淫羊藿苷聯(lián)合冰片對(duì)腦缺血-再灌注損傷模型大鼠抗氧化活性、炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性影響*

閆 磊，胡江平，邵新然，孫曉冬，蔡克瑞

黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院(牡丹江157011)

主題詞 腦缺血/中西醫(yī)結(jié)合療法 淫羊藿苷 冰片

缺血性腦血管病是危害人類(lèi)生命和健康的常見(jiàn)病，腦缺血-再灌注是其重要的病理生理階段。腦缺血后出現(xiàn)的神經(jīng)損傷、炎癥反應(yīng)和繼發(fā)性損傷逐漸引起重視。淫羊藿具有溫陽(yáng)補(bǔ)腎、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕等功效，淫羊藿苷是淫羊藿中的主要活性成分。淫羊藿苷具有改善內(nèi)分泌、抗腫瘤和調(diào)節(jié)心腦血管功能等多重藥理學(xué)作用[1]。冰片辛苦、微寒、性涼，是中醫(yī)藥中一味常用佐藥，具有與其他藥物配伍后促進(jìn)其他藥物透過(guò)生物屏障的作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腦缺血再灌注模型，探索淫羊藿苷配伍冰片對(duì)腦缺血-再灌注損傷模型大鼠抗氧化活性、炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的作用及其機(jī)制。

材料與方法

1 材 料

1.1 動(dòng) 物：SPF 級(jí)大鼠50只，質(zhì)量300～400 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(黑)2015-007。

1.2 試劑與儀器：淫羊藿苷購(gòu)自陜西西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司，冰片購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，髓過(guò)氧化物酶(MPO) 檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) 試劑盒(上海信帆生物技術(shù)公司)，超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，伊文思藍(lán)(EB) 染料(上海翊圣生物技術(shù)有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)，高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：按照隨機(jī)表法將大鼠分成假手術(shù)組、模型對(duì)照組、淫羊藿苷組、冰片組和淫羊藿苷配伍冰片組，每組10只。術(shù)前給藥7 d ，冰片組10%冰片石蠟油2 ml灌胃，含冰片量0.5 g/kg，每天1次；假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予相同體積0.9%氯化鈉注射液；淫羊藿苷組腹腔注射淫羊藿苷(80 mg/kg)2 ml，每天1次；淫羊藿苷配伍冰片組同時(shí)給予10%冰片石蠟油2 ml灌胃和腹腔注射淫羊藿苷(80 mg/kg)2 ml處理。

2.2 腦缺血再灌注模型的制備：腦缺血模型采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉法制備。大鼠術(shù)前禁水4 h，禁食12 h，采用10%水合氯醛( 300 mg/kg ) 腹腔注射麻醉。頸部正中切口后暴露、鈍性分離左側(cè)頸總和頸內(nèi)、外動(dòng)脈并結(jié)扎頸外動(dòng)脈。假手術(shù)組僅剝離左側(cè)頸總動(dòng)脈，但不夾閉頸總動(dòng)脈；其余四組夾閉頸總動(dòng)脈0.5 h后撤掉動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流，縫合。大鼠術(shù)后均在同等條件下正常飼養(yǎng)，24 h 后處死大鼠，并提取腦組織標(biāo)本。

2.3 腦組織SOD活性測(cè)定：腦缺血再灌注24 h 后迅速斷頭處死大鼠，提取缺血側(cè)大鼠大腦額頂葉皮層組織，用生理鹽水制成10%勻漿后按SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量。

2.4 腦組織MPO 活性測(cè)定：腦缺血再灌注24 h 后迅速斷頭處死大鼠，提取缺血側(cè)大鼠大腦額頂葉皮層組織，用生理鹽水制成10%勻漿后按MPO 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量。

2.5 測(cè)定腦組織EB含量：腦缺血再灌注24 h 后，經(jīng)舌下靜脈注射2% EB 溶液1 ml。1 h后迅速斷頭處死大鼠，提取缺血側(cè)大鼠大腦額頂葉皮層組織，將缺血側(cè)大腦組織用生理鹽水制成勻漿并用50%三氯醋酸混勻，24 h后在620 nm處測(cè)定吸光度并計(jì)算腦組織中EB 含量。

