假單胞桿菌BS1培養(yǎng)條件的研究

劉銅，畢思寧，2，史潔，侯巨梅，崔素萍，王彥杰，左豫虎，于裴芝

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院）

生物表面活性劑是一類(lèi)由微生物代謝產(chǎn)生的兩性化合物，具有化學(xué)合成表面活性劑所無(wú)法比擬的環(huán)境兼容性和廣闊的應(yīng)用前景。由于生物表面活性劑可生物降解、對(duì)有機(jī)體無(wú)毒害，因此在醫(yī)藥、洗滌劑、原油開(kāi)采和食品工業(yè)以及植物病原菌生物防治方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。假單胞桿菌BS1 是從大慶 石油污染土樣中分離的一株可以產(chǎn)生生物表面活性劑的菌株[3-4]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)假單胞桿菌BS1 的菌體、去菌體發(fā)酵濾液對(duì)植物病原菌有一定的抑制作用，這表明了假單胞桿菌BS1 具有一定的生防潛力[5]。由此可見(jiàn)，假單胞桿菌BS1 具有很好的工業(yè)開(kāi)發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值。將對(duì)假單胞桿菌BS1 培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為以后開(kāi)發(fā)利用假單胞桿菌BS1 提供了更加可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

假單胞桿菌BS1[3]，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理與應(yīng)用微生物所提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：硝酸鈉1.5 g，硫酸銨1.5 g，磷酸氫二鉀1.31 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，氯化鈣0.002 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：硝酸鈉1.5 g，硫酸銨1.5 g，磷酸氫二鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，氯化鈣0.002 g，蒸餾水1 000 mL，液體石蠟5%，pH 7.0。

固體LB 培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，定容至1 000 mL。以上培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 碳源對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

將供試假單胞桿菌BS1 在固體LB 培養(yǎng)基上活化24 h 后，用無(wú)菌水配制成菌懸液（107cfu·mL-1）。向100 mL 的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入5 mL 的液體石蠟、正己烷、正辛烷、正庚烷作為碳源，每處理重復(fù)3 次，滅菌后，按1%的比例分別接種菌懸液，置于37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，每隔24 h取一次樣，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定各處理菌懸液的光吸收值（OD640）。

1.4 接種量對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

在100 mL 滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以1%、2%、3%、5%、7.5%、10%的比例接種菌懸液，每處理3 次重復(fù)，置于37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，每隔24 h 取一次樣，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定各處理菌懸液的光吸收值（OD640），每處理重復(fù)3 次。

1.5 溫度對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

將菌懸液按3%比例的接種量接種于滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后分別置于25、30、35、37、40 ℃，180 r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，每隔24 h 取一次樣，每處理重復(fù)3 次，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定各處理菌懸液的光吸收值（OD640）。

1.6 pH 對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

用0.1 mol·L-1的HCl 或NaOH 將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0，每處理3 次重復(fù)，滅菌后按3%比例的接種量接入菌懸液，置于30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，每隔24 h取樣一次，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定各處理菌懸液的光吸收值（OD640），每處理重復(fù)3 次。

1.7 NaCl 濃度對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，分別以0%、1%、3%、5%、10%、15%的比例添加NaCl，每處理3 次重復(fù)，然后按3%比例的接種量接入菌懸液，置于30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，每隔24 h取一次樣，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定各處理菌懸液的光吸收值（OD640），每處理重復(fù)3 次。

1.8 裝液量對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

將250 mL 的三角瓶中分別裝入70、100、130、160、190 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，每處理3 次重復(fù)，滅菌后，按3%比例的接種量接入菌懸液，置于30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，每隔24 h 取一次樣，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定各處理菌懸液的光吸收值（OD640），每處理重復(fù)3 次。

1.9 最適培養(yǎng)條件下假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

將發(fā)酵培養(yǎng)基按130 mL 的裝液量裝入三角瓶中（250 mL 的三角瓶），滅菌后以3%比例的接種量接入菌懸液，置于30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復(fù)3 次，定時(shí)取樣，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定各處理菌懸液的光吸收值（OD640）。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

圖1 碳源對(duì)假單孢桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of carbon source on Pseudomonas bacillus BS1

結(jié)果如圖1 所示，從圖中可以看出，以液體石蠟為碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，假單胞桿菌BS1 菌體的生長(zhǎng)狀況良好，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值為2.10。當(dāng)以正辛烷、正庚烷、正己烷為碳源時(shí)，隨著碳鏈長(zhǎng)度的減小，菌體的生長(zhǎng)狀況逐漸下降，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值分別為1.31、0.46、0.14；當(dāng)以正己烷為碳源時(shí)，菌體幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，培養(yǎng)9 d 內(nèi)菌懸液的OD640值基本處于同一水平；這可能是由于假單胞桿菌BS1 不能利用正己烷、正庚烷為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，或是由于正己烷、正庚烷對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生的毒性，使其生長(zhǎng)受到抑制。

