黃鱔腸道假單胞桿菌鐵蛋白基因的克隆及融合表達(dá)

臧彧偉，王全禾，楊 龍，李 偉

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025)

鐵離子是細(xì)菌生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)元素，但過(guò)量鐵會(huì)引起細(xì)胞毒性［1］。保持鐵離子的儲(chǔ)存與代謝平衡對(duì)細(xì)菌至關(guān)重要［2］。細(xì)菌可能會(huì)通過(guò)鐵蛋白或鐵蛋白樣分子儲(chǔ)存胞質(zhì)中過(guò)量的鐵來(lái)達(dá)到平衡鐵離子利用與減少細(xì)胞毒性的目的［3］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中共存著兩種鐵儲(chǔ)存蛋白，一種為可結(jié)合血紅素的Bfr型鐵蛋白，另一種為不能結(jié)合血紅素的Ftn型鐵蛋白［4］。Ftn通常是一個(gè)由24個(gè)亞基組裝的球形蛋白，其中央為一個(gè)可大量?jī)?chǔ)存三價(jià)鐵的空腔［5］。這種特殊的結(jié)構(gòu)使得鐵離子一直保持著可溶性狀態(tài)并阻止其參與氧化還原反應(yīng)從而造成活性氧脅迫［6］。Bfr型的鐵蛋白也是一個(gè)24亞基的球形結(jié)構(gòu)，不過(guò)其每?jī)蓚€(gè)亞基可以結(jié)合一個(gè)血紅素分子，并且每個(gè)亞基中心都具有一個(gè)鐵氧化酶中心［7］。球形結(jié)構(gòu)中這些鐵氧化酶中心高度對(duì)稱［8］。研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌主要的儲(chǔ)鐵蛋白是Bfr，F(xiàn)tn只能收集極少量的鐵。尤其是在綠膿桿菌生長(zhǎng)受到鐵離子極限缺乏條件時(shí)，從Bfr中獲得鐵離子是維持生長(zhǎng)的主要途徑［2］。綠膿桿菌的Ftn型鐵蛋白中鐵離子釋放需要鐵氧還蛋白NADP還原酶(Fpr)提供電子;而Bfr鐵蛋白不僅需要Fpr提供電子而且需要脫鐵狀態(tài)的Bfr相關(guān)鐵氧還蛋白(apo-Bfd)協(xié)同作用才能實(shí)現(xiàn)鐵離子的釋放［2，9］。相反地，F(xiàn)tn是大腸埃希菌的主要鐵儲(chǔ)存蛋白，其Bfr蛋白的功能尚不清楚［10］。盡管植物、動(dòng)物和微生物的Ftn型和Bfr型菌鐵蛋白亞基折疊方式和四級(jí)結(jié)構(gòu)都很類似，它們的序列相似性卻很低，這就極大地影響了其電荷交換的能力并造成了功能的巨大差異［3，11］。因此，開展不同生物鐵蛋白基因分離和功能鑒定對(duì)于深入了解這些基因在鐵離子代謝中的作用非常必要。黃鱔腸道假單胞桿菌是筆者實(shí)驗(yàn)室分離到的一種非致病微生物。該菌分類地位上與Pseudomonas sp．TKP菌株非常相似，具有產(chǎn)表面活性劑的能力［12］。對(duì)于該菌鐵蛋白Bfr基因克隆及功能的研究國(guó)內(nèi)外尚沒有相關(guān)報(bào)道。因此，筆者擬通過(guò)克隆其Bfr基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)行重組蛋白的分離純化及鑒定;分析重組蛋白鐵離子結(jié)合能力并探討其對(duì)該菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響，以期為深入了解假單胞桿菌Bfr基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1.1 質(zhì)粒和菌株

原核表達(dá)載體pGEX-4T-1購(gòu)買自Amersham Bioscience公司;大腸埃希菌感受態(tài)DH5α、BL21(DE3)、pEASY-T1載體等購(gòu)自北京全式金公司;黃鱔腸道假單胞桿菌菌株由長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所鑒定并保存。

