匍枝根霉纖維素酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及發(fā)酵優(yōu)化

鄭賢金，湯 斌

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

纖維素酶作為一種重要的工業(yè)酶制劑，具有環(huán)保、高效地將纖維素轉(zhuǎn)化成人類需要的能源和其他工業(yè)原料的功能，因而被廣泛應用于畜牧、紡織、造紙、食品工業(yè)等諸多領域，如作為動物飼料添加劑、增加棉織物的光潔度和柔軟度等[1-2]．然而，纖維素酶酶活性低、生產(chǎn)成本高是制約其應用的關鍵因素．為降低纖維素酶生產(chǎn)成本，國內(nèi)外學者展開了大量的研究工作，這些研究包括從自然界中篩選高產(chǎn)菌株、在實驗室中對保藏的微生物菌株進行遺傳改良和對纖維素酶基因進行分子改造等．孫尚琛[3]等從牛糞、枯枝、麥垛腐殖質(zhì)中篩選、分離得到一株短小芽胞菌，其FPA酶活最高為1 204 U/mL(等同于6.7 IU/mL)；Zhang X Y[4]等對里氏木霉Rut-30進行甲基磺酸乙酯誘變，獲得突變株D-7，酶活為4.53 IU/mL，比Rut-30提高了57.55%；張飛[5]等利用人工鋅指蛋白文庫轉(zhuǎn)化里氏木霉Rut-30，篩選高產(chǎn)纖維素酶的突變株，最終FPA酶活達到4.58 IU/mL．這些手段不同程度提高了纖維素酶的酶活，但距離大規(guī)模生產(chǎn)應用仍有差距．

研究所使用出發(fā)菌株匍枝根霉TP-02，由安徽工程大學3R實驗室從國家5A級旅游景區(qū)黃山采集分離得到．TP-02具有酶活高、發(fā)酵時間短等特性[6]，因而可能對進一步提高纖維素酶產(chǎn)量具有重要的工業(yè)應用潛力．研究通過對TP-02誘變處理得到一株高產(chǎn)纖維素酶菌株TZ-03，并對其培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，確定最優(yōu)培養(yǎng)基，在此基礎上進行10L發(fā)酵罐放大實驗及發(fā)酵條件控制，最終提高了纖維素酶產(chǎn)量．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(1)菌株.匍枝根霉TP-02，為安徽工程大學3R實驗室篩選及保藏．

(2)主要試劑.甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone，EMS)，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；微晶纖維素，購于河南華悅化工產(chǎn)品有限公司；其余試劑均采購于國藥集團化學試劑有限公司．

(3)培養(yǎng)基.篩選培養(yǎng)基：CMC 15 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO41 g/L，121 ℃滅菌20 min．種子培養(yǎng)基：10%麩皮浸出汁(100 g新鮮麩皮加入1 000 mL蒸餾水，煮沸30 min，六層紗布過濾并最終定容至1 000 mL)，121 ℃滅菌20 min．發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草粉(80目)20 g/L，豆粕粉10 g/L，5%麩皮浸出汁，CaCl22 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，KH2PO43 g/L，PEG-4000 0.25 g/L，Tween 80 200 μL/L，微量元素溶液1 mL/L，121 ℃滅菌20 min．微量元素溶液：FeSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·H2O 0.001 6 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L，CoCl2·2H2O 0.002 g/L．

1.2 儀器與設備

L3 723分光光度計、SW-CI-10 單面垂直凈化操作臺、BOXUN立式壓力蒸汽滅菌鍋、SHA-CA數(shù)顯恒溫振蕩器、新亞特正品ZWS 90W紫外燈管、BIOTECH-10JSA-3000PLC自動發(fā)酵罐.

1.3 實驗方法

(1)菌株誘變及篩選.將匍枝根霉TP-02接種至PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待其長成后用無菌生理鹽水從斜面上將孢子洗下并通過計數(shù)控制質(zhì)量分數(shù)在107～108個/mL，制備孢子懸浮液．取10 mL孢子懸液于9 cm無菌培養(yǎng)皿中，將其置于90 W紫外燈下30 cm處，打開平皿蓋，分別照射1～7 min，間隔1 min，進行紫外誘變[7]；取2 mL EMS原液加4 mL pH 7.2的磷酸緩沖液配成EMS母液，處理時間30～180 s，間隔30 s，進行EMS誘變，反應結(jié)束后立即加入10% NaS2O3溶液終止反應[8]．將處理液梯度稀釋適當倍數(shù)后涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基，待其長成后，以菌落周圍透明圈的大小為主要指標，挑取透明圈大、菌落小的菌落轉(zhuǎn)接到PDA斜面上．將初篩得到的菌株接種于種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后按10%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中．30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)5 d，測定濾紙酶活，以濾紙酶活為指標進行復篩．以上述誘變后得到的高產(chǎn)菌為出發(fā)菌株進行紫外-EMS復合誘變，其條件為單因子誘變最優(yōu)條件[8]．

(2)發(fā)酵條件優(yōu)化.

