三黃生膚油聯(lián)合硫化氫對糖尿病足模型大鼠的治療作用

孫曉順 陳 露 敖先偉 張艷芳 朱賢靜

末梢微循環(huán)障礙是糖尿病的嚴重并發(fā)癥，糖尿病足(Diabetic Foot，DF)是因為高糖狀態(tài)下末梢血供減少，再加上長期糖代謝紊亂使血液呈高凝狀態(tài)，導致微血栓形成而堵塞血管，引起足潰瘍。原發(fā)性病變使?jié)兠嫱y以愈合，增加了局部感染的機會，進一步破壞深部組織，嚴重者可導致患者截肢。DF屬于糖尿病難治性并發(fā)癥，一直是臨床學者期望攻克的難點[1]。硫化氫可以抗炎、抗氧化、調(diào)控血管生成、促進組織損傷修復，已有學者將其用于DF模型鼠的治療[2]。DF中醫(yī)治療以活血通絡、益氣化瘀、解毒生肌為主[3]。三黃生膚油具有益氣活血、祛瘀生肌的功效，在DF的實驗研究中已獲得了較好的療效[4]。本研究觀察硫化氫聯(lián)合三黃生膚油對DF模型鼠的治療作用，為DF臨床治療方法的探索積累相關的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只6-8周健康雄性SD大鼠購自湖北省動物實驗中心，動物許可號：SCXK(鄂)2016-0004， 體重210-230g，大鼠20-26℃條件下自由進食、飲水飼養(yǎng)，12h光照，12h黑暗，適應環(huán)境1 周后用于實驗。

1.2 藥劑和儀器

硫化氫、鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司(生產(chǎn)批號：20160122、2016314)。三黃生膚油為我院中醫(yī)室自制(由黃芪、黃連、黃芩、白芷、金銀花、當歸、川芎、紫草、地榆、紅花、蟲白蠟、血竭、赤芍、冰片、蟬蛻15 種中藥浸潤于麻油中熬制而成)。紅外溫度儀M312型購自上海御領科技有限公司，足底痛閾測試儀JS11P購自意大利Ugo Basile公司。

1.3 DF大鼠模型的構建

60只健康雄性SD大鼠高糖、高脂飼料(20%蔗糖、18% 豬油、3%蛋黃和59%基礎飼料)喂養(yǎng)4周后，禁食12h， 65mg/kg鏈脲佐菌素腹腔注射(0.9%生理鹽水溶解)，3天后測血糖，血糖大于16.7 mmol/L者選為糖尿病模型大鼠，其中48只造模成功。參照馬帥等[3]的方法，使用切除皮膚法制造DF損傷：30mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉糖尿病模型大鼠，0.5%碘伏消毒左后足，作3mm×7mm 矩形全層皮膚切除，術后壓迫止血，75%酒精消毒，制備DF潰瘍大鼠模型。

1.4 動物分組及治療方法

48只造模成功的DF大鼠使用數(shù)字表法分為基質(zhì)對照組、硫化氫組、三黃生膚油組和三黃生膚油+硫化氫組，每組12只?；|(zhì)對照組使用基質(zhì)麻油涂抹創(chuàng)面后，無菌敷料覆蓋患處并包扎，2次/天，連續(xù)3周；硫化氫組使用2%硫化氫0.1ml/cm2涂抹創(chuàng)面后無菌敷料覆蓋患處并包扎，2次/天，連續(xù)3周；三黃生膚油組使用三黃生膚油0.15ml/cm2涂抹創(chuàng)面后無菌敷料覆蓋患處并包扎，2次/天，連續(xù)3周；三黃生膚油+硫化氫組先使用2%硫化氫(0.1ml/cm2)涂抹創(chuàng)面后，再涂抹三黃生膚油0.15ml/cm2，隨后無菌敷料覆蓋患處并包扎，2次/天，連續(xù)3周。

1.5 觀察指標

1.5.1 愈合率：于治療后第1、2、3周時測定創(chuàng)面面積，用透明薄膜描記潰瘍面積邊緣后，掃描后輸入電腦使用ImageJ軟件計算創(chuàng)面面積，計算愈合率=(原有創(chuàng)面面積-治療后測量創(chuàng)面面積)/原有創(chuàng)面面積×100%。