1．1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自Thermo Scientific公司;質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、DNA聚合酶等購(gòu)自北京全式金公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自 Invitrogen公司;GST-resin純化柱購(gòu)自上海七海生物;DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋生物科技公司;硝酸纖維素膜購(gòu)自武漢谷歌生物，菲洛嗪購(gòu)自上海生工。

1．2 方法

1．2.1 Bfr基因的克隆及序列分析

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已知假單胞桿菌屬Bfr基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)基因特異性引物Bfr-F1(5’-ATGAAAGGCGACATCTCA-3’) 和 Bfr-R1(5’-TTATTCACCCATCTGCG-3’)，以黃鱔腸道假單胞桿菌gDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化后克隆至pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，選取陽(yáng)性菌落進(jìn)行序列測(cè)定。

測(cè)序所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核苷酸及氨基酸同源性分析。用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并分析其相似性和限制性酶切位點(diǎn)信息。

1．2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)測(cè)序所得Bfr基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性表達(dá)引物rc-F(5’-TTAGAATTCATGAAAGGCGACATCTCAG-3’)和 rc-R(5’-GAACTCGAGTTATTCACCCATCTGCG-3’)，以黃鱔腸道假單胞桿菌基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上、下游引物分別增加了 EcoRⅠ和 XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后并用膠回收試劑盒回收純化。將純化產(chǎn)物及pGEX-4T-1載體用EcoRⅠ內(nèi)切酶和XhoⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，電泳、回收純化后加入T4 DNA連接酶于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR及雙酶切驗(yàn)證后送往濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1．2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Westernblot檢測(cè)

將測(cè)序正確的pGEX-4T-1-Bfr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌，涂布在含有氨芐青霉素(50 μg·mL－1)的 LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆接種于含氨芐青霉素(50 μg·mL－1)的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r·min－1振蕩培養(yǎng)菌液 D600至 0.5 ～ 0.6，加入IPTG(125 μg·mL－1)繼續(xù)于 37 ℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)3 h，取40 μL菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

將陽(yáng)性菌株按照體積比1∶1 000接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。于4 ℃、10 000 r·min－1離心 10 min 收集菌體，沉淀用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)重懸，冰上超聲裂解細(xì)菌，超聲5 s，間隔10 s，總時(shí)間15 min，4 ℃，10 000 r·min－1離心 10 min，取上清，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后將上清加到GST-resin純化柱中，用還原型谷胱甘肽(6 mmol·L－1)洗脫，獲得GST-Bfr融合蛋白。

將純化的融合蛋白重新加到GST-resin純化柱中，用含有凝血酶(終濃度為3 U·mL－1)的Tris-HCl緩沖液酶切過(guò)夜，然后用Tris-HCl緩沖液洗脫Bfr蛋白，利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)Bfr蛋白酶切純化情況。

將純化得到的 GST-Bfr蛋白和Bfr蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶4℃封閉過(guò)夜，再用Tris緩沖液-吐溫(TBST)洗膜3次，每次10 min。隨即加入小鼠抗GST-tag單克隆抗體(1∶5 000)，37℃孵育2 h，用TBST洗膜6次，每次5 min。最后，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1∶10 000)于37℃孵育2 h，用DAB顯色試劑盒顯色。

1．2.4 重組蛋白鐵離子螯合能力分析

在兩支含 150 μL 濃度為 1 mmol·L－1的FeCl3(或FeCl2)試管中分別加入160 μL的GSTBfr融合蛋白(113 μg·mL－1)或 Bfr蛋白(113 μg·mL－1)，補(bǔ)充Tris-HCl緩沖液至3 mL后于25℃、100 r·min－1振蕩孵育 60 min，隨即加入 120 μL的1%抗壞血酸，于室溫孵育20 min，再加入120 μL 的菲洛嗪(5 mmol·L－1)室溫孵育 10 min，最后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定混合液在562 nm處的吸光值。以加入160 μL Tris-HCl緩沖液替代重組蛋白的作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2.5 重組蛋白對(duì)假單胞桿菌生長(zhǎng)的影響

