栝樓桂枝顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Ca²⁺/CaMKⅡ/CREB信號通路的影響

樊李明 張玉琴 王宏運(yùn) 李煌 徐偉 褚克丹 林羽

摘要：目的 觀察栝樓桂枝顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Ca2+/CaMKⅡ/CREB信號通路的影響，探討其作用機(jī)制。方法 采用線栓法致大腦中動(dòng)脈栓塞建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型。SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和中藥組，中藥組給予栝樓桂枝顆粒藥液灌胃，連續(xù)7 d。采用改良的神經(jīng)功能缺損評分法進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評分，測定大鼠腦梗死面積，采用透射電鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，RT-PCR檢測大鼠腦組織鈣活化調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、cAMP反應(yīng)元件蛋白（CREB）的基因表達(dá)，Western blot檢測大鼠缺血側(cè)腦組織p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CREB和鈣調(diào)蛋白（CaM）的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損和腦梗死面積評分顯著升高，海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變明顯，細(xì)胞高度水腫、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)收縮，p-CREB蛋白表達(dá)降低，CaM蛋白表達(dá)升高；與模型組比較，中藥組大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死面積顯著降低，缺血區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改善，細(xì)胞損傷減少，p-CREB和p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)升高，CaM蛋白表達(dá)降低。結(jié)論 栝樓桂枝顆粒能改善模型大鼠神經(jīng)功能，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)CREB、CaMKⅡ的磷酸化，抑制CaM的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：栝樓桂枝顆粒；腦缺血再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.015

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）12-0057-05

Abstract： Objective To investigate the effects of Gualou Guizhi Granules on Ca2+/CaMKⅡ/CREB signaling pathway in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury； To explore its possible mechanism of action. Methods A rat model of cerebral ischemia reperfusion injury was established by middle cerebral artery occlusion. SD rats were divided into sham-operation group， model group and TCM group. TCM group was given Gualou Guizhi Granules decoction for gavage for 7 d. The modified neural function defect scoring was used to score the nerve functions of rats and the area of cerebral infarction was determined. The ultrastructure of hippocampal neurons in rats was observed by transmission electron microscopy， and RT-PCR method was used to detect gene expressions of CaMKⅡ and CREB in the brain tissue. Western blot was used to detect the protein expressions of p-CREB， p-CaMKⅡ， CaMKⅡ， CREB and CaM in the ischemic brain tissue of rats. Results Compared with the sham-operation group， the nerve function defect and cerebral infarction area score of the model group increased significantly. Electron microscopy showed that the ultrastructural changes of hippocampal neurons were obvious， the cells were highly edematous， the nucleus and cytoplasm contracted， the protein expression of p-CREB decreased， and the protein expression of CaM increased. Compared with the model group， the nerve function score and the area of cerebral infarction of TCM group decreased significantly， ultrastructural neurons in ischemic area was improved， and cell damage was reduced， the protein expressions of p-CREB and CaMKⅡ increased， and the the protein expressions of CaM decreased. Conclusion Gualou Guizhi Granules can improve the neural functions of model rats and inhibit the apoptosis of nerve cells. Its mechanism of action may be related to the phosphorylation of CREB and CaMKⅡ and the inhibition of the expression of CaM.

Keywords： Gualou Guizhi Granules； cerebral ischemia reperfusion injury； apoptosis； rats

缺血性腦卒中是嚴(yán)重威脅人類身體健康的常見疾病之一，其致病原因復(fù)雜多樣。細(xì)胞凋亡是腦缺血損傷的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并且發(fā)揮著重要作用。在各種類型的腦缺血過程中，細(xì)胞凋亡都是神經(jīng)元死亡的重要形式。目前研究表明，由缺氧、缺血造成的腦部損傷可引起興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的過度釋放，從而使突觸后膜處于一種持續(xù)性去極化狀態(tài)，造成大量鈣離子內(nèi)流，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列鈣離子的生化反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[1-5]。鈣離子信號通路在細(xì)胞存活、增殖、代謝中起到至關(guān)重要的作用，其作用機(jī)制為Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合形成Ca2+-CaM，活化鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）。磷酸化的CaMKⅡ可直接活化cAMP反應(yīng)元件蛋白（CREB），進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白和突觸蛋白合成，CREB通過磷酸化激活下游抗凋亡蛋白減弱神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元形成[6]。