1.5.2 足底皮溫：于治療前、治療后第1、2、3周時使用紅外溫度儀檢測大鼠足底皮溫。

1.5.3 足底痛閾：于冶療前，治療1、2、3周后在安靜條件下使用足底痛閾測試儀，輻射熱光照限值60s，記錄模型鼠抬腿時間。

1.5.4 創(chuàng)面血管生成情況：第3周治療結束后斷頸處死模型鼠，取創(chuàng)面肉芽組織于10% 中性甲醛溶液固定后，送病理科制作組織切片，HE染色，顯微鏡下記錄每個視野中血管的數(shù)目，選取5個視野計算平均值。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較

治療1、2、3周后，四組大鼠創(chuàng)面愈合率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療1周后，與基質(zhì)對照組比較，三黃生膚油+硫化氫組創(chuàng)面愈合率增加(t=2.916，P<0.05)，其余組間創(chuàng)面愈合率差異無統(tǒng)計學意義(t均<1.000，P>0.05)。治療2、3周后，與基質(zhì)對照組比較，其它組大鼠創(chuàng)面愈合率均增加(t均>2.873，P<0.05或P<0.01)，三黃生膚油+硫化氫組較硫化氫組和三黃生膚油組創(chuàng)面愈合率均增加(t均>2.053，P<0.05)，硫化氫組與三黃生膚油組創(chuàng)面愈合率差異無統(tǒng)計學意義(t均<1.000，P>0.05)。同組內(nèi)創(chuàng)面愈合率治療1、2、3周后差異均有統(tǒng)計學意義，且均呈治療1周<治療2周<治療3周，差異均有統(tǒng)計學意義(t均>4.512，P<0.01)。見表1。

表1 四組大鼠創(chuàng)面愈合率比較均=12)

注：與基質(zhì)對照組比較,1)P<0.05；2)P<0.01；與硫化氫組比較,3)P<0.05；與三黃生膚油組比較,4)P<0.05;與同組治療1周比較，5)P<0.01;與同組治療2周比較，6)P<0.01

2.2 各組大鼠足底皮溫比較

治療前以及治療1周后四組大鼠足底皮溫無顯著性差異(P>0.05)。三黃生膚油+硫化氫組治療2、3周足底皮溫高于基質(zhì)對照組(t=2.614、3.115，P<0.05)。治療3周后硫化氫組和三黃生膚油組足底皮溫高于基質(zhì)對照組(t=2.603、2.618，P< 0.05)，硫化氫組與三黃生膚油組間無顯著性差異(P>0.05)，三黃生膚油+硫化氫組足底皮溫高于硫化氫組和三黃生膚油組(t=2.817、2.823，P< 0.05)。除基質(zhì)對照組處，其余各組治療3周后足底皮溫較同組治療前明顯升高(P<0.05),差異均有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 四組大鼠足底皮溫的比較(℃，均=12)

注：與基質(zhì)對照組比較,1)P<0.05；與硫化氫組比較,2)P<0.05；與三黃生膚油組比較,3)P<0.05;與同組治療前比較，4)P<0.05

2.3 各組大鼠足底痛閾比較

從表3可見，治療前及治療1周后，四組足底痛閾無顯著性差異(P>0.05)。三黃生膚油+硫化氫組治療2、3周足底痛閾低于基質(zhì)對照組(t=2.864、3.122，P<0.05)。治療3周后，硫化氫組和三黃生膚油組足底痛閾低于基質(zhì)對照組(t=2.933、2.924，P<0.05)，硫化氫組與三黃生膚油組間無顯著性差異(t=0.714，P>0.05)。三黃生膚油+硫化氫組足底痛閾低于硫化氫組和三黃生膚油組(t=2.712、2.728，P<0.05)。除基質(zhì)對照組外，其余各組治療3周后足底聞閾較同組治療前降低，差異均有統(tǒng)計學意義(t均>2.735，P<0.05)。

表3 四組大鼠足底痛閾的比較均=12)

注：與基質(zhì)對照組比較，1)P<0.05；與硫化氫組比較，2)P<0.05；與三黃生膚油組比較，3)P<0.05；與同組治療前比較，4)P<0.05

2.4 各組大鼠創(chuàng)面血管生成比較

治療3周后，顯微鏡高倍視野下計數(shù)得到基質(zhì)對照組、硫化氫組、三黃生膚油組和三黃生膚油+硫化氫組模型鼠創(chuàng)面肉芽組織中新生血管數(shù)分別為12.64±1.43個、13.78±1.62個、13.86±1.67個和16.62±2.41個，組間有顯著性差異有統(tǒng)計學意義(F=2.842，P<0.05)，見圖1。硫化氫組、三黃生膚油組和三黃生膚油+硫化氫組均較基質(zhì)對照組比較均增加(t=2.742、2.756、3.426，P<0.05)，硫化氫組和三黃生膚油組新生血管數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(t=0.217，P>0.05)，三黃生膚油+硫化氫組新生血管數(shù)均高于硫化氫組和三黃生膚油組(t=3.215、3.204，P<0.05)。