挑取假單胞桿菌單克隆于液體LB培養(yǎng)基中30 ℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng) 16 h。取 400 μL 培養(yǎng)液于40 mL新鮮 LB培養(yǎng)基中，加入2 mL FeCl3(1 mmol·L－1)和 100 μL Bfr蛋白(113 μg·mL－1)，于30 ℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)12 h;搖動(dòng)培養(yǎng)3 h后每間隔1 h取樣一次，重復(fù)3次，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)樣品在600 nm處吸光值表征其生物量。以既不添加FeCl3也不添加Bfr蛋白的為陰性對(duì)照，以只添加FeCl3不添加Bfr蛋白的為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2．1 黃鱔腸道假單胞桿菌Bfr基因的獲得及序列分析

利用引物對(duì)Bfr-F1/R1從黃鱔腸道假單胞桿菌gDNA中擴(kuò)增獲得了一條長(zhǎng)約450 bp的條帶。將該P(yáng)CR產(chǎn)物測(cè)序后發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)471 bp，編碼一個(gè)長(zhǎng)155 aa的多肽鏈(圖1)。

圖1 黃鱔腸道假單胞桿菌Bfr基因的核苷酸序列及推斷的氨基酸序列Fig．1 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Bfr from Pseudomonas spp．

將測(cè)序所得的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與其他不同微生物來(lái)源的鐵蛋白基因具有較高的同源性。同時(shí)利用DNAMAN軟件進(jìn)行的多序列比對(duì)結(jié)果顯示:該基因推斷的氨基酸序列與來(lái)源于熒光假單胞桿菌的Bfr蛋白具有83.3%的同源性，而與耶爾森氏菌、雙歧桿菌、莢膜紅細(xì)菌、淋球菌、綠膿假單胞桿菌和沃爾巴克氏體來(lái)源的Ftn蛋白分別具有 49.4%、43.7%、40.2%、37.6%、45.9%和31.6%的同源性(圖2)，證明實(shí)驗(yàn)已成功克隆得到黃鱔腸道假單胞桿菌的Bfr基因。

2．2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)純化及鑒定

用基因特異性引物對(duì)rc-F/R從假單胞桿菌gDNA中擴(kuò)增獲得的片段，雙酶切后與用同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的pGEX-4T-1連接，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的pGEX-4T-1-Bfr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌，挑取陽(yáng)性菌株用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，相對(duì)于誘導(dǎo)前和轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒的菌株，誘導(dǎo)后產(chǎn)生了一條分子量約為50 ku的條帶，符合預(yù)期大小(圖3-A)。

通過(guò)GST-resin純化柱結(jié)合帶有GST標(biāo)簽的蛋白，用還原型谷胱甘肽洗脫GST-Bfr蛋白，將洗脫的蛋白重新上柱后，再用凝血酶進(jìn)行酶切，經(jīng)Tris-HCl緩沖液洗脫獲得了Bfr蛋白，SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示純化后基本無(wú)雜蛋白，酶切后得到的Bfr蛋白大小約24 ku，比用軟件預(yù)測(cè)的略大，可能是凝血酶酶切后多余的氨基酸導(dǎo)致。

將SDS-PAGE凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，分別用小鼠抗GST-tag單克隆抗體為一抗和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠二抗進(jìn)行Western blot免疫印跡的結(jié)果顯示，帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白被特異性識(shí)別，而酶切后的Bfr蛋白不能與抗體特異性識(shí)別，說(shuō)明已成功實(shí)現(xiàn)了融合蛋白GST-Bfr和重組蛋白Bfr的純化(圖3-B)。

2．3 GST-Bfr蛋白和重組 Bfr蛋白與 Fe3+和Fe2+的螯合能力檢測(cè)

