β-伴大豆球蛋白對幼鯉生長、血清生化及免疫指標(biāo)的影響

鄭 鑫， 殷海成*，李昕碩，黃 進(jìn)，黃 巍

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

豆粕不僅蛋白質(zhì)含量高，而且資源豐富、價格合理，常作為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物飼料中替代魚粉的蛋白源（Lin 等，2011；Elangovan 等，2000）。 然而，豆粕含有胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，不僅妨礙水產(chǎn)養(yǎng)殖動物對飼料營養(yǎng)成分的消化與吸收，而且高比例添加會造成魚的腸道過敏型損傷（Ringo等，2006）。其中，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是豆粕中主要的抗原蛋白，尤其是 β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）具有比大豆球蛋白更強(qiáng)的免疫原性（Ogawa等，1995），常誘導(dǎo)幼齡動物如稚魚、幼魚等腸道發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，引起機(jī)體免疫功能紊亂，造成腸道損傷（Zhang等，2013）。吳莉芳等（2008）通過對草魚、鯉魚和埃及胡子鲇幼魚飼喂含大豆抗原蛋白飼料，發(fā)現(xiàn)大豆抗原蛋白會破壞三種食性不同魚的腸道組織完整性，使腸絨毛脫落和腸上皮細(xì)胞分離，影響其生長和飼料利用率。同樣，Zhang等（2013）證實了β-伴大豆球蛋白會導(dǎo)致幼建鯉腸道和腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和過敏損傷。此外，血液系統(tǒng)作為魚體免疫防御的第二道防線，可反映其屬性和生理狀態(tài)，與其代謝、營養(yǎng)與健康等密切相關(guān)（向梟等，2012）。關(guān)于大豆球蛋白對鯉幼魚血液主要生化指標(biāo)的影響已有報道（賴紅娥等，2013）。但對于β-伴大豆球蛋白對“豫選黃河鯉”幼魚血液生化指標(biāo)的影響鮮見報道。本試驗以“豫選黃河鯉”幼魚（幼鯉）為研究對象，通過飼喂添加不同比例的β-伴大豆球蛋白全價飼料，探討其對幼鯉生長、血清生化和免疫指標(biāo)的影響，為合理利用豆粕/大豆蛋白源及解析β-伴大豆球蛋白的抗?fàn)I養(yǎng)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料制備 以魚粉和β-伴大豆球蛋白為蛋白源，魚油和豆油為脂肪源，α-淀粉和糊精為糖源，并補(bǔ)充賴氨酸、蛋氨酸以及復(fù)合維生素和礦物質(zhì)配制含 β-伴大豆球蛋白為 0、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%和 12.5%的 6組等氮 （粗蛋白質(zhì)38.0%）等能（總能15.0 MJ/kg）的試驗飼料。各原料組分經(jīng)粉碎過篩（60目），按配方標(biāo)準(zhǔn)稱重，加油、加水充分混合，用曲阜市圣魯機(jī)械廠生產(chǎn)的SLKL-120B型制粒機(jī)加工成1.0 mm直徑的顆粒飼料，于40℃下烘干6 h，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試驗飼料組成及營養(yǎng)成分見表1。

1.2 試驗魚與養(yǎng)殖管理 試驗用幼鯉為河南省水科院種魚繁殖場繁育的第8代“豫選黃河鯉”幼魚，經(jīng)河南工大生物工程學(xué)院魚類營養(yǎng)實驗室內(nèi)馴化2周 （馴化期用魚粉配制的全價飼料進(jìn)行飼喂）后，選取體重為（48.37±0.03）g 幼鯉 540 尾，隨機(jī)分成6組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾，分養(yǎng)于18個安有自動循環(huán)水的水族箱中，用表1飼料進(jìn)行8周的養(yǎng)殖試驗。每天2次 （9:00和17:00），按照體重的1.3%和1.7%投喂。試驗用水為曝氣的自來水，水溫為（25±1）℃，溶氧和pH約為6.0 mg/L和 6.8。

