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    不同用途酵母菌株環(huán)境適應(yīng)性差異研究

    2018-11-30 01:06:00王學(xué)東周建軍付國靜胡駿鵬胡先勤羅青平王海燕
    中國飼料 2018年21期
    關(guān)鍵詞:鹽濃度膽酸耐受性

    王學(xué)東, 周建軍, 付國靜,, 胡駿鵬, 劉 瓊,胡先勤, 羅青平, 王海燕, 孫 敏

    (1.武漢輕工大學(xué),湖北武漢 430023;2.安琪酵母股份有限公司,湖北宜昌 443003;3.思科福(北京)生物科技有限公司,北京 100081;4.農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430064;5.北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司,北京 100081)

    飼用酵母能促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝,增強(qiáng)食欲,有利于動(dòng)物的消化吸收,加速動(dòng)物的生長發(fā)育及生產(chǎn)性能的發(fā)揮,還能提高動(dòng)物的抗病、防病能力(Hatoum等,2012)。作為一株優(yōu)良的飼用酵母,其應(yīng)能夠耐受動(dòng)物消化道內(nèi)高酸性、高濃度膽酸鹽的惡劣環(huán)境,并具有產(chǎn)氣量小,發(fā)酵穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)(譚斌,2008)。本研究選取不同用途酵母菌株,對(duì)其環(huán)境抗逆性,即酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性進(jìn)行研究,初步探討造成不同酵母菌株此種差異的環(huán)境抗逆性機(jī)理,并對(duì)其產(chǎn)氣能力進(jìn)行對(duì)比,研究不同用途酵母菌株產(chǎn)氣能力的差異。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品來源 無糖酵母 (無糖高活性干酵母)、耐高糖酵母(耐高糖高活性干酵母)、高酒酵母(福邦釀酒干酵母)、布拉迪酵母(可利貝健抗腹瀉專用干酵母)、畜禽酵母(畜禽專用干酵母)、反芻酵母(反芻專用干酵母)均由湖北宜昌安琪酵母股份有限公司提供。

    1.1.2 培養(yǎng)基 瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基均為國產(chǎn)。

    1.1.3 試劑 鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、硝酸、氯化銫、乳酸、牛膽鹽等均為國產(chǎn)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 酵母菌菌液的培養(yǎng) 取適量制備好的酵母菌懸液,用紫外分光光度計(jì)以無菌液體YPD為對(duì)照測(cè)其吸光度,調(diào)節(jié)菌液濃度OD600=0.8±0.02。

    1.2.2 酵母菌酸脅迫耐受性

    1.2.2.1 不同pH環(huán)境酵母菌生長情況 在滅好菌的液體YPD培養(yǎng)基中加入適量乳酸 (85.0%~90.0%)調(diào)節(jié)其 pH 分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0(空白組),分別取1 mL調(diào)節(jié)好濃度的菌液接種于不同pH液體YPD培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng),利用分光光度計(jì)法,每隔2 h測(cè)定其在波長600 nm下的吸光值,至24 h,觀察酵母菌種在各pH下的生長情況。

    1.2.2.2 酵母培養(yǎng)液中Na+、K+濃度測(cè)定 取制備好的釀酒酵母發(fā)酵液5 mL,經(jīng)3000 r/min離心10 min,取上清液再用定量濾紙過濾后(約為4 mL),作為原樣品液低溫貯存。加熱消化,直至無色透明為止。加入適量水加熱去除多余的硝酸。待燒杯液體接近2~3 mL時(shí),冷卻,用去離子水洗并轉(zhuǎn)移到10 mL刻度試管中,加水定容至刻度。取適量質(zhì)量濃度為1000 mg/L的Na+、K+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制標(biāo)準(zhǔn)系列使用液,濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL。 將消化樣液、試劑空白液、標(biāo)準(zhǔn)稀釋液分別導(dǎo)入火焰,測(cè)其發(fā)射強(qiáng)度。樣品中元素含量計(jì)算公式:

    式中:x為試樣中元素的含量,mg/100 g;c為測(cè)定用試樣液中元素的濃度,μg/mL;c0為試劑空白液中元素的濃度,μg/mL;V為試樣液定容體積,mL;f為試樣液稀釋倍數(shù);m為試樣的質(zhì)量,g。

    1.2.3 酵母菌膽酸鹽耐受性

    1.2.3.1 不同膽酸鹽濃度環(huán)境酵母菌生長情況取適量制備好的菌懸液,在600 nm波長處用液體YPD培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其OD值為0.8±0.02,在膽鹽濃度為 0%、0.30%、0.60%(牛膽鹽,Solarbio,中國)的液體YPD中培養(yǎng)24 h后,參考國標(biāo)GB4789.15-2010,計(jì)數(shù)cfu/mL計(jì)算其存活率,平行3組。計(jì)算公式為:

    1.2.3.2 酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量測(cè)定 精確稱取鮮酵母0.1000 g(精確至0.0002 g)于離心管中,加入4.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液于振蕩器振蕩混勻后置于帶有冰塊的冰水中,每15 min振蕩一次,共1 h,于離心機(jī)3000 r/min離心5 min,將上清液倒入50 mL容量瓶中,用冰水洗滌離心管及沉淀,振蕩混勻后,再放入高速離心機(jī)中設(shè)定轉(zhuǎn)速和時(shí)間3000 r/min離心5 min,將上清液倒入50 mL容量瓶中,然后用冰水稀釋至刻度,搖勻。

    式中:X為試樣中海藻糖的百分含量,%;E為試樣的吸光度;6.29為當(dāng)E=1時(shí),每毫升溶液中含海藻糖的質(zhì)量,mg;W為試樣質(zhì)量,g;Ds為試樣干物質(zhì)的百分含量,%。

    1.2.4 不同酵母菌株產(chǎn)氣特性 采用Risograph酵母活性測(cè)定儀測(cè)定不同酵母不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)氣量。稱取 (50±0.2)g樣品放入特定的量殼體里面,溫度30℃,時(shí)間12 h,酵母活性測(cè)量儀內(nèi)置微處理器含有一個(gè)精準(zhǔn)的采樣時(shí)鐘和輸出緩沖器,保證測(cè)定結(jié)果的可靠性和精確度。RisoSmart軟件給出發(fā)酵能力電子數(shù)表和曲線,進(jìn)而分析和報(bào)告結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同酵母菌種酸脅迫耐受性

    2.1.1 不同pH環(huán)境培養(yǎng)酵母菌的生長曲線 通過低pH沖擊試驗(yàn),采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定酵母在不同pH環(huán)境下的生長情況,從圖1可以看出,6株不同酵母均可在低酸性環(huán)境中生長,且在不同pH環(huán)境中的存活率隨pH下降而降低。其中,布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母3種酵母菌株在較低pH環(huán)境中的存活率均高于其余3種。由此可知,不同的pH環(huán)境對(duì)酵母菌的生長有非常顯著的影響,且不同酵母菌株對(duì)環(huán)境酸脅迫耐受性有顯著差異。

    2.1.2 酵母培養(yǎng)液中Na+、K+濃度 從圖2可以看出,6種酵母培養(yǎng)液,Na+和K+的濃度均隨pH的降低而降低。有研究表明,Na+在生物膜上具有運(yùn)輸特性,即同向運(yùn)輸和反向運(yùn)輸同時(shí)進(jìn)行,其濃度變化在細(xì)胞內(nèi)呈動(dòng)態(tài)平衡(張國順等,2004;Isreal于50 mL容量瓶中加入4.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液,用冰水稀釋至刻度,搖勻,作為空白溶液。吸取空白及樣品1.00 mL于兩個(gè)潔凈干燥的試管中,再分別精確加入蒽酮試液5 mL,振蕩搖勻,沸水浴中反應(yīng)時(shí)間為10 min,拿出立即將樣液溫度冷卻至室溫,再次搖勻,放于分光光度計(jì)630 nm處,用1 cm比色皿測(cè)定吸光度,以空白作對(duì)照。試驗(yàn)樣品中海藻糖積累量的計(jì)算公式如下:等,1993),試驗(yàn)中,Na+濃度明顯降低可能是由于酵母細(xì)胞處于高酸性環(huán)境中時(shí)活菌數(shù)減少導(dǎo)致其從胞內(nèi)釋放到環(huán)境中的Na+減少。K+濃度的降低表明,酵母細(xì)胞在處于高酸性環(huán)境中時(shí)確實(shí)有大量K+進(jìn)入細(xì)胞,維持胞內(nèi)酸堿環(huán)境的穩(wěn)定,從而使得酵母細(xì)胞可以在高酸性的惡劣環(huán)境中存活。試驗(yàn)結(jié)果顯示,反芻酵母、布拉迪酵母和畜禽酵母3株試驗(yàn)用酵母菌株培養(yǎng)液中Na+濃度相對(duì)較高,而K+濃度相對(duì)較低,說明這3株酵母菌株的酸脅迫耐受性較其余幾株酸脅迫耐受性強(qiáng),此結(jié)果與6株試驗(yàn)用酵母菌株的生長曲線結(jié)果一致。

    圖1 6種酵母菌株在不同pH環(huán)境中培養(yǎng)生長情況

    圖2 6種酵母在不同p H環(huán)境培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液中金屬離子濃度變化

    2.2 不同酵母菌株膽酸鹽耐受性

    2.2.1 不同膽酸鹽濃度環(huán)境培養(yǎng)酵母菌的生長曲線 通過膽酸鹽耐受性試驗(yàn),用紫外分光光度計(jì)測(cè)定酵母菌在不同膽酸鹽濃度環(huán)境中的生長情況。從圖3可以看出,6株不同酵母菌株均可在高濃度膽酸鹽環(huán)境中生長,且呈現(xiàn)相同的生長趨勢(shì)。在未加入膽酸鹽的培養(yǎng)基中,6株酵母菌株均在培養(yǎng)6 h時(shí)出現(xiàn)快速增長,到12 h后趨于平穩(wěn),進(jìn)入穩(wěn)定期。在膽酸鹽濃度為0.3%的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)0~6 h時(shí)OD600呈下降趨勢(shì),說明有大量菌體死亡;之后開始增加。在膽酸鹽濃度為0.6%的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)到10 h時(shí)OD600才開始增加,說明隨著膽酸鹽濃度的增加,酵母菌體受到的損害越大。其中,布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母3種酵母菌株在較高膽酸鹽濃度環(huán)境中的存活率均高于其余3株,說明其膽酸鹽耐受性較其余酵母菌株更佳。