圖1 四組創(chuàng)面肉芽組織病理圖片(HE,×200 )

3 討論

實驗性DF大鼠模型制作有很多方法，例如單純高脂飲食誘導法、鏈脲佐菌素誘導法、高脂灌胃與四氧嘧啶誘導結合法，再結合切除皮膚法、溫控損傷法、局部皮膚壓迫法、局部感染法、結扎血管法、結扎神經(jīng)法等[5]。本研究選用了鏈脲佐菌素誘導+切除皮膚法，藥物破壞胰島 B 細胞，造成胰島素缺乏，符合糖尿病胰島細胞損傷的特點，剪去造模區(qū)皮膚操作簡單，重復性好，潰瘍面積形態(tài)可控，便于相互之間的比較，基本滿足DF的實驗研究[6]。足潰瘍在糖尿病患者中的發(fā)生率為 15%-25%，末梢血管及神經(jīng)病變是其主要成因，改善末梢血管的局部微循環(huán)，增加創(chuàng)面血管生成，有利于潰瘍面的愈合[7]。

三黃生膚油中黃芪、黃連、黃芩可以清熱解毒，化腐生肌，當歸、川芎活血通絡、溫陽養(yǎng)血，蟬蛻、地榆、紅花、蟲白蠟、血竭活血通脈、養(yǎng)陰益氣，白芷、金銀花、紫草、赤芍、冰片解毒消腫、生肌止痛，合用后促進新生血管、肉芽組織和上皮細胞形成，改善微循環(huán)，促進創(chuàng)面愈合[2]。而硫化氫具有抗炎作用，有研究顯示硫化氫可減少燒傷大鼠創(chuàng)面白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ)等炎性介質(zhì)水平[8]，同時還可減少新生肉芽組織中性粒細胞及單核巨噬細胞浸潤程度，對創(chuàng)面愈合具有調(diào)控作用[9]。

本文結果顯示，硫化氫組和三黃生膚油組治療2、3周創(chuàng)面愈合率高于基質(zhì)對照組，但兩組間創(chuàng)面愈合率無顯著性差異，表明硫化氫和三黃生膚油都有利于足底皮損的修復，且二者的促增長作用無差異。三黃生膚油+硫化氫組治療1、2、3周創(chuàng)面愈合率均高于基質(zhì)對照組，治療2、3周創(chuàng)面愈合率高于硫化氫組和三黃生膚油組，即聯(lián)合治療比三黃生膚油或硫化氫單藥治療更加有利于模型鼠足創(chuàng)面的愈合，這可能是兩藥促修復的機制不同，合用后增加各自的療效[2，7]。

三黃生膚油組治療3周后，模型鼠足底皮溫和足底痛閾也得到了顯著改善。三黃生膚油+硫化氫治療2、3周后，模型鼠足底皮溫高于和足底痛閾顯著低于基質(zhì)對照組，治療3周后足底皮溫高于和足底痛閾顯著低于硫化氫組或三黃生膚油組，說明了聯(lián)合治療比三黃生膚油或硫化氫組單藥治療更加有利于模型鼠足底皮溫和痛閾的改善，足底皮溫和痛閾可以反應足底末梢循環(huán)障礙的情況[10,11]，可能是聯(lián)合用藥增加了模型鼠的末梢循環(huán)，產(chǎn)生了比單藥使用更高的療效。顯微鏡高倍視野下三黃生膚油組+硫化氫組創(chuàng)面肉芽組織中新生血管數(shù)顯著高于其它三組，說明了聯(lián)合用藥后發(fā)生了促血管生成的增效作用，創(chuàng)面愈合率分析也顯示了聯(lián)合用藥組顯著高于其它3組，說明了聯(lián)合用藥有利于創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，本研究表明三黃生膚油聯(lián)合硫化氫鈉可改善DF模型鼠足部微循環(huán)，增加創(chuàng)面血管生成，有利于創(chuàng)面的愈合，為DF的臨床治療提供了一種可供探討的新的治療方法。