1.3 樣品采集與測定指標(biāo) 8周養(yǎng)殖試驗結(jié)束，對各組幼鯉禁食 24 h，用MS-222（0.03%）麻醉，稱重和測體長（L），計算各組平均增重率（WGR）、飼料系數(shù)（FCR）、蛋白質(zhì)效率（PER）和平均肥滿度（CF）。各重復(fù)組隨機(jī)選取幼鯉10尾，心臟取血。血液在4℃條件下，以3000 r/min離心25 min，分離血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于測定血清生化及免疫指標(biāo)。

1.3.1 血清生化指標(biāo)檢測 血清生化指標(biāo)采用鄭州大學(xué)一附院Cobas-Mira全自動生化分析儀（羅氏公司，瑞士）檢測。其中，雙縮脲法檢測總蛋白（TP）量、溴甲酚綠法測白蛋白（ALB）量、速率法檢測谷丙（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性、酶法檢測甘油三酯（TG）和膽固醇（CHOL）量。其中，血清總蛋白（540 nm）或白蛋白（630 nm）/（g/L）＝測定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度（g/L）；谷丙（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性/（U/L）=△A/min×F （其中，△A/min為時間變化率，F(xiàn) 試劑因數(shù)）； 膽固醇濃度/（mmol/L）=ESA/EST×5.17（ESA、EST為620 nm處血清和標(biāo)準(zhǔn)液光密度）。

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3.2 血清免疫指標(biāo)檢測 采用免疫試劑盒檢測血清（南京建成生物工程研究所）溶菌酶含量、免疫球蛋白 M（IgM）、白介素 1α（IL-1α）、補(bǔ)體C3、堿性磷酸酶（AKP），具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。其中，速率散射比濁法檢測血清補(bǔ)體C3量。運(yùn)用補(bǔ)體C3抗原與C3抗體反應(yīng)生成免疫復(fù)合物，免疫復(fù)合物有一定的濁度，其濁度與補(bǔ)體C3的量成正比，通過與同樣方法處理校準(zhǔn)液比較，可知血清補(bǔ)體C3含量。同樣方法檢測血清IgM和IL-1α含量。比色法檢測堿性磷酸酶（AKP，U/mg）活性，1 個堿性磷酸酶活性單位定義為100 mL血清在37℃與底物作用15 min產(chǎn)生1 mg酚（Pipe等，1990）。溶菌酶活性測定參照Ellis（1990）的方法。一個溶菌酶活性單位定義為單位時間（min）內(nèi)每毫克蛋白質(zhì)使吸光值變化0.001 的酶量 （U/mg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

WGR/%=（Wt-W0）/W0×100；

FCR=飼料投喂量/Wt-W0；PER/%=（Wt-W0）/（飼料投喂量 × 飼料蛋白含量）×100；CF/（g/cm3）=Wt/L3×100。

式中：Wt、W0分別為試驗?zāi)┢诤统跗谟柞幍钠骄w質(zhì)量，g；L 為體長，cm。

試驗數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)用軟件SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析 （One-way ANOVA），若組間差異顯著再進(jìn)行Duncan’s多重比較，差異水平用p＜0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 β-伴大豆球蛋白對幼鯉生長和飼料效率的影響 由表2可知，隨β-伴大豆球蛋白添加量增加，各組幼鯉的終末體重、增重率、蛋白質(zhì)效率和肥滿度顯著降低，飼料系數(shù)顯著增加 （p＜0.05）。其中，2.5%的β-伴大豆球蛋白組的上述指標(biāo)與對照組差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)β-伴大豆球蛋白添加量等于5.0%時，幼鯉增重率和蛋白質(zhì)效率對比對照組分別降低14.67%、13.09%，而飼料系數(shù)比對照組顯著升高14.49%（p＜0.05）；12.5%β-伴大豆球蛋白組肥滿度顯著低于對照組7.93%（p＜0.05）。