①碳氮源優(yōu)化.分別以質(zhì)量分數(shù)為2%的蔗糖、葡萄糖、纖維二糖、木糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精、麩皮粉、稻草粉、微晶纖維素、CMC、殼聚糖為碳源，加入到含有豆粕粉1%、麩皮浸出汁2.5%、CaCl20.2%、MgSO4·7H2O 0.4%、KH2PO40.3%、微量元素液0.002%、Tween 80 200 μL/L、PEG-4000 0.025%的250 mL錐形瓶中，裝液量為80 mL．滅菌后按10%接種量接入匍枝根霉種子液，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)5 d，24 h后每12 h測定一次濾紙酶活．在確定最佳碳源的條件下，分別以1%的硫酸銨、氯化銨、胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕粉、豆渣粉、黃豆粉、酵母粉、乳清粉、玉米漿和0.5%的尿素為氮源，按同樣方式發(fā)酵，測定酶活．

②各種氨基酸的添加對酶活的影響.以碳氮源單因素實驗得到的最優(yōu)結(jié)果為碳氮源，其他成分保持不變，配置發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min．向滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已過濾除菌的各種氨基酸，使其最終質(zhì)量分數(shù)為0.1%．以10%的接種量接種培養(yǎng)24 h后的TZ-03種子液，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，每隔12 h測定濾紙酶活．

(3)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件研究.經(jīng)過培養(yǎng)基組分優(yōu)化確定搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)條件，此條件下分別以TP-02和TZ-03為出發(fā)菌株進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，觀察誘變前后酶活的變化．利用搖瓶優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基進行10 L發(fā)酵罐放大實驗．裝液量5 L，接種量為10%，溫度為30 ℃，初始轉(zhuǎn)速300 r/min，初始罐壓0.06 MPa．在發(fā)酵過程中通過對轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓等參數(shù)的調(diào)節(jié)，控制溶氧維持在30%左右；通過調(diào)節(jié)磷酸、氨水的添加量控制pH維持在4.8左右；發(fā)酵24 h后每隔3 h測定一次發(fā)酵液中還原糖含量，以還原糖含量為指標，調(diào)整20%淀粉水解液的補加速度，控制發(fā)酵液中的還原糖含量基本維持在1.2 mg/mL．

(4)各指標實驗方法.

①致死率計算.分別統(tǒng)計未經(jīng)紫外和EMS處理的PDA平板菌落數(shù)和經(jīng)過不同時間誘變處理后的PDA平板菌落數(shù)，按以下公式計算誘變致死率．

②酶活測定.取發(fā)酵液1.2 mL于1.5 mL離心管中，3 500 r/min離心10 s后，將上清液用0.05 mol/L pH 4.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋適當倍數(shù)用于酶活測定．分別以1 cm×6 cm濾紙條、1%CMC溶液1 mL、2%微晶纖維素1 mL和1%水楊苷溶液1 mL為底物[9]，測定FPA酶活、CMC酶活、CBH酶活和BG酶活．酶活定義：適當反應條件下，每分鐘水解底物生成1 μmol還原糖所需的酶量即為一個酶活單位，表示為IU/mL．

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株誘變及篩選

(1)單因子誘變.通過致死率計算得知紫外照射的最優(yōu)時間為5 min，此時的致死率為96.15%；EMS的最佳誘變時間為120 s，菌株的致死率達到98.63%．以此最優(yōu)條件進行多次誘變，將誘變后的孢子懸液稀釋適當倍數(shù)后涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基．利用培養(yǎng)基上透明圈的大小[10]和FPA酶活高低篩選出兩種誘變方式處理后酶活較高的突變株各8株，并命名為UV 01-08，EMS 01-08．

圖1 誘變后各突變株的FPA酶活

誘變后各突變株的FPA酶活如圖1所示.由圖1可知，紫外誘變得到的突變株中UV-05提高明顯，其FPA酶活較TP-02提高了24%；EMS誘變效果優(yōu)于紫外誘變，其中EMS-04的FPA酶活最高，與TP-02相比，其FPA酶活提高了32.2%．誘變劑的復合處理通常表現(xiàn)為協(xié)同作用，且不同誘變劑處理后的穩(wěn)定性不同，紫外線處理后菌株難以回復突變[11]．綜合考慮菌株的穩(wěn)定性和酶活選取UV-05、EMS-02、EMS-04、EMS-05、EMS-07為出發(fā)菌株，進行后續(xù)復合誘變．