2.6 測(cè)定腦組織TNF-α含量：腦缺血再灌注24 h 后迅速斷頭處死大鼠，提取缺血側(cè)大鼠大腦額頂葉皮層組織，用生理鹽水制成10%勻漿后，按ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作測(cè)定TNF-α的表達(dá)。

結(jié) 果

1 淫羊藿苷、冰片對(duì)大鼠腦組織SOD活性的影響 腦缺血-再灌注24 h 后，假手術(shù)組、模型對(duì)照組、淫羊藿苷組、冰片組和淫羊藿苷配伍冰片組的大鼠腦組織SOD活性值，與模型對(duì)照組比較，淫羊藿苷組、冰片組和淫羊藿苷配伍冰片組大鼠腦組織SOD活性明顯增高，其中以淫羊藿苷配伍冰片組作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2 淫羊藿苷、冰片對(duì)大鼠腦組織MPO活性的影響 腦缺血-再灌注24 h 后，假手術(shù)組、模型對(duì)照組、淫羊藿苷組、冰片組和淫羊藿苷配伍冰片組的大鼠腦組織MPO活性值，模型對(duì)照組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，淫羊藿苷組、冰片組和淫羊藿苷配伍冰片組大鼠腦組織MPO活性明顯降低，其中以淫羊藿苷配伍冰片組作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

3 淫羊藿苷、冰片對(duì)大鼠腦組織TNF-α含量的影響 腦缺血-再灌注24 h 后，假手術(shù)組、模型對(duì)照組、淫羊藿苷組、冰片組和淫羊藿苷配伍冰片組的大鼠腦組織TNF-α含量，模型對(duì)照組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與模型對(duì)照組比較，淫羊藿苷組、冰片組和淫羊藿苷配伍冰片組大鼠腦組織TNF-α含量明顯降低，其中以淫羊藿苷配伍冰片組作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1 五組大鼠腦組織SOD活性和MPO活性的比較

4 淫羊藿苷、冰片對(duì)大鼠腦組織EB含量的影響 腦缺血-再灌注24 h 后，假手術(shù)組、模型對(duì)照組、淫羊藿苷組、冰片組和淫羊藿苷配伍冰片組的大鼠腦組織EB含量，模型對(duì)照組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，淫羊藿苷組、冰片組和淫羊藿苷配伍冰片組大鼠腦組織EB含量含量明顯降低，其中以淫羊藿苷配伍冰片組作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 五組大鼠腦組織TNF-α含量和EB含量的比較

討 論

腦缺血再灌注損傷是在腦缺血基礎(chǔ)上再灌注導(dǎo)致的腦組織進(jìn)一步損傷，最終會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡，其機(jī)制尚未完全明確。目前的研究表明，腦缺血再灌注損傷主要與氧自由基損傷、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和細(xì)胞凋亡等幾個(gè)方面有關(guān)[4]。缺血組織再灌注后，氧自由基可以引起微血管和實(shí)質(zhì)器官的損傷；血腦屏障開(kāi)放程度的增加可以導(dǎo)致腦水腫的加重，而炎癥反應(yīng)和炎癥因子的釋放可以通過(guò)加大血腦屏障開(kāi)放的程度從而進(jìn)一步加重腦水腫。因此，如何對(duì)抗氧自由基損傷、減輕炎癥反應(yīng)和降低血腦屏障的開(kāi)放程度已經(jīng)成為防治腦缺血再灌注損傷研究的熱點(diǎn)。

