調(diào)節(jié)流動相的pH值并添加一些表面活性劑來保證峰形對稱，而采用普通C18色譜柱雖能在一些色譜條件下同時測定此5種成分，但難以保證其定量的準(zhǔn)確性。本研究建立的測定方法可準(zhǔn)確測定這5種藥效成分。

在黃連生物堿含量測定中，供試品溶液的制備考察了水、甲醇、甲醇-鹽酸（100∶1）等提取溶劑，分別考察了超聲及加熱回流30、60、90 min的提取效果，結(jié)果表明，采用甲醇為溶劑，超聲處理30 min，黃連生物堿的提取效果最佳。

由于黃連生物堿峰形拖尾嚴(yán)重，所以考察了4種色譜柱（Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Eclipse Plus C18、Merck Rp-C18、Waters Sunfire C18）對黃連生物堿的分離效果，流動相考察了乙腈-0.2%磷酸等度不同比例、乙腈-0.2%磷酸梯度、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（20∶80）及乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50，每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）等[5-6]，流速考察了0.8、1.0、1.2 mL/min，結(jié)果表明，采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱、以乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50，每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）為流動相、流速為0.8 mL/min時，黃連生物堿無雜質(zhì)干擾，分離度良好，峰形對稱。

在黃芩苷含量測定中，供試品溶液的制備考察了水、甲醇等提取溶劑，以及不同的溶劑倍量和超聲、加熱回流30、60、90 min的提取效果，結(jié)果表明，采用甲醇為溶劑，加熱回流提取60 min，黃芩苷的提取效果最佳。

色譜條件考察了甲醇水、乙腈水、甲醇-0.2%磷酸（42∶58、40∶60）和乙腈-0.2%磷酸（21∶79、25∶75、30∶70）[7-8]等流動相及0.8、1.0、1.2 mL/min不同流速，結(jié)果表明采用乙腈-0.2%磷酸（21∶79）為流動相、流速為1.0 mL/min時，黃芩苷的保留時間適中，陰性對照無干擾，分離度良好，峰形對稱。

本試驗測得胃康寧顆粒樣品中表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和黃芩苷的平均含量分別為1.01、1.33、1.88、6.89、12.55 mg/g?？紤]到大生產(chǎn)時中藥材受采收季節(jié)、產(chǎn)地、貯存環(huán)境及時間的影響，因此將胃康寧顆粒中5種成分最低含量限度暫定為0.70、0.92、1.31、4.82、8.78 mg/g。

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