果膠低聚糖制備及其體外增殖青春雙歧桿菌的研究

巫曉燕，蔡為榮

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

低聚糖(Oligosaccharide)主要存在于多種植物中，人體攝入后很難被吸收[1-2],有甜味，可在食品加工中作為添加劑使用，制作的食品熱量低，更健康[3-5]．功能性低聚糖主要有低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖等[6]，目前對果膠低聚糖(POS)的研究不多．果膠低聚糖廣泛存在于植物的果皮中，是容易獲得的功能性低聚糖，它們通常由酶解法、化學(xué)合成法、物理法等制備[7-9]．孫麗娜[10]等篩選出最佳的果膠酶，并且以該果膠酶酶解果膠制備了聚合度1～2的低聚糖混合物，眾多學(xué)者利用化學(xué)法進(jìn)行了研究，此法可以獲得聚合度單一的寡聚半乳糖醛酸[11-12]．研究采用酶解法制備果膠低聚糖,可以獲得低聚合度的果膠低聚糖．目前分離純化果膠低聚糖的方法包括分級醇沉法、微生物發(fā)酵法、色譜柱分離法、超濾膜分離法等[13]．研究選用超濾裝置，分離效率更高、能耗比較低、易于操作，在未來糖類物質(zhì)分離純化的研究上應(yīng)用更加廣泛．

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是人體腸道中最重要的有益細(xì)菌，主要存在于人體的大腸，對人體有多種保健功能[14-15]．普通人腸道中常見的雙歧桿菌有兩歧雙歧桿菌(B.amphibius)、青春雙歧桿菌(B.adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)、長雙歧桿菌(B.longum)和短雙歧桿菌(B.breve)[16]．

青春雙岐桿菌(B.adolescentis)具有很強的耐酸、耐氧性，對人體胃酸和膽堿有較強的適應(yīng)力．采用微囊化技術(shù)，可大大降低胃酸、膽堿對有益菌的傷害，順利到達(dá)胃腸道，對低聚糖的微膠囊化制備具有實際的研究意義．選擇青春雙歧桿菌作為唯一菌種，對雙歧桿菌的益生作用進(jìn)行代表性研究．目前發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的有益作用包括以下幾個方面：治療慢性腹瀉與抗生素相關(guān)性腹瀉；有效緩解便秘；抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展；保護肝臟；促進(jìn)人體對乳糖的消化；營養(yǎng)作用[17-20]．

柑橘皮是生產(chǎn)果膠低聚糖的有效來源，利用果膠酶將柑橘果膠分解，通過超濾膜過濾后得到不同分子量范圍果膠低聚糖．由柑橘皮制備的雙歧因子果膠低聚糖在腸道中具備消化性，是生產(chǎn)第二代雙歧因子的極佳選擇[21]．

采用超濾膜分離成為3種不同組分的果膠低聚糖，分子截留量分別為3 KDa、5 KDa、10 KDa．在體外厭氧條件下，研究了低聚糖對青春雙歧桿菌增殖的影響，并對其基本發(fā)酵性質(zhì)進(jìn)行了研究．

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

果膠低聚糖：由柑橘果膠通過酶法實驗室制備．果膠裂解酶(酶活≥600 U/mL)(夏盛食品有限公司)．菌種：青春雙歧桿菌(B.adolescentis)(江南大學(xué)微生物實驗室提供)．試劑：DNS試劑[22]；溶菌酶(美國BBI公司)；乙醇；濃硫酸；氫氧化鈉．

1.2 實驗儀器

臺式高速離心機(四川蜀科儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(上海元析儀器)； W-CJ-2F型超凈工作臺(北京佳源興業(yè)有限公司)；超濾設(shè)備(MiLipore公司)；SYQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱(上海佰好儀器有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械有限公司)；筆試酸度計(深圳市宇輝科技有限公司)．

2 實驗方法

2.1 酶法制備果膠低聚糖

參照李拖平[23]等實驗稍作修改，果膠可被果膠酶分解成多個低聚半乳糖醛酸，在強酸條件下被分解為半乳糖醛酸單糖．

①向配制好的果膠溶液中加入果膠內(nèi)切酶；②反應(yīng)一段時間后，可得到多糖、低聚糖和單糖的混合液；③將上述溶液中加入80%乙醇，沉析、過夜后置于離心機中離心15 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min；④完成后，上清液為單糖、低聚糖的混合液，沉淀為多糖混合物[24]．

