加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移體系的建立與優(yōu)化

王 露，朱世揚，趙春田，裘娟萍

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014)

黃霉素，又稱黃磷脂醇、默諾霉素、班堡霉 素，是一種磷酸糖脂類抗生素，是目前唯一已知的能直接抑制肽聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶的抗生素［1］。黃霉素具有促進動物生長、在動物體內(nèi)和農(nóng)畜產(chǎn)品中無殘留、對環(huán)境無污染、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。2001年，原農(nóng)業(yè)部頒布的《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中允許黃霉素預(yù)混劑作為飼料藥物添加劑使用。黃霉素殺菌作用較強，不與其他常用抗生素產(chǎn)生交叉抗性，能夠抑制動物腸道中革蘭氏陽性病原菌。2002年，原農(nóng)業(yè)部正式批準黃霉素預(yù)混劑為新獸藥［2］。加納鏈霉菌是黃霉素的主要生產(chǎn)菌。近年來，對黃霉素的研究主要集中在通過分子遺傳學(xué)或者化學(xué)方法改造加納鏈霉菌結(jié)構(gòu)、改良其藥代動力學(xué)特性方面［3］，為黃霉素的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

在利用分子生物學(xué)技術(shù)進行加納鏈霉菌基因改造的過程中，建立高效穩(wěn)定的遺傳操作系統(tǒng)是關(guān)鍵，但國內(nèi)外有關(guān)加納鏈霉菌遺傳操作系統(tǒng)方面的研究鮮見報道。目前，接合轉(zhuǎn)移是大腸埃希菌與鏈霉菌之間最常用的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。本文研究接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基、孢子預(yù)萌發(fā)條件、接合體系中供體菌與受體菌的濃度比，以及抗生素添加時間，選擇最適條件，建立并優(yōu)化大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移體系，為深入開展該菌的分子遺傳操作、提高該菌產(chǎn)生黃霉素的能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1.1 菌株和質(zhì)粒

加納鏈霉菌(Streptomyces ghanaensis)ATCC 14672、大腸埃希菌(Escherichia coli)DH5α、E．coli ET12567(pUZ8002)均由本實驗室保藏。質(zhì)粒pMD-19購自TaKaRa公司。質(zhì)粒pIJ8630由浙江大學(xué)李永泉教授惠贈。質(zhì)粒pIJ8630-nsdA在pIJ8630的基礎(chǔ)上構(gòu)建。

1．1.2 酶和試劑

安普霉素(Apr)、硫鏈絲菌素(Tsr)、鏈霉素(Str)、卡那霉素(Km)、氯霉素(Cm)、氨芐西林(Amp)、萘啶酸(NA)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司;rTaq、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA分子量標準物均購自TaKaRa公司;FastAP購自Thermo公司。

1．1.3 培養(yǎng)基

大腸埃希菌培養(yǎng)基為2×YT［4］;加納鏈霉菌液體培養(yǎng)基為TSB，固體培養(yǎng)基為YMS、2CMY、MM、AS-1、MS、改良高氏一號(簡稱 RG)和 TSB固體，配方參見文獻［5－6］。接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基WL50(g·L－1):可溶性淀粉 5，氯化鈉 2.5，硫酸鎂3.6，氯化鎂4.8，酵母浸出粉1，丙氨酸0.2，精氨酸0.2，天冬酰胺0.5，瓊脂20，pH值7.5(滅菌前)，115℃滅菌30 min。

1．2 方法

1．2.1 基本遺傳操作

加納鏈霉菌ATCC 14672的培養(yǎng)方法參見文獻［7］。大腸埃希菌培養(yǎng)方法、感受態(tài)的制備及DNA轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實驗指南》［4］。加納鏈霉菌總DNA的提取方法和接合轉(zhuǎn)移頻率的計算方法參照《鏈霉菌遺傳操作手冊》［5］。