    圖3 6種酵母菌株在不同膽酸鹽濃環(huán)境中培養(yǎng)生長情況

    2.2.2 酵母菌細(xì)胞胞內(nèi)海藻糖積累量 從圖4中可以看出,6種酵母胞內(nèi)海藻糖積累量隨膽酸鹽濃度的增加而降低,這可能是由于酵母細(xì)胞處于高濃度膽酸鹽環(huán)境中時(shí)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損害,部分細(xì)胞死亡所致。6株供試酵母菌胞內(nèi)海藻糖含量由高到低排列的順序?yàn)椋悍雌c酵母、布拉迪酵母、畜禽酵母、高酒酵母、耐高糖酵母、無糖酵母,此結(jié)果與其生長曲線結(jié)果一致,說明反芻酵母、布拉迪酵母、畜禽酵母較其余用途酵母菌株膽酸鹽耐受性更佳。

    2.3 不同酵母菌株的產(chǎn)氣特性 作為一株優(yōu)良的飼用酵母菌株,尤其是反芻動(dòng)物專用飼用酵母菌株,其應(yīng)具備產(chǎn)氣量小、發(fā)酵穩(wěn)定的特點(diǎn)(Hofmann等,2008)。從圖5中可以看出,6株不同酵母菌株均可持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)酵,并產(chǎn)生一定量的氣體。其中,無糖酵母和高糖酵母兩種酵母產(chǎn)氣量最高,畜禽酵母和布拉迪酵母次之,反芻酵母和高酒酵母最低。

    圖4 6種酵母在不同膽酸鹽濃度培養(yǎng)24 h后胞內(nèi)海藻糖積累量

    圖5 6株不同用途酵母菌株總產(chǎn)氣情況

    3 討論

    不同用途的酵母菌株需具備不同的特性,作為一株優(yōu)良的飼用酵母菌株,其必須可耐受動(dòng)物消化道內(nèi)的低pH和高濃度膽酸鹽環(huán)境,在通過動(dòng)物的胃部到達(dá)消化道內(nèi)時(shí)具有良好的活性(Didari等,2014)。本試驗(yàn)通過對(duì)供試的6種不同用途的酵母菌株進(jìn)行環(huán)境抗逆性比較,并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行初步探究。6株酵母菌株均可在較低pH環(huán)境和較高濃度的膽酸鹽環(huán)境中生長,但不同用途酵母菌株對(duì)環(huán)境酸脅迫耐受性及膽酸鹽耐受性表現(xiàn)出顯著差異,供試6株酵母菌株中,作為飼用酵母菌株使用的3株酵母菌株,即布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母表現(xiàn)出較強(qiáng)的酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性。且其細(xì)胞內(nèi)金屬離子Na+和K+濃度及胞內(nèi)海藻糖積累量均與其相對(duì)應(yīng)的環(huán)境耐受性表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì),說明當(dāng)酵母細(xì)胞處于較為惡劣的生長環(huán)境中時(shí),其細(xì)胞內(nèi)的一些物質(zhì)會(huì)做出相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)保護(hù)其細(xì)胞免受損害而存活。

    不同用途的酵母菌株的產(chǎn)氣能力存在差異,發(fā)酵面食專用酵母菌株如高糖酵母,應(yīng)具有較好的產(chǎn)氣能力(蘇東海,2008),而飼用酵母若產(chǎn)氣能力好產(chǎn)氣量大,在動(dòng)物進(jìn)食后其進(jìn)入動(dòng)物消化道內(nèi)會(huì)引起動(dòng)物腹脹,如可能會(huì)引起反芻動(dòng)物的瘤胃膨氣(王山宏等,2006),因此,飼用酵母應(yīng)具備產(chǎn)氣量小的特點(diǎn),尤其是反芻動(dòng)物專用飼用酵母菌株。本試驗(yàn)分析了6種不同用途的酵母菌株的產(chǎn)氣特性。其中,反芻酵母產(chǎn)氣能力最差,無糖酵母與高糖酵母產(chǎn)氣能力相對(duì)較好。

    4 結(jié)論

    不同用途的酵母菌株的環(huán)境耐受性及產(chǎn)氣能力存在差異,不同菌株的酸脅迫耐受性與其細(xì)胞內(nèi)Na+、K+濃度變化有密切關(guān)系,膽酸鹽耐受性與其胞內(nèi)海藻糖積累量密切相關(guān)。研究試驗(yàn)菌株中布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母3株酵母菌株的酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性較其余3株酵母菌株強(qiáng),且6株供試酵母菌中,反芻酵母、畜禽酵母和布拉迪酵母的產(chǎn)氣能力均在中等產(chǎn)氣能力以下,故此3種酵母菌株適合作為飼用酵母益生菌株使用。

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