利用鐵螯合試劑菲洛嗪，筆者采用比色法檢測(cè)了融合蛋白GST-Bfr蛋白和重組Bfr蛋白與Fe3+和Fe2+的螯合能力。結(jié)果顯示，GST-Bfr蛋白在加入Fe3+和Fe2+后D562吸光值與對(duì)照均無(wú)明顯差別;而Bfr蛋白在加入Fe3+后D562吸光值顯著變小，加入Fe2+后D562吸光值與對(duì)照無(wú)顯著差異。證明融合蛋白GST-Bfr既不能螯合Fe3+也不能結(jié)合Fe2+;而Bfr蛋白可以螯合Fe3+，但不能螯合Fe2+。

2．4 重組蛋白對(duì)假單胞桿菌生長(zhǎng)的影響

在外源添加Fe3+情況下通過(guò)測(cè)定假單胞桿菌在不同培養(yǎng)時(shí)間后的生物量，分析重組蛋白有無(wú)對(duì)假單胞桿菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明:相對(duì)于陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，只有當(dāng)Fe3+和Bfr蛋白同時(shí)存在時(shí)，才會(huì)促進(jìn)假單胞桿菌的生長(zhǎng)。這一定程度上說(shuō)明Bfr蛋白對(duì)假單胞桿菌獲得鐵營(yíng)養(yǎng)元素具有重要作用。

圖2 Bfr推斷的氨基酸與其他微生物鐵蛋白序列比對(duì)結(jié)果Fig．2 Multiple alignment of ferritins from other species

圖3 融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)(A)與Western-blot分析(B)Fig．3 Expression(A)and detection of the recombinant proteins(B)

圖4 Bfr蛋白與FeCl3、FeCl2的螯合能力分析Fig．4 Iron chelation detection of Bfr proteins

3 討論

圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間假單胞桿菌的D600值Fig．5 D600values of Pseudomonas spp．a(chǎn)t different time point

細(xì)菌鐵蛋白Bfr是鐵蛋白家族中的一員，同時(shí)也是一種重要的儲(chǔ)存鐵和解毒蛋白［13－14］。細(xì)菌鐵儲(chǔ)存蛋白是由24個(gè)亞基和12個(gè)血紅素分子組成的球形蛋白，可以通過(guò)鐵結(jié)合位點(diǎn)將Fe2+氧化［15］，隨后 Fe3+被移到中央內(nèi)腔儲(chǔ)存起來(lái)［16］。因此，鐵蛋白可以在鐵過(guò)量的條件下起一定的作用［6，17］。目前已對(duì)綠膿假單胞桿菌［2，7］和大腸埃希菌的［10］鐵蛋白基因研究得比較透徹，而對(duì)其他假單胞桿菌的鐵蛋白基因的功能不甚清楚。本研究成功克隆了黃鱔腸道假單胞桿菌的Bfr基因，序列分析發(fā)現(xiàn)該基因同目前已報(bào)道的Bfr類型的鐵蛋白基因同源性較高，而同F(xiàn)tn型鐵蛋白同源性較低，是一個(gè)新的Bfr型鐵蛋白家族的成員。在此基礎(chǔ)上，筆者構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)了融合蛋白的表達(dá);通過(guò)親和層析獲得了較純的Bfr蛋白。鐵離子螯合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Bfr蛋白可以結(jié)合Fe3+離子但不能螯合Fe2+，這說(shuō)明黃鱔腸道假單胞桿菌Bfr蛋白可能是一種重要的儲(chǔ)鐵蛋白。在外源添加Fe3+和Bfr蛋白時(shí)，能夠一定程度上促進(jìn)假單胞桿菌的生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)槎嘤嗟腂fr蛋白結(jié)合Fe3+離子后起到了解毒效果并使得Bfr蛋白與細(xì)菌內(nèi)的鐵氧還蛋白相互作用形成復(fù)合物有利于保持細(xì)胞質(zhì)鐵穩(wěn)態(tài)所致［18］。該研究為進(jìn)一步分析不同微生物鐵蛋白的功能提供了基礎(chǔ)資料，應(yīng)深入研究該類型細(xì)菌鐵蛋白與黃鱔體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相互作用獲鐵及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。