栝蔞桂枝湯源于《金匱要略》，有滋養(yǎng)津液、解肌祛邪、舒緩筋脈功效。栝樓桂枝顆粒為福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，其湯劑臨床使用治療腦卒中后痙攣性偏癱，收效良好[7-8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，栝樓桂枝顆粒能抑制神經(jīng)元凋亡及興奮性氨基酸（谷氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸）的釋放，對缺血性腦卒中有不同程度的療效[9-12]，但其具體機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)采用線栓法致大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）建立大鼠腦缺血-再灌注損傷模型，觀察栝樓桂枝顆粒對模型大鼠Ca2+/CaMKⅡ/CREB信號通路相關(guān)因子蛋白和mRNA表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雄性健康SD大鼠54只，SPF級，體質(zhì)量240～280 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（55±5）%環(huán)境，自由攝食飲水。

1.2 藥物和試劑

栝樓桂枝顆粒，福建省第二人民醫(yī)院藥學(xué)部提供，批號20160809。2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，美國Sigma Aldrich），生理鹽水（福州海王福藥制藥有限公司），水合氯醛（麥克林，C804539），多聚甲醛（國藥集團(tuán)，20160428），Trizol（Life technologies，15596026），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，P0012s），p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CREB及β-actin抗體（CST公司），Revert Aid First strand cDNA Synthsis Kit（Thermo Scientific，K1622），Power SYBR? Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，4367659）。

1.3 儀器

數(shù)碼相機(jī)（日本佳能公司，IXUS130），MODE MED 6數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（加拿大MICTICES儀器公司），H-7500透射電子顯微鏡、凝膠成像分析系統(tǒng)、PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppLied Biosystems）。

1.4 造模

將54只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（18只）、模型組（36只），參照前期造模方法[11-12]實(shí)行大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞手術(shù)，建立大鼠MCAO模型。

1.5 分組和給藥

將神經(jīng)功能評分為1～3分的造模組大鼠隨機(jī)分為模型組（18只）和中藥組（18只），假手術(shù)組和模型組灌胃給予生理鹽水，根據(jù)人體與動(dòng)物藥物等效劑量換算，中藥組灌胃給予3.6 g/（kg·d）栝樓桂枝顆粒。各組于造模后2 h給藥，給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)7 d。

1.6 神經(jīng)功能評分

根據(jù)分級評分系統(tǒng)對大鼠進(jìn)行神經(jīng)缺陷評估，分?jǐn)?shù)越高表明大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。0分：大鼠行為正常，無神經(jīng)功能障礙；1分：大鼠在提起尾部和懸吊時(shí)左前肢無法完全伸直；2分：大鼠在爬行時(shí)向左跌倒；3分：大鼠無法獨(dú)立行走；4分：大鼠無神經(jīng)意識[11-12]。

1.7 腦梗死面積測定

大鼠經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)評估后，腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）麻醉，斷頭法快速取出大腦。取腦組織，-20 ℃冷凍10 min，保持切片前形態(tài)完整。大腦切片（厚2 mm），放入0.2%TTC染色劑中，37 ℃烘箱避光孵育1 h。孵育結(jié)束后用高分辨率數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像并分析。使用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算梗死面積，以梗死面積的百分比評估腦梗死程度。梗死面積百分比（%）=（非梗死側(cè)半球面積-梗死側(cè)半球正常腦組織面積）÷非梗死側(cè)半球面積×100%。

1.8 透射電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

每組隨機(jī)選取3只大鼠，10%水合氯醛溶液麻醉，斷頭，低溫取出腦組織，分離出缺血區(qū)后固定于固定液中，利用H-7500透射電子顯微鏡進(jìn)行圖像采集，觀察缺血區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化。

1.9 RT-PCR檢測腦組織鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ、cAMP反應(yīng)元件蛋白的mRNA表達(dá)

每組大鼠取腦組織100 mg，加Trizol試劑1 mL后勻漿，提取總RNA。測定RNA濃度，-80 ℃保存。采用Revert Aid First strand cDNA Synthsis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，各目的基因的擴(kuò)增引物序列見表1。反應(yīng)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件：50 ℃預(yù)熱2 min，95 ℃預(yù)熱10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)；采用ABI 7900熒光定量PCR儀軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.10 Western blot檢測腦組織p-cAMP反應(yīng)元件蛋白、p-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ、鈣活化調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ、cAMP反應(yīng)元件蛋白和鈣調(diào)蛋白的蛋白表達(dá)

