71例自然流產(chǎn)胚胎組織染色體微陣列檢測結(jié)果分析

周方元 李 艷*

自然狀態(tài)(非人為目的造成)發(fā)生的流產(chǎn)稱為自然流產(chǎn)。在所有臨床確認(rèn)的妊娠中，自然流產(chǎn)的發(fā)生率約為15%[1]。發(fā)生在12周以前的流產(chǎn)定義為早期流產(chǎn)，妊娠12周至不足28周的流產(chǎn)定義為晚期流產(chǎn)。其中連續(xù)自然流產(chǎn)2次以上稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[2]，在育齡期婦女中發(fā)生率為4.1%[3]。自然流產(chǎn)的原因主要包括染色體異常、母體內(nèi)分泌失調(diào)、生殖道感染、母體生殖道異常、不健康生活方式等[4]，其中孕早期流產(chǎn)的胚胎組織中，染色體異常的發(fā)生率為50%—60%[5]，可見流產(chǎn)組織的核型分析對明確流產(chǎn)原因有著重要作用。傳統(tǒng)的核型分析技術(shù)需要對流產(chǎn)組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，污染率和失敗率較高，且存在分辨率低、報告周期長等缺陷[6]。隨后出現(xiàn)的熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)雖然分辨率有所提高，但該技術(shù)不能覆蓋全基因組，只能針對已知疾病進(jìn)行探針選擇。近十年來染色體微陣列分析技術(shù)(CMA)日趨成熟，該技術(shù)具備分辨率高、自動化程度高、不需要細(xì)胞培養(yǎng)、報告周期短、全基因組覆蓋等優(yōu)點，成為了目前檢測染色體微重復(fù)與微缺失的最有力工具。因此，中國產(chǎn)前診斷應(yīng)用專家組在2014年發(fā)布的指南中提出，對于胎死宮內(nèi)或死產(chǎn)需行遺傳學(xué)分析者，建議對胎兒組織行CMA檢測，以提高其病因的檢出率[7]。據(jù)此，本研究選用CMA技術(shù)針對71例自然流產(chǎn)組織進(jìn)行染色體檢測，評估CMA技術(shù)對自然流產(chǎn)病因分析的臨床價值。

1 對象與方法

1.1 資料及分組

2017-10—2018-03在武漢大學(xué)人民醫(yī)院就診的自然流產(chǎn)患者71例，年齡22—45歲，平均年齡31.39±4.61歲。留取標(biāo)本時，同時采集所有孕婦的外周血(應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列連鎖分析技術(shù)排除母體細(xì)胞污染[8])。根據(jù)受檢者流產(chǎn)時孕齡，將孕齡<12周的歸為早期流產(chǎn)組(n=49)，孕齡12—28周的歸為晚期流產(chǎn)組(n=22)；根據(jù)受檢者此次流產(chǎn)之前是否具有流產(chǎn)史，將受檢者分為有流產(chǎn)史組(n=49)和無流產(chǎn)史組(n=22)；根據(jù)受檢者是否為輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproductive Technology，ART)受孕，將受檢者分為ART組(n=14)和非ART組(n=57)。所有行CMA檢測的患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

所有流產(chǎn)組織及外周血采用QIAGEN公司的DNeasy Blood & Tissue Kit(50)試劑盒提取DNA(貨號：69504)。CMA檢測采用美國Affymetric公司的CytoScan 750K型芯片。實驗嚴(yán)格按照Affymetric公司的配套說明書進(jìn)行。提取流產(chǎn)物DNA后，實驗嚴(yán)格按照 Affymetric 公司的配套說明書進(jìn)行， 用NSP I限制性內(nèi)切酶消化后連接通用接頭，對產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物用磁珠純化后進(jìn)行隨機片段化，將片段化產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記后即可與芯片雜交讀取數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 71例流產(chǎn)組織CMA檢測結(jié)果

71例流產(chǎn)組織進(jìn)行CMA檢測，均獲得檢測結(jié)果，成功率為100.00%，其中異常結(jié)果31例，異常率為43.66%。異常結(jié)果中三體異常20例，主要包括2號、4號、8號、9號、13號、14號、16號、21號、22號及X染色體；X單體5例；四體一例，為19號染色體；整三倍體2例；結(jié)構(gòu)異常2例，為XP22.33 or Yp11.32p11.31缺失，即Leri-Weill Dyschondrosteosis(LWD)綜合征和17p12(14113056-15491109)x1，導(dǎo)致的遺傳性壓迫易感性神經(jīng)病(HNPP)。另有非完全性葡萄胎1例。詳見表1。