(2)復合誘變.對復合誘變得到的菌株進行初篩、復篩，最終由UV-05復合誘變后篩選得到的突變株效果最好，命名為TZ-03，其FPA酶活在108 h可達到4.96 IU/mL，相對TP-02提高了37.8%．TP-02與TZ-03的菌落形態(tài)及透明圈對比圖如圖2所示.由圖2可知，誘變前孢子呈現(xiàn)灰褐色，具有細長菌絲；誘變后，菌絲變短，且孢子顏色為黑褐色．通過對菌落直徑和透明圈直徑之和與菌落直徑比值(H/C)的計算，TZ-03的H/C值明顯高于TP-02，分別為2.67和1.35．遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，10代以內(nèi)TZ-03均能保持較為穩(wěn)定的產(chǎn)酶能力，F(xiàn)PA酶活在5%之內(nèi)波動，TZ-03的遺傳穩(wěn)定性良好．

圖2 TP-02與TZ-03的菌落形態(tài)及透明圈對比圖 圖3 TZ-03的遺傳穩(wěn)定性

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

(1)碳氮源優(yōu)化.碳、氮源在微生物生長過程中提供營養(yǎng)物質(zhì)及參與部分代謝產(chǎn)物的合成，對微生物的生長及產(chǎn)物合成具有重要作用．碳氮源優(yōu)化對FPA酶活影響如圖4所示．由圖4a可知，碳源種類對纖維素酶酶活的影響較為顯著，在以麩皮粉、稻草粉、微晶纖維素、CMC等纖維素類底物為碳源時，酶活相對較高．其中2%的微晶纖維素為碳源時TZ-03在108 h達到FPA酶活峰值6.72 IU/mL，較對照組(稻草粉)提高了26.7%．因此，選取微晶纖維素為最佳碳源．在確定最優(yōu)碳源為微晶纖維素的基礎上研究不同氮源對酶活的影響如圖4b所示.由圖4b可知，當以氯化銨、硫酸銨等無機氮源發(fā)酵時，F(xiàn)PA酶活只有2 IU/mL左右；當選用有機氮源發(fā)酵時，酶活明顯高于無機氮源發(fā)酵．其中，酵母粉、魚粉蛋白胨和胰蛋白胨的效果較好，當以魚粉蛋白胨為氮源時，108 h時達到最高酶活8.21 IU/mL，這可能是因為有機氮源中含有維生素、生長因子或微量元素等能夠促進菌體生長或者誘導產(chǎn)酶的物質(zhì)．

圖4 碳氮源優(yōu)化對FPA酶活影響

(2)氨基酸添加對酶活的影響.氨基酸類營養(yǎng)物質(zhì)可透過細胞膜直接被微生物吸收，會對蛋白質(zhì)的合成速度產(chǎn)生相應的影響，進而影響到這些蛋白質(zhì)所承載的生理活性表現(xiàn)及相關代謝途徑的調(diào)節(jié)[12]．氨基酸添加對FPA酶活影響如圖5所示.由圖5可知，在培養(yǎng)基中添加一定量的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和谷氨酰胺后，濾紙酶活提高明顯，108 h時的FPA酶活分別為10.57 IU/mL、10.76 IU/mL、11.09 IU/mL和11.23 IU/mL．酶活的提高可能與纖維素酶的結(jié)構(gòu)有關，當這些氨基酸加入后可能會對纖維素酶吸附結(jié)構(gòu)域和谷氨酰胺-脯氨酸激活域等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而可能提高底物表面有效酶的濃度或者纖維素酶激活蛋白的轉(zhuǎn)錄過程[13-14]，最終提高了FPA的酶活．

2.3 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

通過以上培養(yǎng)基優(yōu)化實驗，確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基：微晶纖維素20 g/L，魚粉蛋白胨10 g/L，麩皮浸出汁2.5%，CaCl22 g/L，MgSO4·7H2O 4 g/L，KH2PO43 g/L，谷氨酰胺 1 g/L，PEG-4000 0.25 g/L，Tween 80 200 μL/L，微量元素液1 mL/L．

此條件下，TP-02和TZ-03的酶活均在108 h時達到最大值，TP-02與TZ-03的酶活比較如圖6所示．由圖6可知，TP-02的纖維素酶酶活中，EG酶活最高，為5.75 IU/mL，CBH酶活最低，為2.32 IU/mL．而突變之后，BG酶活最高，為24.10 IU/mL，CBH酶活最低，為9.7 IU/mL．BG具有將纖維二糖水解成葡萄糖的作用，雖然纖維二糖在纖維素酶的產(chǎn)生過程中有一定的誘導作用，但是過多的纖維二糖也會抑制EG和CBH的產(chǎn)生[15]．誘變之后，BG酶活增加，可能減弱了纖維二糖對其他酶的抑制作用，從而使3種酶之間的比例更加合理，總酶活FPA酶活增加．

