寧夏地區(qū)慢性乙型肝炎患者乙肝病毒基因分型與耐藥突變分析

趙志軍 劉紅玲 鐘 利 趙倩穎 董 潔 蘇雅靜

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)屬嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬，是引起乙型肝炎(簡(jiǎn)稱乙肝)的病原體，全世界每年大約有超過70萬人死于乙肝的并發(fā)癥(如肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌)[1]。中國HBV攜帶者約有7800萬，慢性乙肝(Chronic Hepatitis B，CHB)患者占全球患病人數(shù)的十分之一，約2000萬人。每年有30萬人死于HBV相關(guān)的肝硬化和肝細(xì)胞癌，占全球死亡率的37%—50%[2]。近幾十年來，HBV感染的治療藥物主要依賴于干擾素(IFN)和核苷(酸)類似物 (Nucleoside/Nudeotide Analogues，NAs)這兩大類。IFN具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗纖維化的優(yōu)點(diǎn)，但由于副作用嚴(yán)重、使用不便利、禁忌癥較多等因素，臨床應(yīng)用相對(duì)較少。而核苷類藥物具有更強(qiáng)的抑制病毒復(fù)制的能力，故而更受臨床青睞。然而在長(zhǎng)期治療過程中，拉米夫定(Lamivudine，LAM)和阿德福韋(Adefovir，ADV)出現(xiàn)了嚴(yán)重的病毒反彈及血清學(xué)突破現(xiàn)象，因此臨床開始關(guān)注耐藥突變和HBV基因分型的情況。本課題擬使用直接測(cè)序法對(duì)寧夏地區(qū)226例樣本的逆轉(zhuǎn)錄區(qū)(RT區(qū))進(jìn)行耐藥位點(diǎn)突變檢測(cè)，并進(jìn)行基因分型，明確該地區(qū)CHB患者的優(yōu)勢(shì)基因型及耐藥情況，為CHB患者個(gè)體化醫(yī)療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016-08-2017-12寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院住院及門診的CHB患者226例，納入標(biāo)準(zhǔn)為HBsAg陽性(持續(xù)≥6個(gè)月),且HBV-DNA陽性(拷貝數(shù)>1.0×103)。其中男150例，女76例，年齡4-73歲,平均年齡39.06±14.26歲。患者均來自寧夏本地區(qū)、縣，均符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)全國CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者就診信息在醫(yī)院系統(tǒng)均有完整的登記，包括姓名、年齡、電話、民族、臨床診斷、診斷時(shí)間、是否接受藥物治療、治療時(shí)間以及常見血清標(biāo)志物等信息。排除合并或重疊其它類型肝炎病毒感染、HIV、自身免疫性肝炎其它病毒感染或其它原因所致活動(dòng)性肝病及合并酒精性肝病、脂肪肝等。是否應(yīng)用抗病毒藥物不作為排除標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 主要試劑與儀器

主要試劑：QIAamp MinElute Virus Spin Kit(德國QIAGEN公司，批號(hào)：154021378)；2000 DNA marker[天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：Q5725]；2×Taq plus Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：A2701-1)。HBV核酸熒光檢測(cè)試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因試劑公司，批號(hào)：2017008)。儀器：全自動(dòng)免疫發(fā)光儀(E-170/E-601，瑞士ROCHE公司)；全自動(dòng)生化分析儀(ADVIA 2400，德國SIEMENS公司)；熒光定量PCR儀(Prism 7300，美國ABI公司)；梯度PCR儀(AG 22331 Hamburg，德國EPPENDORF公司)；凝膠自動(dòng)分析和成像儀(ChemiDocTM MP Imaging System，美國Bio-Rad公司)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.4.1 血清學(xué)標(biāo)志物、生化相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)：乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗體(HBsAb)、乙肝核心抗體(HBcAb)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗體(HBeAb)均采用ROCHE公司生產(chǎn)的 Cobas E-170/E-601全自動(dòng)免疫發(fā)光儀及配套試劑盒進(jìn)行定量分析，檢測(cè)方法為化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法。生化相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)：采用德國西門子公司ADVIA 2400型血液生化分析儀及原廠配套試劑盒檢測(cè)。所有標(biāo)本留取清晨空腹靜脈血5ml，2h內(nèi)分離血漿，-20℃冷藏保存批檢。

1.4.2 HBV-DNA檢測(cè)：所有標(biāo)本留取清晨空腹靜脈血2ml，2h分離血漿，-20℃冷藏保存批檢。采用美國生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的ABI Prism7 300熒光定量 PCR儀進(jìn)行定量分析，使用HBV核酸熒光檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)下限為 100IU/ml。每批PCR試驗(yàn)均設(shè)陽性、臨界陽性和陰性對(duì)照，并嚴(yán)格按照說明書操作。