2.2 計算果膠低聚糖得率

吸取1.0 mL含有單糖和果膠低聚糖的清液，加入1.0 mL質(zhì)量濃度為1.5 mol/L的硫酸，沸水浴90 min，再加1.0 mL質(zhì)量濃度為3.0 mol/L氫氧化鈉溶液中和，加入3.0 mL DNS試劑，把同體積1.0 mL未酸解清液稀釋3倍，作為空白對照．依照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定進(jìn)行后續(xù)實驗，于630 nm處測OD值，得半乳糖醛酸含量，計算低聚糖得率．

式中,a為OD對應(yīng)還原糖(μg/mL)；b為稀釋倍數(shù)；V1為乙醇提取的溶液總體積(mL)；c為底物的摩爾濃度(μmoL/mL)；V2為酶促反應(yīng)液底物體積(mL)；M為半乳糖醛酸相對摩爾質(zhì)量(μg/umol)．

2.3 果膠低聚糖的超濾分級

將分子截留量為10 KDa的膜組件組裝好，超濾條件為：壓力0.020 Mpa，果膠低聚糖溶液溫度35 ℃，果膠質(zhì)量濃度1 g/L；將果膠低聚糖溶液通過超濾膜，分子量小于10 KDa的果膠低聚糖在壓力作用下透過超濾膜流出．保留液返回，分子量小于10 kDa的果膠低聚糖溶液循環(huán)穩(wěn)定后方可得到；再將分子量小于10 KDa的低聚糖溶液依次通過分子量為5 KDa和3 KDa的超濾膜，操作步驟同上，得到POS1(分子量<3 KDa)，POS2(分子量3～5 KDa)，POS3(分子量5～10 KDa)的低聚糖溶液，冷凍干燥，備用．

2.4 厭氧培養(yǎng)青春雙歧桿菌

(1)配制培養(yǎng)基.活化培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g，牛肉膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，吐溫-80 1.0 mL，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，葡萄糖10 g，pH 6.5±0.1；增殖培養(yǎng)基：以果膠、果膠低聚糖替換種子培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分同種子培養(yǎng)基．

(2)青春雙歧桿菌的活化、增殖.活化培養(yǎng)：取-80 ℃保存的青春雙歧桿菌凍干菌，接種至活化培養(yǎng)基中，放置于厭氧培養(yǎng)箱中(90% N2，5% CO2，5% H2)，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h．挑取菌落于0.85%的無菌生理鹽水中，經(jīng)過梯度稀釋配成菌懸液(濃度為1×106～1×108CFU/mL)，4 ℃冰箱中保存．增殖培養(yǎng):取9 mL增殖培養(yǎng)基置于具塞螺紋試管，121 ℃條件下滅菌25 min，趁熱旋緊螺蓋并轉(zhuǎn)入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，于 37 ℃條件下，接入2%青春雙歧桿菌，在37±1 ℃條件下嚴(yán)格厭氧靜置培養(yǎng)．

2.5 發(fā)酵性質(zhì)的研究

通過無菌手套在厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行如下實驗操作．

(1)發(fā)酵液pH的測定.分別在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h、48 h時間點吸取發(fā)酵液樣品，用筆試酸度計在室溫下自動測定，每個樣品平行測3次，取平均值，繪制pH曲線．

(2)繪制青春雙歧桿菌生長曲線.將活化選育的青春雙歧桿菌接種到MRS液體增殖培養(yǎng)基中，分別在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h、48 h時間點吸取發(fā)酵液樣品，于600 nm下測吸光度，以葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對照，繪制果膠低聚糖對青春雙歧桿菌生長曲線．

(3)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線.取6支試管編號，依次加入1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，蒸餾水和DNS試劑．搖勻，沸水浴15 min．放置冷卻至室溫，加入適量蒸餾水稀釋到25 mL，混勻．0管在540 nm處做空白對照，分光光度計測1～5管OD值．

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

(4)青春雙歧桿菌基質(zhì)消耗曲線的測定.青春雙歧桿菌發(fā)酵液分別在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h以及48 h收集．測定不同時間點的發(fā)酵液中的含糖量，繪制曲線．(方法同2.5(3))．