2.2 接種量對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

圖2 接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.2 The effect of inoculum size on Pseudomonas bacillus BS1

圖2 為接種量對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果，從圖中可以看出：接種量分別為1%、2%時(shí)，菌體生長(zhǎng)的延滯期較長(zhǎng)（0～3 d），菌體的生長(zhǎng)狀況較差，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值分別為1.63、1.70。當(dāng)接種量分別為5%、7%、10%時(shí)，培養(yǎng)前期（0～4 d）菌體生長(zhǎng)較快，但培養(yǎng)后期（4～9 d）菌體的生長(zhǎng)狀況不如接種量為3%時(shí)，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值分別為1.82、1.71、1.66 和1.91。

2.3 溫度對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

圖3 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect of temperture on Pseudomonas bacillus BS1

試驗(yàn)結(jié)果圖3 表明，溫度對(duì)假單胞桿菌BS1 的生長(zhǎng)有一定的影響，在25～40 ℃溫度范圍內(nèi)，菌體均可以生長(zhǎng)。溫度為30 ℃時(shí)，菌體的生長(zhǎng)狀況最好，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值為2.16。其次是溫度為35 ℃、37 ℃時(shí)，培養(yǎng)第7 天時(shí)菌懸液的OD640值分別為2.09 和1.62。當(dāng)溫度為25 ℃和40 ℃時(shí)，菌體的生長(zhǎng)狀況較差，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值分別為1.01、0.74。

2.4 pH 對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

圖4 pH 對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響Fig.4 The effect of pH on Pseudomonas bacillus BS1

2.5 NaCl 濃度對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

圖5 NaCl 濃度對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effect of NaCl concentration on Pseudomonas bacillus BS1

NaCl 濃度對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示。結(jié)果表明，假單胞桿菌BS1 的生長(zhǎng)隨NaCl 濃度的增加而逐漸受到抑制。當(dāng)培養(yǎng)基中不添加NaCl（濃度為0）時(shí)，菌體的生長(zhǎng)狀況最好，其次是NaCl 濃度為1%和3%時(shí)，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值分別為2.16、2.04 和1.74。當(dāng)NaCl 濃度為5%時(shí)，菌體的生長(zhǎng)明顯受到抑制，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值為1.20；當(dāng)NaCl 濃度為10%和15%時(shí)，菌體幾乎不再生長(zhǎng)，這表明過(guò)高的鹽濃度不利于假單胞桿菌BS1 的生長(zhǎng)繁殖。

2.6 裝液量對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響

圖6 裝液量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.6 The effect of broth concent on Pseudomonas bacillus BS1

裝液量對(duì)假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的影響如圖6 所示，試驗(yàn)結(jié)果表明：在250 mL 的三角瓶中，裝液量為130 mL 時(shí)菌體的生長(zhǎng)狀況最好，其次是裝液量為100 mL 和160 mL 時(shí)，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值分別為2.08、1.82 和1.81；當(dāng)裝液量為70 mL 時(shí)，菌體的生長(zhǎng)狀況較差，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值為1.33；當(dāng)裝液量為190 mL 時(shí)，菌體的生長(zhǎng)狀況最差，培養(yǎng)第7 d 時(shí)菌懸液的OD640值為1.15。

2.7 適宜培養(yǎng)條件下假單胞桿菌BS1 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖7 適宜培養(yǎng)條件下假單胞桿菌BS1 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.7 The growth curve of Pseudomonas bacillus BS1 on the optimal culture conditions

圖7 表示假單胞桿菌BS1 在適宜培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。從圖中可以看出：0～48 h 為菌體生長(zhǎng)延滯期，菌體生長(zhǎng)比較緩慢，菌體的數(shù)量只有少量增加，是菌體適應(yīng)新環(huán)境和積累能量的階段；48～156 h 為菌體快速生長(zhǎng)繁殖期，培養(yǎng)液中菌體的數(shù)量急劇增加；156～240 h 為菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期，菌體細(xì)胞的分裂速度減慢，菌體的生長(zhǎng)和死亡速率基本相等；由于培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、營(yíng)養(yǎng)比例失調(diào)以及代謝廢物的大量積累，菌體細(xì)胞的死亡速度大于分裂產(chǎn)生新細(xì)胞的速度，240 h 后為菌體衰亡期。