表2 β-伴大豆球蛋白對幼鯉生長和飼料效率的影響

2.2 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清生化指標(biāo)的影響 由表3可知，隨β-伴大豆球蛋白添加量增加，幼鯉血清血糖先增后降，而甘油三酯、尿素氮、膽固醇、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性呈現(xiàn)升高的趨勢，總蛋白呈現(xiàn)降低的趨勢 （p＜0.05）。其中，β-伴大豆球蛋白添加量為5.0%和7.5%兩組血糖顯著高于對照組27.89%、23.22%（p＜0.05），添加量為12.5%組的甘油三酯、尿素氮和膽固醇分別顯著高于對照組27.36%、29.51%、9.05%（p＜ 0.05）， 添加量為 10.0%和12.5%組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶分別顯著高于對照組9.61%、14.98%，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性分別顯著高于對照組 8.12%、10.05%（p＜ 0.05），添加量為10.0%和12.5%組的總蛋白分別顯著低于對照組12.22%、13.52%（P ＜ 0.05）。當(dāng) β-伴大豆球蛋白添加量為5.0%、7.5%和12.5%時，幼鯉血清白蛋白分別顯著低于對照組16.35%、11.66%、10.98%（p＜0.05），而添加量為2.5%和10.0%時血清白蛋白與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清生化指標(biāo)的影響

2.3 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清免疫指標(biāo)的影響 由表4可知，隨β-伴大豆球蛋白添加劑量增5.0%兩組血清溶菌酶活性與對照組差異不顯著（P＞0.05），添加量超過5.0%時則顯著高于對照組（p＜0.05），以添加7.5%組最高，為24.11%。血清補(bǔ)體C3變化與溶菌酶活性相似，其中添加5.0%和7.5%組分別顯著高于對照組20.84%、14.08%（p＜0.05），添加2.5%和10.0%組與對照組差異不顯著（P＞0.05），但添加12.5%組顯著低于對照組1.59%（p＜0.05）。對比對照組，血清免疫球蛋白和白介素-1α隨β-伴大豆球蛋白添加量顯著增加（p＜0.05），但添加2.5%組的免疫球蛋白、添加2.5%～5.0%組的白介素-1α與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。血清堿性磷酸酶活性在β-伴大豆球蛋白添加量為5.0%時比對照組顯著升高40.48%，而添加量為7.5%和10%時又分別顯著升高37.73%、27.30%（p＜0.05）， 其中添加 2.5%和12.5%組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

表4 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清免疫指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 β-伴大豆球蛋白對幼鯉生長和飼料效率的影響 大豆抗原蛋白一方面不僅可干擾人和動物腸道對營養(yǎng)成分的消化和吸收、引起機(jī)體新陳代謝紊亂和造成生理生化反應(yīng)障礙，另一方面由于幼齡動物免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，因而常常造成幼齡動物過敏而導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。其中，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白是大豆抗原蛋白的主要組分，尤其是免疫原性極強(qiáng)的β-伴大豆球蛋白常常誘導(dǎo)幼齡動物過敏反應(yīng) （Ostaszewska等，2005）。Zhao等（2010）研究證實4%的β-伴大豆球蛋白對仔豬十二指腸腸上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、增殖與凋亡產(chǎn)生影響，使腸上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、凋亡增加。Zhang等（2013）通過體內(nèi)外試驗研究β-伴大豆球蛋白誘導(dǎo)幼建鯉腸道上皮細(xì)胞，結(jié)果也證實β-伴大豆球蛋白可引起幼建鯉腸道炎癥和腸上皮細(xì)胞氧化損傷，導(dǎo)致其腸道對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收功能障礙并降低其生長性能。除此之外，魚類攝入高劑量β-伴大豆球蛋白能夠引起消化酶活性降低，導(dǎo)致魚的消化機(jī)能下降，從而降低魚的生長性能和對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的利用。孫玲（2008）報道，不同食性魚類攝食大豆抗原蛋白可使消化酶活性降低。本研究中，添加5.0%的β-伴大豆球蛋白，其增重率、蛋白質(zhì)效率顯著降低，而飼料系數(shù)顯著增加（p＜0.05）。這可能是幼鯉消化道發(fā)育不全，消化酶分泌不足，使β-伴大豆球蛋白滯留消化道，造成應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)幼鯉魚黏膜過敏性損傷。吳莉芳等（2011）利用60.0 mg/g的大豆球蛋白和40.0 mg/g的β-伴大豆球蛋白連續(xù)飼喂鯉、埃及胡子鲇和草魚6周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種魚的腸道完整性呈現(xiàn)不同程度的損傷，生長性能下降。同樣，Rumsey等（1994）利用 34.4 mg/g的 β-伴大豆球蛋白使虹鱒腸道的完整性破壞和生長能力下降。