淫羊藿屬于小檗科淫羊藿屬植物，《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次記載了淫羊藿具有強(qiáng)筋骨、滋補(bǔ)腎陽(yáng)、祛風(fēng)濕等功效，藥材來(lái)源為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鮮淫羊藿干燥葉入藥，味辛、甘，性溫。到目前為止，淫羊藿中已被分離鑒定的單體化合物超過(guò)260 余種，主要為黃酮類(lèi)化合物，其中以淫羊藿苷含量最高。淫羊藿苷是傳統(tǒng)中藥淫羊藿的有效藥理成分，是一類(lèi)很有應(yīng)用前景的中藥單體。有研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能夠上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元分化、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，改善記憶功能，調(diào)節(jié)心腦血管功能的作用，因此淫羊藿苷在抗神經(jīng)損傷領(lǐng)域有廣闊的研究前景[5]。但是其是否能在腦缺血-再灌注損傷中起到神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制尚未得到闡述。血腦屏障由大腦微血管系統(tǒng)中無(wú)窗孔的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞構(gòu)成。血腦屏障允許血液循環(huán)中腦組織所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)，而對(duì)腦組織有害的化學(xué)物質(zhì)、大分子物質(zhì)和大部分藥物均不能進(jìn)入腦內(nèi)，是保持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。冰片屬于小分子脂溶性單萜類(lèi)化合物，系龍腦香科植物龍腦香樹(shù)脂的加工品，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、保護(hù)心腦、雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、開(kāi)竅醒神、抗驚厥、提高其他藥物生物利用率、透過(guò)血腦屏障等作用[2-3]。冰片為芳香開(kāi)竅藥涼開(kāi)之代表藥，始載于《新修本草》，明代醫(yī)家李時(shí)珍《本草綱目》記載冰片具通諸竅，散郁火之功?！侗静菅芰x》認(rèn)為其作用特點(diǎn)為獨(dú)行則勢(shì)弱, 佐使則有功，自古就應(yīng)用在中藥配伍中治療疾病。冰片不僅自身能夠透過(guò)血腦屏障，而且還能改變血腦屏障的通透性，促進(jìn)其他藥物透過(guò)血腦屏障，提高其他藥物在腦內(nèi)的濃度增加其治療效果。將淫羊藿苷配伍冰片是否能在腦缺血-再灌注損傷中起到神經(jīng)功能保護(hù)作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，SOD在全身各組織廣泛分布，SOD可以與O2-反應(yīng)形成H2O2，H2O2經(jīng)過(guò)過(guò)氧化物酶的催化生成水從而清除自由基保護(hù)細(xì)胞免受氧化性傷害。SOD活性代表著機(jī)體清除氧自由基、抗氧化能力的強(qiáng)弱[6-7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注模型中增加SOD活性后，腦缺血再灌注引起的組織損傷得以有效減輕[6-7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷配伍冰片在腦缺血再灌注損傷模型中可以起到上調(diào)大鼠腦組織SOD活性的作用，通過(guò)其增加機(jī)體清除氧自由基、抗氧化的能力，起到神經(jīng)保護(hù)作用。MPO是由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些組織的巨噬細(xì)胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過(guò)氧化物酶超家族成員之一，是中性粒細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)水平可由MPO活性反映[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷配伍冰片可以有效降低腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織MPO 活性，提示淫羊藿苷配伍冰片可有效減輕腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)程度起到神經(jīng)保護(hù)作用。炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用，TNF-a是主要的促炎因子之一[9-10]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，TNF-α主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和神經(jīng)元產(chǎn)生[11-13]。在腦缺血再灌注損傷的過(guò)程中，腦缺血早期即可出現(xiàn)TNF-α表達(dá)水平的增高，TNF-α可以激活其它炎性因子表達(dá)，例如IL-1β、IL-1、IL-6、IL-10和IL-17等，從而增加炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重神經(jīng)元的凋亡和腦水腫的程度進(jìn)而導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷進(jìn)一步加重[14-18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷配伍冰片可以通過(guò)降低TNF-α的表達(dá)水平來(lái)抑制炎癥反應(yīng)程度從而減輕腦缺血再灌注損傷。在神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)研究中經(jīng)常把EB作為評(píng)估血腦屏障損傷定性指標(biāo)。EB在正常情況下無(wú)法通過(guò)血腦屏障，當(dāng)血腦屏障被破壞后，EB可以進(jìn)入腦組織，通過(guò)測(cè)定腦組織中EB的含量從而反映出血腦屏障損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷配伍冰片可以有效降低缺血腦組織EB的含量，提示淫羊藿苷配伍冰片可以降低腦缺血再灌注模型大鼠血腦屏障損傷的程度，減少炎性細(xì)胞、炎性因子和相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)入腦組織，減輕腦缺血再灌注損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腦缺血-再灌注模型，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷配伍冰片可以增加SOD活性，降低MPO 活性，降低TNF-α含量和降低血腦屏障的損傷程度，對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠的腦組織起到神經(jīng)保護(hù)作用。