3 討論

碳源是供給菌株各種生命活動(dòng)所需能量和構(gòu)成菌株細(xì)胞及代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此選擇合適的碳源對(duì)菌株的生長(zhǎng)有很大的影響[6]。在水性基質(zhì)中，長(zhǎng)鏈烷烴的溶解度太小（10-5～10-10g·L-1），不足以維持微生物的生長(zhǎng)；但當(dāng)碳鏈小于C8時(shí)，烷烴會(huì)對(duì)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)造成破壞而產(chǎn)生毒性[7]。試驗(yàn)中，當(dāng)以正辛烷、正庚烷、正己烷為碳源時(shí)，隨著碳鏈長(zhǎng)度的減小，假單胞桿菌BS1 菌體的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，分析這可能是由于假單胞桿菌BS1 不能利用正己烷、正庚烷為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，或是由于正己烷、正庚烷對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生的毒性，使其生長(zhǎng)受到抑制，彭新榜等[8]和李習(xí)武等[9]的研究結(jié)果與此一致。同時(shí)，試驗(yàn)考慮到該假單胞桿菌BS1 是從被石油長(zhǎng)年污染的土壤中分離而得，而石油中含有蠟質(zhì)成分，故設(shè)置處理以液體石蠟為碳源，結(jié)果表明液體石蠟（主要成分為C16～C20正構(gòu)烷烴）為適宜假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的碳源。因此，可用假單胞桿菌BS1 來(lái)分解植物葉片表面的蠟質(zhì)層，該結(jié)果進(jìn)一步拓寬了假單胞桿菌BS1 的應(yīng)用領(lǐng)域。

接種量的大小對(duì)微生物生長(zhǎng)延滯期和生長(zhǎng)速度有一定的影響，是微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的一個(gè)重要控制參數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種量為1%和2%時(shí)，假單胞桿菌BS1 菌體的生長(zhǎng)延滯期較長(zhǎng)（0～3 d），菌體的生長(zhǎng)狀況較差，原因可能是接種量太少影響其生長(zhǎng)代謝。當(dāng)接種量分別為5%、7%、10%時(shí)，培養(yǎng)前期（0～4 d）菌體生長(zhǎng)較快，但培養(yǎng)后期（4～9 d）菌體的生長(zhǎng)狀況不如接種量為3%時(shí)，這可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)大會(huì)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在短間內(nèi)消耗過(guò)多，同時(shí)菌體產(chǎn)生大量的代謝物，從而抑制菌體的進(jìn)一步生長(zhǎng)，吳智誠(chéng)[10]的研究結(jié)果證明本結(jié)論。

試驗(yàn)結(jié)果表明溫度對(duì)假單胞桿菌BS1 菌體的生長(zhǎng)有一定的影響，當(dāng)溫度為25 ℃和40 ℃時(shí)，菌體的生長(zhǎng)狀況較差，這可能就是由于25 ℃和40 ℃的環(huán)境溫度影響細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng)，使菌體的生長(zhǎng)受到抑制，已報(bào)道文獻(xiàn)[11-12]的結(jié)論進(jìn)一步證明試驗(yàn)結(jié)果。

不同微生物對(duì)pH 值條件的要求各不相同，它們只能在一定的pH 值范圍內(nèi)生長(zhǎng)，這個(gè)范圍有寬有窄，而其生長(zhǎng)最適pH 值常限于一個(gè)較窄的范圍，對(duì)pH 值條件的不同要求，在一定程度上反映出微生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[13-14]。試驗(yàn)結(jié)果表明，假單胞桿菌BS1 菌體生長(zhǎng)的適宜pH 值為7.0，周群英等[15]報(bào)道的較適宜細(xì)菌生長(zhǎng)的pH 值在7.5 左右與研究結(jié)論基本吻合。

試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基中不添加NaCl（濃度為0%）時(shí)，適宜假單胞桿菌BS1 菌體的生長(zhǎng)，而葉和松[12]對(duì)產(chǎn)生物表面活性劑J3、T4 假單胞菌株的研究表明，其最佳生長(zhǎng)的NaCl 濃度為2%、3%，這可能是由于不同的菌株對(duì)鹽濃度的適應(yīng)能力有差異所致。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果還表明，過(guò)高的鹽濃度（NaCl 濃度在5%～15%）對(duì)假單胞桿菌BS1 菌體的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，這可能是由于高鹽環(huán)境中外滲透壓過(guò)高而導(dǎo)致菌體細(xì)胞嚴(yán)重失水收縮，質(zhì)壁分離而死亡，李湛江等[16]的報(bào)道與此結(jié)論一致。試驗(yàn)在明確適宜假單胞桿菌BS1 生長(zhǎng)的碳源為液體石蠟的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步摸索出假單胞桿菌BS1 液體培養(yǎng)的優(yōu)化條件，為今后生產(chǎn)應(yīng)用假單胞桿菌BS1 提供了基礎(chǔ)。

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