表1 自然流產(chǎn)組織CAM檢測結(jié)果

2.2 不同流產(chǎn)孕齡組流產(chǎn)組織染色體異常率

早期流產(chǎn)組人數(shù)49例，占比69.01%。其中CMA結(jié)果正常21例，結(jié)果異常28例，異常率57.14%；晚期流產(chǎn)組人數(shù)22例，其中結(jié)果正常19例，結(jié)果異常3例，異常率13.64%。早期流產(chǎn)組異常率顯著高于晚期流產(chǎn)組(χ2=11.68，P=0.001)。此外，早期流產(chǎn)組中，染色體數(shù)目異常24例，占本組異常的85.71%。

2.3 不同流產(chǎn)史組流產(chǎn)組織染色體異常率

有流產(chǎn)史組人數(shù)49例，其中結(jié)果正常22例，結(jié)果異常27例，異常率55.10%；無流產(chǎn)史組人數(shù)22例，其中結(jié)果正常16例，異常結(jié)果6例，異常率27.27%。有流產(chǎn)史組異常率顯著高于無流產(chǎn)史組(χ2=4.73，P=0.03)。

2.4 不同ART受孕組流產(chǎn)組織染色體異常率

ART組人數(shù)14例，其中CMA結(jié)果正常8例，結(jié)果異常6例，異常率42.86%；非ART組人數(shù)57例，其中結(jié)果正常32例，結(jié)果異常25例，異常率45.45%。ART組異常率與非ART組異常率無明顯差異(χ2=0.005，P=0.946)。

3 討論

自然流產(chǎn)的發(fā)病機制非常復(fù)雜，其中染色體異常被認(rèn)為是自然流產(chǎn)的主要原因。流產(chǎn)給孕婦的身體及精神帶來極大負(fù)擔(dān)，特別是多次自然流產(chǎn)的孕婦，其與其家屬對于流產(chǎn)原因的診斷有迫切需求。CMA分為微陣列比較基因組雜交(Array Comparative Genomic Hybridization，array CGH)和單核苷酸多態(tài)性微陣列(Single Nucleotide Polymorphism Array，SNP Array)，能夠在全基因組范圍內(nèi)同時檢測染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常，具有分辨率高、不需要細(xì)胞培養(yǎng)，可以鑒定雜合子缺失(Loss of Heterozygosity，LOH)和單親二倍體(Uniparental Disomy，UPD)，可以檢測≥30%水平嵌合體等優(yōu)勢[9]，為自然流產(chǎn)的病因診斷帶來了更多的可能性。

本研究結(jié)果顯示，自然流產(chǎn)組織的異常率為43.66%，這與楚艷等[10]的研究結(jié)果(46.6%)基本一致。其結(jié)果證實了染色體異常確實是自然流產(chǎn)的主要原因，另一方面也體現(xiàn)了CMA技術(shù)在流產(chǎn)原因診斷方面獨特的優(yōu)勢。對檢測結(jié)果進(jìn)一步分析顯示，在染色體異常的流產(chǎn)組織中，以三體異常為主，其中以13、16、22號染色體最多，這可能是因為18、21號染色體三體異常經(jīng)由無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)篩查出陽性后，直接行羊水核型分析確診后引產(chǎn)，并未檢查流產(chǎn)組織所致。此外，性染色體單體也較多?？梢?，自然流產(chǎn)的染色體異常中，主要是以某一條染色體的三倍體或單倍體為主。而結(jié)構(gòu)異常也有檢出，本研究中檢出兩例結(jié)構(gòu)異常：LWD綜合征中文名稱為Leri-Weill軟骨骨生成障礙綜合征，是由偽常染色體基因SHOX或SHOXY雜合缺失或SHOX下游調(diào)節(jié)區(qū)域的缺失引起的，主要表現(xiàn)是骨骼發(fā)育不良[10]。17p12(14113056—15491109)x1引起的HNPP，主要表現(xiàn)為腓神經(jīng)病變以及一些非典型表現(xiàn)如弓形足、脊柱側(cè)彎、耳聾等[11]?？梢姡珻MA技術(shù)不僅可以滿足流產(chǎn)組織中各種染色體非整倍體異常的檢測，還可以檢測出其它技術(shù)難以檢出的染色體微重復(fù)及微缺失綜合征，這為一部分過去無法通過常規(guī)技術(shù)尋找到流產(chǎn)原因的患者提供了新的可靠檢測手段。