3.2 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清生化指標(biāo)的影響 血液生化指標(biāo)與其代謝密切相關(guān)，常用于反映動物的健康與生理狀況。谷草/谷丙轉(zhuǎn)氨酶是動物肝細(xì)胞合成的兩種重要轉(zhuǎn)氨酶，可參與調(diào)節(jié)動物機(jī)體蛋白質(zhì)合成與代謝，而尿素氮是蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的主要終末產(chǎn)物之一，正常生理條件下，血清谷草/谷丙轉(zhuǎn)氨酶和尿素氮的含量較低。研究證實，肝細(xì)胞受到應(yīng)激或受損，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶從肝細(xì)胞進(jìn)入血液，使血清中的含量升高，因此，其含量是反映肝細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志 （Strange等，1977）；而尿素氮在血清中的含量較低，表明蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)。在本試驗中，添加小于等于7.5%β-伴大豆球蛋白的各組幼鯉血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性與對照組差異不顯著（P＞0.05），但略有升高，表明適量β-伴大豆球蛋白對幼鯉肝臟未造成顯著損傷，而添加10.0%和12.5%時，谷草和谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著升高，表示肝細(xì)胞膜通透性增加；添加小于等于10.0%β-伴大豆球蛋白各組，幼鯉甘油三酯、尿素氮和膽固醇與對照組差異不顯著（P＞0.05），但略有增加，提示幼鯉肝細(xì)胞蛋白合成能力未受到嚴(yán)重影響，而添加12.5%時顯著增加（p＜0.05），表明肝細(xì)胞受損。因為魚血清中70%～80%膽固醇源于肝細(xì)胞，一旦肝細(xì)胞損傷，則血清膽固醇含量升高；甘油三酯含量高低可反映動物機(jī)體脂肪代謝水平，血清甘油三酯含量的增加，預(yù)示肝損傷，這一結(jié)果與Ma等（2005）結(jié)果類似。血清蛋白對于維持細(xì)胞營養(yǎng)、血液膠體滲透壓和機(jī)體免疫功能起重要作用，可反映出肝細(xì)胞合成蛋白的能力 （Kaushik等，2004）。血糖作為機(jī)體的能量供給物質(zhì)，其含量高低易受機(jī)體新陳代謝和環(huán)境因子的影響，生理條件下，血糖升高，則魚的活動增強(qiáng)、攝食增加（Imsland等，2001）。本試驗條件下，添加β-伴大豆球蛋白小于等于7.5%時，幼鯉血清中總蛋白與對照組無顯著差異，而添加5.0%和7.5%β-伴大豆球蛋白兩組幼鯉血糖含量顯著高于對照組，相反白蛋白顯著低于對照組（p＜0.05），表明幼鯉為滿足蛋白合成，能量供求增加，相應(yīng)地使機(jī)體免疫力降低。