1．2.2 重組質(zhì)粒pIJ8630-nsdA構(gòu)建

以加納鏈霉菌ATCC 14672基因組為模板，采用特異性引物nsdA-F:5’-GGGCTCTAGAGTGAGCGGCAACGGCGG-3’ 和 nsdA-R: 5’-CCAATCTAGATGGCATGGGGGAGCCGAG-3’(下劃線為XbaⅠ酶切位點)，PCR擴增長度1 590 bp的nsdA基因。進行TA克隆，轉(zhuǎn)化E．coli DH5α，經(jīng)測序驗證后提取質(zhì)粒，XbaⅠ酶切回收nsdA基因片段。經(jīng)XbaⅠ單酶切、去磷酸化后的pIJ8630線性質(zhì)粒用T4 DNA連接酶與nsdA基因片段連接，轉(zhuǎn)化E．coli DH5α，PCR驗證Apr抗性平板上的陽性克隆。轉(zhuǎn)化子送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。檢測引物序列為:CK-F，5’-CGACTCGGCTCCCCCATGCC-3’;CK-R， 5’-AACGCCAGCAAC GCGGCC-3’。

1．2.3 重組質(zhì)粒 pIJ8630-nsdA轉(zhuǎn)化 E．coli ET12567(pUZ8002)

將重組質(zhì)粒 pIJ8630-nsdA轉(zhuǎn)化到 E．coli ET12567(pUZ8002)感受態(tài)細胞中，利用 Apr、Cm、Km抗性平板篩選抗性菌落，再以特異性引物PCR進行轉(zhuǎn)化子的驗證。轉(zhuǎn)化子檢測引物序列同1.2.2節(jié)。

1．2.4 E．coli ET12567(pUZ8002，pIJ8630-nsdA)與加納鏈霉菌ATCC 14672的接合轉(zhuǎn)移

挑取 E．coli ET12567(pUZ8002、pIJ8630-nsdA)新鮮單菌落，接種于5 mL 2×YT液體培養(yǎng)基( 含 50 μg·mL－1Apr、25 μg·mL－1Cm、25 μg·mL－1Km)中，37 ℃、200 r·min－1培養(yǎng)過夜，按 1∶100的比例轉(zhuǎn)接到含相同抗生素的50 mL 2×YT液體培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)至對數(shù)生長期收集菌體，洗滌2次后懸浮備用。

在加納鏈霉菌平板上加入適量2×YT液體培養(yǎng)基，制備孢子懸液，振蕩充分打散孢子，過濾，孢子懸浮液濃度控制在108cfu·mL－1。50℃熱激10 min，37℃振蕩預(yù)培養(yǎng)3 h，備用。取500 μL備用的E．coli ET12567菌懸液與500 μL加納鏈霉菌孢子濾液混合，4 000 r·min－1離心 5 min，棄去大部分上清，用殘留液懸浮菌體后涂布于含10 mmol·L－1MgCl2的接合轉(zhuǎn)移平板，于 30 ℃培養(yǎng)14 h 后用抗生素水溶液(含 50 μg·mL－1Apr、500 μg·mL－1NA)洗去大腸埃希菌，然后取 1 mL抗生素水溶液覆蓋平板，30℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d長出接合子。用接合子數(shù)/初始孢子數(shù)表示接合轉(zhuǎn)移頻率［5］。

1．2.5 接合子的PCR驗證

取適量接合子菌絲體到含有50 μg·mL－1Apr的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集菌絲體，提取鏈霉菌總DNA為模板。根據(jù)質(zhì)粒pIJ8630-nsdA上的Apr抗性基因aac(3)IV來設(shè)計引物，驗證陽性接合子。PCR反應(yīng)程序:95℃ 5 min;95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 50 s，30個循環(huán);72℃ 延伸 10 min。引物序列:Apr-F，5’-TCTTCGCATCCCGCCTCTGG-3’;Apr-R，5’-GCAATACGAATGGCGAAAAG-3’。

2 結(jié)果與分析

2．1 供體菌構(gòu)建

nsdA基因保守存在于多種鏈霉菌中，對鏈霉菌產(chǎn)孢、形態(tài)分化，以及抗生素合成均有負調(diào)控作用［8］。為研究接合轉(zhuǎn)移條件，構(gòu)建nsdA基因過表達質(zhì)粒 pIJ8630-nsdA，其圖譜見圖 1。pIJ8630-nsdA的酶切鑒定結(jié)果如圖2所示，泳道1表明該質(zhì)粒經(jīng)Xba I單酶切，得到7.9 kb大小的空載片段與1 590 bp的nsdA基因全長條帶，與預(yù)期相符。將pIJ8630-nsdA轉(zhuǎn)化到E．coli ET12567(pUZ8002)中，并利用特異性引物CK-F、CK-R進行PCR驗證。將驗證正確的轉(zhuǎn)化子E．coli ET12567(pUZ8002，pIJ8630-nsdA)作為接合轉(zhuǎn)移的供體菌。