(5)果膠低聚糖增殖青春雙歧桿菌.基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別以果膠、果膠低聚糖作為唯一碳源，接種活化后的青春雙歧桿菌到厭氧培養(yǎng)箱在37 ℃培養(yǎng)(2%接種量)，以無糖培養(yǎng)基作為陰性對照．分別測定0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h、48 h的吸光度值，繪制生長曲線．Degawa Y[25]等利用PI值作為益生菌益生作用的評價指標(biāo)，為進(jìn)一步比較果膠組分對青春雙歧桿菌增殖的影響，采用48 h發(fā)酵液吸光度法(波長600 nm)計算益生指標(biāo)PI，計算PI高于0.5表示增殖作用明顯．

式中，AP0、AP48為添加果膠、果膠低聚糖發(fā)酵青春雙歧桿菌0 h和48 h的吸光度；AG0、AG48為添加葡萄糖發(fā)酵青春雙歧桿菌0 h和48 h的吸光度；AC0、AC48為無糖培養(yǎng)基0 h和48 h的吸光度．

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)青春雙歧桿菌發(fā)酵液pH和生長曲線圖

青春雙歧桿菌pH及其生長曲線如圖1所示.由圖1可知，0～6 h,處于適應(yīng)期，pH下降，生長緩慢；6～24 h,處于對數(shù)期,生長迅速；24～48 h，生長趨于平緩，pH逐漸穩(wěn)定．研究選擇48 h作為青春雙歧桿菌發(fā)酵的終點．從pH曲線可以看出，發(fā)酵液的pH持續(xù)降低，說明發(fā)酵過程產(chǎn)生了某些酸性代謝物，可降低腸道pH，抑制腸道腐敗菌生長，有益于宿主的健康．

圖1 青春雙歧桿菌pH及其生長曲線

3.2 青春雙歧桿菌還原糖消耗曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，回歸方程為y=0.680 5x-0.034，R2=0.999 5，說明以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品在測量范圍內(nèi)滿足測定的要求，可用于計算還原糖含量．用紫外可見分光光度計測定以果膠低聚糖為唯一碳源的青春雙歧桿菌培養(yǎng)基在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h和48 h的吸光度值，根據(jù)上述回歸方程可計算不同時間點培養(yǎng)基中的還原糖含量，繪制青春雙歧桿菌基質(zhì)消耗曲線如圖3所示．由圖3可知，青春雙歧桿菌在適應(yīng)期，還原糖消耗較慢，處于對數(shù)期，還原糖消耗明顯增多，在24 h之后還原糖消耗速率逐漸加快，最終的殘?zhí)呛繛?.453 mg/mL．

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖3 青春雙歧桿菌基質(zhì)消耗曲線

3.3 果膠及果膠低聚糖對青春雙歧桿菌的增殖影響

果膠及果膠低聚糖對青春雙歧桿菌的增殖影響如圖4所示.由圖4可以看出，果膠、果膠低聚糖對青春雙歧桿菌均具備較好的增殖作用，但相對而言，果膠低聚糖的增殖效果更好，且分子量越小，增殖效果越好．總體來看，在4～12 h，青春雙歧桿菌快速生長，在24 h之后，青春雙歧桿菌的生長趨于平緩．

3.4 青春雙歧桿菌發(fā)酵48 h的PI值

青春雙歧桿菌發(fā)酵48 h的PI值如圖5所示.由圖5可以看出，添加果膠低聚糖的青春雙歧桿菌發(fā)酵液的PI值達(dá)到0.5以上，而以果膠作為碳源的青春雙歧桿菌發(fā)酵液的PI值不超過0.3．由此可以看出，果膠水解后的益生作用變好(PI值增高)，且分子量越小，越有利于促進(jìn)青春雙歧桿菌的增殖．

圖4 果膠及果膠低聚糖對青春雙歧桿菌的增殖影響 圖5 青春雙歧桿菌發(fā)酵48 h的PI值

4 結(jié)論

根據(jù)實驗結(jié)果得出，在體外模擬實驗中，果膠低聚糖能有效促進(jìn)青春雙歧桿菌的增殖，且低分子量的增殖效果更好．在厭氧培養(yǎng)發(fā)酵過程中產(chǎn)生了酸性代謝產(chǎn)物，可以降低腸道pH值，同時抑制腸道腐敗菌的生長，有利于宿主的健康．但體外實驗難以很好地模擬復(fù)雜的人體腸道環(huán)境，只能對實驗結(jié)果進(jìn)行初步測試．要想得出準(zhǔn)確、完善的實驗結(jié)論，就要認(rèn)真進(jìn)行下一步的體內(nèi)實驗．