1.4.3 HBV耐藥基因突變檢測(cè)及分型分析：所有患者留取清晨空腹靜脈血5ml，立即分離血漿，-20℃冷藏保存。按照Qiagen(凱杰)全基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行血漿樣本的HBV- DNA基因組提取，采用普通PCR擴(kuò)增HBV P區(qū)序列(Genbank ID：AY123041.1)，PCR反應(yīng)條件為50μl反應(yīng)體系，95℃預(yù)變性3min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，35個(gè)循環(huán)。引物使用Primer 3在線設(shè)計(jì)，序列為：5’-GAC AGT CAT CCT CAG GCC AT-3’、5’-TAT GGA TCG GCA GAG GAA CC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為1 299bp。引物合成、雙向測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用NCBI BLAST及DNAMAN等軟件進(jìn)行分析，確定突變位點(diǎn)和基因型別。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 226例CHB患者HBV基因型分布

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在NCBI上與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，本研究226例樣本中，其中B基因型22例占9.74%，C基因型168例占74.34 %，D基因型18例占7.96%例，混合型18例占7.96%。

2.2 C基因型與非C基因型CHB患者血清學(xué)標(biāo)志物、HBV-DNA水平比較

根據(jù)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)結(jié)果，C型ALT水平高于非C型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C型與非C型間HBsAg、 HBeAg 及HBV-DNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 C基因型與非C基因型CHB患者血清學(xué)標(biāo)志物、HBV-DNA水平比較[M(QL，QV)]

注：與非C型比較，1)P<0.05

2.3 41例CHB患者RT區(qū)變異位點(diǎn)及耐藥情況

226例樣本中，檢測(cè)到41例發(fā)生耐藥變異，變異率為18.1%。以單點(diǎn)突變r(jià)tM204I/V為主，單點(diǎn)突變7例，突變率為11.86%；混合突變及單點(diǎn)突變包含rtM204突變共18例，突變率為30.5%。其余還檢測(cè)到rtL180M、rtV214A、rtA181T/V、rtS213T等位點(diǎn)的變異。檢測(cè)到多位點(diǎn)變異rtS213T +rtA181S+rtN236T+rtS202I、rtM204V+rtL180M+rtT184A等13例，主要耐藥藥物為拉米夫定。其中2例特殊耐藥rt204+rt180+rt184 和rt204+rt180+rt202對(duì)拉米夫定、替比夫定和恩替卡韋均耐藥。見表2。

2.4 41例耐藥患者耐藥位點(diǎn)突變率統(tǒng)計(jì)

如圖1所示，本地區(qū)耐藥突變主要發(fā)生在與拉米夫定耐藥相關(guān)的位置，主要集中在rt204、rt180位點(diǎn)，突變率分別為30.51%和20.34%，在rt173和rt213位點(diǎn)突變率也分別為5.08%和8.47%。其次為耐阿德福韋的rt181位點(diǎn)，突變率為13.56%。

圖1 HBV-DNA RT區(qū)常見耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變率

2.5 不同基因型在某個(gè)位點(diǎn)突變率的比較

B基因型rt184和rt204位點(diǎn)突變率均高于C基因型(P<0.01)。B基因型rt204位點(diǎn)突變率高于D基因型，rt213位點(diǎn)突變率低于D基因型(P<0.05)。D基因型rt214位點(diǎn)突變率高于C基因型(P<0.01)。其它基因型各位點(diǎn)突變率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)結(jié)果見表3。

表2 41例慢性乙型肝炎患者P(RT)區(qū)變異位點(diǎn)及耐藥情況

表3 不同基因型在不同位點(diǎn)突變率的比較(n,%)

3 討論

HBV感染一直是全世界健康安全面臨的巨大挑戰(zhàn)。雖然乙肝的第一步預(yù)防已經(jīng)取得明顯成效，但是由于我國人口基數(shù)大，感染率高等因素，HBV感染形勢(shì)依然嚴(yán)峻。