2．2 受體菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基選擇

在以鏈霉菌孢子為受體的接合轉(zhuǎn)移中，孢子的數(shù)量直接決定著接合頻率。將濃度約為108cfu·mL－1的加納鏈霉菌孢子液等量分別均勻地涂布在 YMS、2CMY、AS-1、MS、RG、TSB 和 MM 培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7 d。加納鏈霉菌在 YMS、2CMY、AS-1這3種培養(yǎng)基上菌苔厚實且孢子致密，其中，在2CMY培養(yǎng)基上孢子量最大;在MM培養(yǎng)基上菌苔稀薄;在MS、RG、TSB培養(yǎng)基上菌體生長速度快、菌苔厚實，但產(chǎn)孢量少。綜上，選定2CMY培養(yǎng)基用于加納鏈霉菌產(chǎn)生孢子。

2．3 接合子篩選標記選擇

圖1 質(zhì)粒pIJ8630-nsdA圖譜Fig．1 Map of plasmid pIJ8630-nsdA

圖2 重組質(zhì)粒pIJ8630-nsdA的酶切鑒定Fig．2 Restriction endonuclease identification of recombination plasmid pIJ8630-nsdA

為選擇大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的抗性標記、確定合適的抗生素篩選濃度，考查加納鏈霉菌對4種在鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中常用抗生素的敏感性。結(jié)果表明，該菌對安普霉素、硫鏈絲菌素、鏈霉素均非常敏感，當(dāng)濃度為12.5 μg·mL－1時即可完全抑制菌體生長，而卡那霉素則需在25 μg·mL－1的濃度下才能抑制加納鏈霉菌的生長。確定以安普霉素基因aac(3)IV為篩選標記。

2．4 大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移條件的單因素優(yōu)化

2．4.1 加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基

一種適合接合轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)基應(yīng)該同時滿足大腸埃希菌和鏈霉菌生長，并且使兩者生長速度均衡又有利于觀察接合子。本研究以加納鏈霉菌孢子為受體菌、E．coli ET12567為供體菌，依據(jù)加納鏈霉菌在不同培養(yǎng)基上的生長速度，同時參考其他鏈霉菌的最適接合培養(yǎng)基，選擇2CMY、MS、AS-1、RG、TSB的固體培養(yǎng)基進行接合轉(zhuǎn)移效果比較。結(jié)果顯示，在AS-1、MS、TSB固體培養(yǎng)基上接合子生長良好，且速度快，其中，AS-1接合平板的接合頻率最高(圖3)，所以選擇AS-1為大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。

Mg2+是眾多蛋白酶的輔因子，參與酶活性中心的形成。Choi等［9］研究表明，增加 Mg2+濃度能顯著提高接合轉(zhuǎn)移頻率。AS-1培養(yǎng)基中含有83 mmol·L－1MgSO4。試驗表明，在 30 ～150 mmol·L－1范圍內(nèi) MgSO4濃度的改變對接合轉(zhuǎn)移頻率沒有顯著影響。Mg2+除了來源于MgSO4，還來源于MgCl2。在標準的鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移方法中，MgCl2以 10 mmol·L－1的濃度加入接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。本試驗將AS-1培養(yǎng)基中MgSO4濃度調(diào)整為30 mmol·L－1后，再向其中添加不同濃度的MgCl2(0、10、20、40、50 mmol·L－1)作為接合培養(yǎng)基。結(jié)果(圖4)表明，接合轉(zhuǎn)移頻率隨著MgCl2濃度的提高而提高。將接合轉(zhuǎn)移頻率最高的培養(yǎng)基配方命名為WL50。

圖3 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對接合轉(zhuǎn)移頻率的影響Fig．3 Effect of different basal media on conjugation frequency

2．4.2 加納鏈霉菌孢子預(yù)萌發(fā)條件

熱激處理的目的是為了促進孢子萌發(fā)。過高的溫度會使孢子存活率降低，過低的溫度又起不到促進孢子萌發(fā)的作用。常規(guī)的鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移過程中的熱激條件為50℃、10 min。為了確定加納鏈霉菌孢子萌發(fā)的最適熱激溫度和處理時間，設(shè)定40、45、50、55 ℃共4 個溫度，每個溫度選擇5、10、15、20 min 4 個時間梯度進行接合試驗。結(jié)果(圖5)表明，50℃、5 min為最佳的加納鏈霉菌孢子熱激條件。