大鼠斷頭取腦后制成勻漿，嚴(yán)格按照蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取腦組織全蛋白，測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠分離蛋白，經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)膜，再用脫脂牛奶封閉2 h。分別加p-CREB、p-CaMKⅡ、CREB、CaMKⅡ抗體（1∶1000）及CaM抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次×10 min，洗滌后加入經(jīng)HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5000），孵育2 h，再用TBST液洗滌3次×10 min。完畢后條帶經(jīng)Bio-RAD凝膠分析儀進(jìn)行圖像掃描分析，灰度值用Quantity One測定。分別用p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CREB與β-actin灰度值的比值表示p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CREB和CaM蛋白相對表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果

假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損，行為正常；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低（P<0.01）。結(jié)果見圖1。

2.2 栝樓桂枝顆粒對模型大鼠腦梗死面積的影響

TTC染色后，梗死區(qū)域呈白色，非梗死區(qū)域呈紅色。中藥組大鼠梗死面積明顯小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見圖2。

2.3 栝樓桂枝顆粒對模型大鼠腦組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)清晰，核仁清晰，結(jié)構(gòu)完整；模型組海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞高度水腫、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)收縮，線粒體嵴部分崩解，廣泛腫脹的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)普遍存在；中藥組水腫明顯減輕，線粒體嵴和膜較為清晰，發(fā)生凋亡壞死的細(xì)胞明顯減少。結(jié)果見圖3、圖4。表明栝樓桂枝顆?？杀Ｗo(hù)細(xì)胞器的形態(tài)，減少細(xì)胞的損傷。

2.4 栝樓桂枝顆粒對模型大鼠腦組織鈣活化調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ、cAMP反應(yīng)元件蛋白mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織CREB mRNA表達(dá)明顯降低，CaMKⅡ表達(dá)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠腦組織CREB水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖5。

2.5 栝樓桂枝顆粒對模型大鼠腦組織p-cAMP反應(yīng)元件蛋白、p-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ、鈣活化調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ、cAMP反應(yīng)元件蛋白和鈣調(diào)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織p-CREB蛋白表達(dá)明顯降低，CaM蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠腦組織p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ和CREB蛋白表達(dá)明顯升高，CaM蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖6、圖7。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，如谷氨酸釋放、鈣超載和炎癥反應(yīng)等，缺血再灌注后會(huì)使神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生快速的級聯(lián)反應(yīng)損傷，缺血組織病理損害進(jìn)一步加重，最終誘發(fā)神經(jīng)元凋亡或壞死。有文獻(xiàn)報(bào)道，腦缺血再灌注損傷后Ca2+/CaMKⅡ/CREB信號通路起著至關(guān)重要的作用[13-14]。

Ca2+超載引發(fā)的損傷發(fā)生在腦缺血再灌注損傷全過程，且參與自由基、興奮性氨基酸等所致的損傷過程[15]。Ca2+作為體內(nèi)重要的第二信使，參與機(jī)體內(nèi)多種活動(dòng)如細(xì)胞正常生理功能維持、細(xì)胞增殖與分化和神經(jīng)遞質(zhì)的分泌與神經(jīng)調(diào)節(jié)等[16]。Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度升高，激活各種Ca2+依賴性酶（如CaMKⅡ、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶）和Ca2+結(jié)合蛋白。缺血損傷誘導(dǎo)的Ca2+超載可能過度激活Ca2+/CaM依賴性通路，導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞損傷。細(xì)胞內(nèi)的Ca2+與CaM結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合體，進(jìn)而活化Ca2+/CaMKⅡ。CaMKⅡ是腦內(nèi)含量最豐富的蛋白激酶，磷酸化的CaMKⅡ可直接活化CREB，也可通過絡(luò)氨酸激酶，使ras處于ras-GTP活化狀態(tài)，進(jìn)而啟動(dòng)ras-raf-MEK- ERK聯(lián)級反應(yīng)，pERK可轉(zhuǎn)入核內(nèi)與CREB結(jié)合，激活Ser133位點(diǎn)。p-CREB進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白和突觸蛋白的合成，促進(jìn)神經(jīng)元的形成[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，中藥組神經(jīng)功能評分和梗死面積顯著降低（P<0.01）；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，栝樓桂枝顆?？筛纳拼笫笕毖氚祹У某⒔Y(jié)構(gòu)。此外，栝樓桂枝顆粒顯著增加p-CREB和p-CaMKⅡ的表達(dá)，降低CAM的表達(dá)。

綜上所述，栝樓桂枝顆?？筛纳芃CAO大鼠神經(jīng)功能，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過激活Ca2+/CaMKⅡ/CREB信號通路，促進(jìn)CREB、CaMKⅡ的磷酸化，抑制CaM的表達(dá)，從而抑制MCAO大鼠神經(jīng)元凋亡。

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