3.3 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清免疫指標(biāo)的影響 魚類和其他脊椎動物一樣，其血清中含有多種非特異性和特異性免疫因子，如溶菌酶、堿性磷酸酶、白介素、補(bǔ)體C3和免疫球蛋白等，檢測血清不同免疫指標(biāo)能體現(xiàn)其機(jī)體免疫應(yīng)答水平（Keller等，1990）。溶菌酶作為其非特異性免疫因子之一，其活力的變化可反映非特異性免疫防御狀態(tài)。本試驗中，2.5%和5.0%β-伴大豆球蛋白添加量對幼鯉血清溶菌酶活力影響不顯著，當(dāng)添加7.5%及更高的β-伴大豆球蛋白，血清溶菌酶活力顯著升高（p＜0.05），說明β-伴大豆球蛋白可激活幼鯉血清非特異性免疫應(yīng)答。Kogdahl等（2000）用含豆粕的日糧飼喂大西洋鮭3周后發(fā)現(xiàn)，中、后腸溶菌酶活力顯著高于對照組，說明大豆蛋白源能激活魚類的非特異性免疫系統(tǒng)。堿性磷酸酶是與骨細(xì)胞代謝密切相關(guān)的代謝調(diào)控酶，其可參與磷酸基團(tuán)、鈣和磷的代謝等活動，因此，在營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用中發(fā)揮作用。研究證實堿性磷酸酶活力的升高是肝病發(fā)生的信號源之一（Giannini等，2005）。 本試驗中，添加5.0%～10.0%的β-伴大豆球蛋白，幼鯉血清堿性磷酸酶顯著高于對照組，說明幼鯉代謝活性增強(qiáng)，同時也預(yù)示肝細(xì)胞膜通透性增加或損傷。然而，Tibaldia等（2006）利用25%的豆粕替代飼料中18.67%的魚粉研究歐洲鱸魚發(fā)現(xiàn)腸道堿性磷酸酶活力降低了16.27%。關(guān)于大豆蛋白可引起幼鯉血清堿性磷酸酶變化差異還需進(jìn)一步研究。巨噬細(xì)胞能分泌白介素、補(bǔ)體C3等多種免疫因子參與機(jī)體免疫。張錦秀等（2008）研究分離大豆蛋白對幼建鯉腸道健康的影響發(fā)現(xiàn)，幼建鯉的前、后腸出現(xiàn)頂端細(xì)胞脫落、固有層增厚且白細(xì)胞增加等病理癥狀，激活腸道特異性和非特異性免疫應(yīng)答。鄒文超等（2014）在斜帶石斑魚飼料中用豆粕替代魚粉觀察其血清溶菌酶、補(bǔ)體C3和IgM水平發(fā)現(xiàn)各替代組均高于對照組。本試驗中，添加大于等于5.0%β-伴大豆球蛋白組幼鯉血清免疫球蛋白M、添加大于等于7.5%組白介素-1α和添加5.0%、7.5%組的血清補(bǔ)體C3均顯著高于對照組，提示添加5.0%及更多的β-伴大豆球蛋白能激活幼鯉免疫系統(tǒng)，增加促炎性細(xì)胞因子水平。然而，研究發(fā)現(xiàn)高劑量添加大豆蛋白在魚類飼料中，能抑制魚的非特異性免疫。Burrells等（1999）用低于50%的豆粕飼料飼喂虹鱒，發(fā)現(xiàn)對免疫狀態(tài)沒有顯著影響，但用含70%的去皮豆粕飼料時，則明顯出現(xiàn)抑制，這一結(jié)果與張錦秀等（2007）研究高劑量添加去皮大豆飼喂幼建鯉相似。由于目前關(guān)于大豆蛋白對魚的免疫報道很少，其差異的原因有待進(jìn)一步試驗驗證。

4 結(jié)論

飼料中添加2.5%的β-伴大豆球蛋白不影響幼鯉生長、血清生化和免疫指標(biāo)，添加5.0%或更高劑量則降低其生長性能，影響白蛋白、免疫球蛋白M、補(bǔ)體C3和堿性磷酸酶等血清生化指標(biāo)，故幼鯉飼料中以添加2.5%的β-伴大豆球蛋白為宜。