圖4 接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中MgCl2濃度對接合轉(zhuǎn)移頻率的影響Fig．4 Effect of MgCl2concentration in conjugational transfer media on conjugation frequency

圖5 不同孢子熱激條件對接合轉(zhuǎn)移頻率的影響Fig．5 Effect of different spore heat treatment on conjugation frequency

熱激后的預(yù)培養(yǎng)處理有助于提高孢子的萌發(fā)頻率，從而提高接合頻率;但預(yù)培養(yǎng)時間過長會造成芽管萌發(fā)過長，受體聚集成團，出現(xiàn)多核細胞，難以獲得單菌落，造成接合轉(zhuǎn)移假陽性率增高。為了研究不同預(yù)培養(yǎng)時間對接合轉(zhuǎn)移的影響，將孢子50℃熱激10 min后，進行37℃預(yù)培養(yǎng)，以0.5 h為間隔取樣鏡檢。從圖6可以看出，預(yù)培養(yǎng)1.5 h時，由于孢子萌發(fā)，部分孢子體積開始膨大，細胞內(nèi)氧化還原酶系開始活躍，美蘭著色變淺，菌體呈空心圓形。隨著預(yù)培養(yǎng)時間延長，體積變大的孢子數(shù)占比增大。3.0 h以后，大部分孢子美蘭不著色，呈現(xiàn)空心狀。到3.5 h時，有少量菌絲出現(xiàn)，孢子容易被菌絲纏繞而聚集。

取不同時間預(yù)培養(yǎng)的孢子為受體進行接合轉(zhuǎn)移，結(jié)果(圖7)顯示，在孢子預(yù)培養(yǎng)1.5～3.5 h期間，接合轉(zhuǎn)移頻率差別并不大，預(yù)培養(yǎng)3.0 h頻率相對較高。

2．4.3 接合轉(zhuǎn)移體系中供體菌和受體菌的比例

不同鏈霉菌的生理特性不同，因此，在接合轉(zhuǎn)移過程中所需的最適供體菌與受體菌比例存在差異。為了探索大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移體系的最佳供受體比例，限定受體菌的數(shù)量為108，將供體菌與受體菌細胞數(shù)分別以1∶100、1∶10、1∶5、1∶1、5∶1、10∶1的比例混合，進行接合轉(zhuǎn)移試驗。依據(jù)圖8的結(jié)果，選定10∶1作為最佳的供受體比例。

2．4.4 接合轉(zhuǎn)移過程中安普霉素的添加時間

由于鏈霉菌在接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基上生長速度存在差異，因此，抗生素添加時間對接合轉(zhuǎn)移頻率及接合子的有效檢出就會產(chǎn)生影響。對加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移過程中安普霉素添加時間進行研究，結(jié)果(圖9)顯示，涂板后培養(yǎng)14 h時添加安普霉素效果最佳。

2．5 大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移條件的多因素優(yōu)化

圖6 不同預(yù)培養(yǎng)時間下孢子形態(tài)觀察Fig．6 Spore morphology at different pre-incubation times

圖7 孢子預(yù)培養(yǎng)時間對接合轉(zhuǎn)移頻率的影響Fig．7 Effect of pore pre-incubation time on conjugation frequency

圖8 供受比對接合轉(zhuǎn)移頻率的影響Fig．8 Effect of ratio of donor to recipient on conjugation frequency

圖9 安普霉素添加時間對接合轉(zhuǎn)移頻率的影響Fig．9 Effect of apramycin addition time on conjugation frequency

基于單因素試驗結(jié)果，選取對大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移頻率有較大影響的因素(A，MgCl2濃度;B，熱激時間;C，供受比)，進行大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移試驗，每因素分別設(shè)置 3 個水平:A1，30 mmol·L－1，A2，50 mmol·L－1，A3，80 mmol·L－1;B1，5 min，B2，10 min，B3，15 min;C1，5∶1，C2，10∶1，C3，15∶1。從正交試驗結(jié)果(表1)看出，各因素對接合轉(zhuǎn)移頻率的影響為供受比＞MgCl2濃度＞熱激時間。理論最優(yōu)水平組合為A2B3C3，實際最優(yōu)水平組合為A2B2C3。