有研究表明，80%以上的流產(chǎn)發(fā)生在妊娠12周以內(nèi)，即早期流產(chǎn)，隨后流產(chǎn)率迅速下降，而染色體數(shù)目異常是導(dǎo)致胚胎早期流產(chǎn)的最主要原因，約占50%[12]。本研究中，早期流產(chǎn)占比69.01%，早期流產(chǎn)組的異常率57.14%，這其中主要是染色體數(shù)目異常，占本組異常的85.71%，這與此前的研究基本一致，說明CMA技術(shù)可以滿足至少一半的早期流產(chǎn)原因的診斷。本研究中早期流產(chǎn)組還檢出4例其它異常，分別為2例染色體結(jié)構(gòu)異常，1例整三倍體，1例非完全性葡萄胎。其中，非完全性葡萄胎的檢測主要是來自CMA技術(shù)檢測UPD的技術(shù)優(yōu)勢?？梢?，CMA技術(shù)在早期流產(chǎn)的原因分析中獨具優(yōu)勢，不僅可以檢出常規(guī)的染色體數(shù)目異常，還可以彌補傳統(tǒng)核型分析技術(shù)等無法檢測的一些小片段異常及單親二倍體等。

據(jù)統(tǒng)計資料表明，有習(xí)慣性流產(chǎn)史的孕婦體內(nèi)染色體異常的幾率比一般人高出幾倍，最常見的異常為非整倍體，其次為多倍體[13]。本研究結(jié)果表明，有流產(chǎn)史組的檢測結(jié)果異常率為55.10%，顯著高于無流產(chǎn)史組異常率(27.27%)。對于有流產(chǎn)史的孕婦更應(yīng)該警惕胎兒染色體核型異常，流產(chǎn)組織的核型分析具有更高的價值。同時，夫妻雙方自身攜帶的染色體異常是導(dǎo)致不良孕產(chǎn)史的重要遺傳學(xué)因素[14]，流產(chǎn)組織的核型異常，特別是隨體染色體(13、14、15、21、22號染色體)的異常結(jié)果常常可以反過來提示夫妻雙方核型異常的可能性，這可為遺傳咨詢及指導(dǎo)再次妊娠提供依據(jù)。

ART指采用醫(yī)療輔助手段使不育夫婦妊娠的技術(shù)，包括人工授精(Artificial Insemination，AI)和體外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization and Embryo Transfer，IVF-ET)及其衍生技術(shù)兩大類[15]。針對ART是否會提高胚胎染色體異常的發(fā)生概率，多項研究對比分析了ART和自然受孕胎停育絨毛的染色體異常發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)兩組的異常率差異無統(tǒng)計學(xué)意義[15,16]，這與本研究結(jié)果一致，即ART技術(shù)并未增加胚胎染色體異常的發(fā)生率，但這并不意味著ART技術(shù)對胚胎染色體異常無影響。在此基礎(chǔ)上，有研究進(jìn)一步探討了ART受孕和自然受孕的自然流產(chǎn)中異常類型的差異，發(fā)現(xiàn)經(jīng)ART早孕期自然流產(chǎn)與自然妊娠相比，雖然有相似的胚胎染色體異常率，但有不同的異常類型，染色體數(shù)量異常是ART受精后自然流產(chǎn)胚胎的主要異常核型[17]，但也有研究表明，ART妊娠后的高流產(chǎn)率與流產(chǎn)胚胎的染色體異常密切相關(guān),但是其染色體異常的發(fā)生率和異常類型與自然妊娠后流產(chǎn)時無明顯差異[18]。可見，目前大多研究都支持ART技術(shù)對于胚胎染色體異常的發(fā)生率無明顯影響，但其對于染色體異常類型是否具有影響尚無定論，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，染色體異常是自然流產(chǎn)的主要原因，其異常率與孕婦流產(chǎn)時孕周、是否有流產(chǎn)史等因素有關(guān)，與是否為ART受孕無關(guān)。臨床在針對早期流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦進(jìn)行流產(chǎn)原因的分析及遺傳咨詢時，應(yīng)首先考慮到胚胎染色體異常。利用CMA技術(shù)分析流產(chǎn)原因具有成功率高、分辨率高、耗時短等優(yōu)點，能夠更全面地分析各類染色體異常，但其不能檢測平衡易位、倒位缺點，在一定程度上限制了其應(yīng)用。因此應(yīng)該將CAM與其它核型分析技術(shù)相結(jié)合，提高流產(chǎn)原因的診出率。