藥物治療依然是目前針對(duì)HBV的最佳選擇，在藥物和人體免疫環(huán)境雙重引導(dǎo)下，逆轉(zhuǎn)錄區(qū)(HBV基因組的rt區(qū))開始出現(xiàn)氨基酸替換[4]，不僅會(huì)出現(xiàn)單點(diǎn)突變，還可能在同一段序列中出現(xiàn)多處堿基改變，賦予了病毒對(duì)多種藥物耐藥的可能。在rt區(qū)，最常見突變的是M204I/V(又被稱為YMDD變異)，通常與拉米夫定和其他L-嘧啶類藥物密切相關(guān)。其次常發(fā)生于使用了阿德福韋后，在N236T突變的基礎(chǔ)上出現(xiàn)A181T/V/S突變模式。第三種是已發(fā)生M204V突變后，進(jìn)一步出現(xiàn)L180M和T184A/G/I/L/S或S202C/G/I或M250V等位點(diǎn)的突變，這些突變足以導(dǎo)致對(duì)恩替卡韋的耐藥。雖然至今為止仍沒有明確替諾福韋耐藥模式，但與其相關(guān)的rtA194T突變依然需要持續(xù)關(guān)注，因此，該藥物被指定用于治療對(duì)其它藥物均有耐藥性的患者。已有研究表明替諾福韋與阿德福韋存在交叉耐藥的可能性，對(duì)阿德福韋耐藥的A181V/T和N236T型的病毒株對(duì)替諾福韋只能產(chǎn)生微弱應(yīng)答[5]。

本研究中共226例樣本，檢測(cè)到41例發(fā)生耐藥變異，變異率為18.1%。其中以單點(diǎn)突變r(jià)tM204I/V為主，此位點(diǎn)的總突變率高達(dá)30.5%。還檢測(cè)到13例多位點(diǎn)變異，其中1例樣本同時(shí)存在四個(gè)突變位點(diǎn)。有2例M204V突變的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步出現(xiàn)L180M和T184A/G/I/L/S或S202C/G/I突變的樣本，正如Keskin等[5]的研究所示，患者均已出現(xiàn)恩替卡韋的耐藥情況。在寧夏地區(qū)耐藥仍然是一個(gè)大問題，由于經(jīng)濟(jì)原因，大量患者仍在使用第一代NAs，積累了大量的拉米夫定耐藥患者，這也為恩替卡韋耐藥株的出現(xiàn)提供了基礎(chǔ)。對(duì)于已發(fā)生M204V變異的患者，更應(yīng)該慎重合理的選擇用藥，及時(shí)監(jiān)測(cè)耐藥突變位點(diǎn)的情況，避免出現(xiàn)多重耐藥而增加治療難度。若已出現(xiàn)多重耐藥，則更應(yīng)該監(jiān)測(cè)其耐藥突變位點(diǎn)，合理優(yōu)化治療方案，避免病情失去控制而進(jìn)一步加重。

在本研究中，C基因型168例，占74.34%，依然是寧夏地區(qū)的優(yōu)勢(shì)基因型。另外還發(fā)現(xiàn)了B基因型22例，D基因型以及混合型均為18例?；蛐头植寂cChen等人[6]的研究結(jié)果相符。與之前寧夏地區(qū)相關(guān)的研究相比，新發(fā)現(xiàn)了18例D型基因。這可能由于過去的研究中樣本量過少所導(dǎo)致，還有可能是自然選擇的結(jié)果。在混合型中均有C型的一部分，這證明C基因型在本地區(qū)有著絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。多位研究者相關(guān)研究結(jié)果曾表明，C基因型患者肝臟炎癥與纖維化程度較B基因型嚴(yán)重，并且與重癥肝炎相關(guān)，是乙肝病毒感染向肝硬化肝癌進(jìn)展的高風(fēng)險(xiǎn)因子[7]。在本研究中C基因型的患者HBV-DNA水平均值稍高于非C基因型組，并且ALT水平顯著高于非C組。說明寧夏地區(qū)C基因型患者的肝臟炎癥程度相較于其他基因型更重且病毒復(fù)制更為活躍。與上述觀點(diǎn)完全相符，與曹軍皓等人[8]的研究結(jié)果也相同。

本研究結(jié)果表明B基因型rt184和rt204兩個(gè)位點(diǎn)的突變率均高于C基因型，與Mirandola等[9]、楊夢(mèng)媛等[10]的研究結(jié)果一致。有研究顯示C基因型多藥耐藥的發(fā)生率較B基因型高。且更傾向發(fā)生rtT184/rtS202的突變模式，而B基因型更傾向于發(fā)展為rtM250的突變模式[11]。在本課題中，寧夏地區(qū)C基因型更傾向發(fā)生rtM204的突變模式，且較其它基因型更容易發(fā)生拉米夫定耐藥。

綜上，CHB的治療雖然已取得顯著成果，但是NAs相關(guān)的耐藥問題是必須要面對(duì)的挑戰(zhàn)。不同基因型不僅在臨床表現(xiàn)不一致，還在對(duì)藥物治療的反應(yīng)以及治療的效果上都有所不同，因此臨床上檢測(cè)CHB患者的HBV基因型，及時(shí)調(diào)整治療方案，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化診治，將CHB帶來的損失和傷害控制在最低水平。及時(shí)了解基因型耐藥突變體的流行信息，也為減少HBV耐藥株的傳播，制訂預(yù)防耐藥發(fā)生措施提供依據(jù)。