對正交試驗結(jié)果進行檢驗，結(jié)果表明，實際最優(yōu)組合A2B2C3與理論最優(yōu)組合A2B3C3的接合轉(zhuǎn)移頻率相近，與未優(yōu)化接合轉(zhuǎn)移條件相比，接合頻率提高了20.3倍。

2．6 接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化子驗證

以E．coli ET12567為供體，加納鏈霉菌孢子為受體，進行接合轉(zhuǎn)移試驗。質(zhì)粒pIJ8630-nsdA含有安普霉素抗性基因aac(3)IV和attP位點，屬于整合型質(zhì)粒，可以整合到鏈霉菌基因組attB位點上，并隨基因組的復(fù)制而復(fù)制。經(jīng)安普霉素平板篩選得到抗性菌落，分離純化后，隨機挑選9株接合子，分別提取其總DNA，使用特異性引物Apr-F、Apr-R擴增 aac(3)IV內(nèi)部744 bp序列。接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化子的PCR驗證結(jié)果如圖10所示，以pIJ8630-nsdA質(zhì)粒DNA(陽性對照)和9株接合子DNA為模板，均能擴增出預(yù)期片段(744 bp)，而以出發(fā)株加納鏈霉菌 ATCC 14672總DNA為模板(陰性對照)則沒有條帶，說明質(zhì)粒pIJ8630-nsdA成功接合轉(zhuǎn)移進入加納鏈霉菌。

3 討論

本文通過對接合轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵因素進行優(yōu)化，建立了一套較高效的大腸埃希菌-加納鏈霉菌ATCC 14672接合轉(zhuǎn)移方法，接合頻率提高95.3%。研究發(fā)現(xiàn):1)由于接合轉(zhuǎn)移過程中需要DNA轉(zhuǎn)移酶、細胞壁水解酶等多種蛋白酶作用，因此，鎂離子可能參與這些酶活性中心的形成［10］。在鏈霉菌常用培養(yǎng)基中，只有AS-1培養(yǎng)基中含有大量鎂離子，所以AS-1培養(yǎng)基上接合頻率明顯較高。2)接合轉(zhuǎn)移頻率隨供受比增大而提高。這是因為隨著供體菌濃度增加，單位數(shù)量的鏈霉菌所接觸到的供體數(shù)量增加，進行接合轉(zhuǎn)移的幾率增高，故接合轉(zhuǎn)移頻率增高。供受比為15∶1時頻率最高，在今后的試驗中，可嘗試提高供受比。3)當(dāng)熱激溫度低于50℃時，達不到多數(shù)加納鏈霉菌孢子萌發(fā)的條件，而高于50℃，會對孢子造成不定程度的損傷。隨著熱激時間延長，孢子活力降低，接合頻率隨之降低。4)由于群體中各個孢子萌發(fā)有先后，在3.5 h內(nèi)每個時間段具接合轉(zhuǎn)移最佳狀態(tài)的孢子所占比例相差不大，所以預(yù)培養(yǎng)時間對接合頻率影響不大。5)接合14 h左右，大腸埃希菌中質(zhì)粒向加納鏈霉菌轉(zhuǎn)移過程基本完成，此時接合頻率最高。小于14 h覆蓋抗生素，阻斷了部分菌體間的接合，導(dǎo)致接合頻率降低;而超過14 h后，由于生長速度的極大差異，過量的大腸埃希菌會產(chǎn)生菌膜覆蓋在鏈霉菌表面，與其爭奪氧氣與營養(yǎng)，導(dǎo)致鏈霉菌生長受到抑制，接合轉(zhuǎn)移率下降。

表1 正交試驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析Table 1 Results and data analysis of orthogonal test

圖10 S．ghanaensis(pIJ8630-nsdA)接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物電泳檢測圖Fig．10 Electrophoresis analysis of PCR products of S．ghanaensis(pIJ8630-nsdA)exconjugants

加納鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移體系的建立及優(yōu)化是對其進行分子遺傳操作、構(gòu)建黃霉素高產(chǎn)菌株，以及驗證一些調(diào)控基因和次級代謝產(chǎn)物合成基因功能的必要前提。本研究為獲得更優(yōu)的大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合條件提供了參考，同時為實現(xiàn)基因工程菌株的構(gòu)建，以提高該菌產(chǎn)生黃霉素的能力奠定了基礎(chǔ)。