圖5 氨基酸添加對FPA酶活影響 圖6 TP-02與TZ-03的酶活比較

2.4 10 L發(fā)酵罐放大實驗

以搖瓶優(yōu)化最優(yōu)條件進行10 L發(fā)酵罐直接放大實驗，發(fā)酵過程參數(shù)如圖7所示.由圖7可知，0～12 h內(nèi)，糖類物質(zhì)大量被消耗，菌體利用糖類物質(zhì)快速生長繁殖，此過程可能產(chǎn)生了大量的酸性物質(zhì)使發(fā)酵液中的pH下降，12 h時，pH已達最低值3.7．此后可能由于部分酸性物質(zhì)被菌體利用及菌體自溶，pH略有上升，36 h后維持在4.2左右．0～12 h內(nèi)，溶氧量也一直在下降，在10 h時，溶氧下降到8.7%，并維持將近1 h．之后，溶氧逐漸上升，在66 h以后基本維持在80%左右．10 L發(fā)酵罐發(fā)酵酶活曲線如圖8所示．由圖8可知，F(xiàn)PA酶活在72 h達到峰值13.80 IU/mL，與搖瓶發(fā)酵的最高酶活11.58 IU/mL相比，上罐發(fā)酵酶活提高并不明顯，這可能是發(fā)酵過程中的溶氧和pH的不合理導致．溶氧的供應對菌體的正常生長及代謝產(chǎn)酶均有重要影響，所以一般的生產(chǎn)過程控制溶氧在20%～30%[16]，同時pH過低不僅不利于菌體生長，還會造成一部分纖維素酶酶活損失[17]．因此對于溶氧和pH的控制可能是上罐發(fā)酵產(chǎn)酶的關鍵因素，此外，發(fā)酵后期發(fā)酵液中的糖類物質(zhì)過低，只有0.5mg/mL，因此通過適當補料提高發(fā)酵液中糖的含量可能是提高酶活的又一手段．

如圖7b可知，研究主要控制轉(zhuǎn)速使溶氧維持在30%左右，同時通過氨水和磷酸的添加對發(fā)酵過程的pH進行調(diào)控，使其維持在4.8[18]，在發(fā)酵24 h后通過補料使殘?zhí)呛烤S持在1.2 mg/mL左右．其結(jié)果如圖8所示，F(xiàn)PA酶活在84 h達到峰值21.32 IU/mL，與搖瓶發(fā)酵相比提高了89.8%，時間縮短了近24 h，與不進行調(diào)控的上罐發(fā)酵相比，酶活也提高了54.5%．在此條件下CBH酶活于72 h達到最大值16.94 IU/mL，BG和EG酶活也在84 h達到峰值41.06 IU/mL和26.76 IU/mL．

圖7 發(fā)酵過程參數(shù)

圖8 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵酶活曲線

3 討論

目前，工業(yè)上的纖維素酶生產(chǎn)菌主要為里氏木霉、綠色木霉、黑曲霉等，而研究中所采用出發(fā)菌株匍枝根霉TP-02為實驗室自主篩選所得，與常用纖維素酶生產(chǎn)菌株相比，具有產(chǎn)量高、發(fā)酵時間短等優(yōu)勢，因此提高其纖維素產(chǎn)量具有重要工業(yè)價值．當前對匍枝根霉纖維素酶的研究主要集中在分子層面，酶活提高的手段也多為優(yōu)化其培養(yǎng)條件，并未從根本上提高菌株的產(chǎn)酶能力．以匍枝根霉TP-02為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外、EMS和復合誘變等手段篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶菌株TZ-03，其FPA最高酶活為4.96 IU/mL，較原菌提高37.8%．在此基礎上進行發(fā)酵優(yōu)化和10 L發(fā)酵罐放大實驗，最終使其在以微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中FPA酶活84 h酶活達到峰值21.32 IU/mL，菌株產(chǎn)酶能力及產(chǎn)量均得到較大幅度提升．

此外，誘變還改變了纖維素酶酶系組成，TZ-03所產(chǎn)纖維素酶中BG酶活顯著提高．在纖維素酶常見生產(chǎn)菌株中，除黑曲霉外，其他生產(chǎn)菌株如木霉等，其纖維素酶系組成中EG和CBH產(chǎn)量較高，而BG酶活則相比不足，BG具有將纖維二糖分解成葡萄糖從而解除纖維二糖大量積累對其他酶組分造成抑制的作用，其產(chǎn)量過低會影響纖維素酶的酶解效率．實驗誘變選育所得TZ-03菌株BG產(chǎn)量較高，后續(xù)研究若能進一步對誘變后BG酶活提高的原因進行分析，則會為其他菌株的酶系組成優(yōu)化提供一定的理論參考，從而為纖維素酶的大規(guī)模工業(yè)化應用奠定基礎．