熱化學(xué)處理對(duì)玉米秸稈降解及糖化效果的影響

王 平， 常 娟， 劉超齊， 尹清強(qiáng)*， 黃瑋瑋， 王 濤， 黨曉偉， 盧富山

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng) 453000；3.河南普愛(ài)飼料股份有限公司，河南周口466000）

秸稈木質(zhì)纖維素作為結(jié)構(gòu)性碳水化合物是自然界存在的數(shù)量巨大的可再生資源，富含豐富的纖維素和半纖維素（Ravindran等，2016）。然而，因缺乏有效的處理方法，大部分秸稈資源都作為廢棄物被焚燒或埋置于農(nóng)田。秸稈中的纖維素和半纖維素可以通過(guò)微生物發(fā)酵和酶解轉(zhuǎn)化成葡萄糖單體、乙醇、糠醛、動(dòng)物飼料、能量和其他化學(xué)原料（Zu等，2014；Gregg等 1996）。 但是木質(zhì)素復(fù)雜的高分子網(wǎng)狀芳香類聚合物可阻礙纖維素酶接近纖維素聚合物，因此，怎樣去分解木質(zhì)素以提高纖維素聚合物糖化效率至關(guān)重要。

目前，“人畜爭(zhēng)糧”矛盾日益激烈，特別是在世界人口迅速增長(zhǎng)的今天，如何解決這個(gè)矛盾變得越來(lái)越重要。將秸稈中結(jié)構(gòu)性碳水化合物轉(zhuǎn)變成葡萄糖替代動(dòng)物飼料中的能量原料是可行的。Guo 等（2013）和 Chang 等（2012）報(bào)道，玉米秸稈通過(guò)物理處理和微生物發(fā)酵可以轉(zhuǎn)變成動(dòng)物飼料，這將有助于解決畜牧生產(chǎn)中飼料短缺問(wèn)題。

關(guān)于木質(zhì)素裂解和提高秸稈實(shí)用性的方法很多，比如酸、堿、蒸汽爆破和有機(jī)溶劑處理已經(jīng)用于秸稈以提高酶解效率 （寇巍等，2010；王堃等，2006；Saha等，2005；張利等 2001；Yoon 等，1995）。通常高濃度化學(xué)處理（強(qiáng)酸、強(qiáng)堿）效果優(yōu)于低濃化學(xué)處理（弱酸、弱堿）（Han 等，2012）。 但是秸稈作為動(dòng)物飼料開(kāi)發(fā)，高濃度化學(xué)處理不僅會(huì)損害動(dòng)物的健康，還因需要大量的水沖洗處理產(chǎn)物，造成環(huán)境污染和成本增加。研究表明，酸和堿處理秸稈生產(chǎn)乙醇取得顯著成就，但是因化學(xué)離子（Na+，Ca2+和Cl-）超出動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)不適用于飼料生產(chǎn)。二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺和1,3-二甲基-2-咪唑烷酮等有機(jī)溶劑作為共溶劑來(lái)處理秸稈（Mai等，2014），但是這些處理造成有毒有害化學(xué)物質(zhì)加入對(duì)動(dòng)物健康有害。

為了避免上述處理方法中存在的弊端，本研究根據(jù)各種木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理方法和NRC（1994）動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)及單胃動(dòng)物生長(zhǎng)特性，選擇氧化鈣、氫氧化鈉、雙氧水及氨水作為化學(xué)試劑。因?yàn)镃a2+和Na+是動(dòng)物必需的礦物元素，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于家禽對(duì)Ca2+和Na+需求分別為0.8%～2.0%和0.12～0.2%，所以選擇低濃度石灰、2%（m/m）氫氧化鈉來(lái)處理玉米秸稈。化學(xué)處理秸稈中殘留的Ca2+和Na+可以被動(dòng)物吸收，以減少飼糧配方中石粉和食鹽的添加。 雙氧水作為強(qiáng)氧化劑，遇熱分解成水和氧氣，作為秸稈飼料處理具有綠色和無(wú)殘留特點(diǎn)。雙氧水濃度的選擇，從安全的角度考慮，選擇低濃度作為本研究的添加量。氨水作為弱堿性試劑，其殘留的少量氮對(duì)動(dòng)物無(wú)毒無(wú)害，可以被腸道微生物利用。

根據(jù)木質(zhì)纖維素各組分特點(diǎn)，選擇易于生產(chǎn)的低溫?zé)崽幚矸椒▉?lái)降解木質(zhì)纖維素。因?yàn)楦邷靥幚恚ǎ?00°C）生產(chǎn)成本高，對(duì)設(shè)備要求嚴(yán)格，而且部分纖維素和半纖維素分解成還原糖，會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成糠醛、甲酸和丙酸等副產(chǎn)物，不僅影響動(dòng)物健康，還對(duì)酶解產(chǎn)生抑制作用，所以本研究選擇處理溫度 ＜100°C。

本試驗(yàn)在低溫、低濃度下，研究石灰+氫氧化鈉、氨水和雙氧水單獨(dú)處理及復(fù)合化學(xué)低溫處理方法對(duì)玉米秸稈降解的影響，通過(guò)對(duì)不同預(yù)處理玉米秸稈中木質(zhì)纖維素含量及酶解后還原糖的測(cè)定，篩選出最佳的處理組合，為玉米秸稈飼料化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 玉米秸稈取自河南省原陽(yáng)縣郊區(qū)，挑選干凈秸稈去根，自然風(fēng)干。經(jīng)錘片式粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩1 mm，室溫保存。 纖維素酶和木聚糖酶市購(gòu)。根據(jù)美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）纖維素酶測(cè)定方法（IUPAC，1987）測(cè)定纖維素酶活和木聚糖酶活。纖維素酶中包括纖維素酶（323 FPU/g）和木聚糖酶（500 U/g），其蛋白質(zhì)含量為142 mg/g；木聚糖酶中的酶活力為5000 U/g，其蛋白質(zhì)含量為6 mg/g；酶蛋白含量的測(cè)定采用Bradford（1976）方法。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 化學(xué)-熱解秸稈 采用四因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別以 2%（m/m）NaOH+CaO濃度（6%、9%、12%、15%）、 處 理 溫 度 （60、70、80、90℃）、處理時(shí)間（3、6、9、12 h）、液固比（7∶1、9∶1、11∶1、13∶1）；氨水濃度（0%、5%、10%、15%）、處理溫度（20、40、60、80 ℃）、處理時(shí)間（6、12、18、24 h）、液固比 （7∶1、9∶1、11∶1、13∶1）； 雙氧水濃度 （2%、3%、4%、5%）、處理溫度（50、60、70、80 ℃）、處理時(shí)間（2、4、6、8 h）、液固比（7∶1、9∶1、11∶1、13∶1）進(jìn)行化學(xué)熱處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別見(jiàn)表 1、2、3。

不同石灰濃度是取上清液，制備如下：每組處理風(fēng)干秸稈樣品重15.0 g，按照秸稈重的百分?jǐn)?shù)計(jì)，取6% ～15%石灰（m/m），溶于按照不同液固比（水∶秸稈）所取的水中，攪拌5 min，靜止10 min，取上清液。

表1 CaO+2%NaOH正交試驗(yàn)因素

表2 氨水正交試驗(yàn)因素

表3 雙氧水正交試驗(yàn)因素

1.2.2 單一和復(fù)合化學(xué)處理秸稈 本試驗(yàn)是在正交試驗(yàn)最佳處理?xiàng)l件基礎(chǔ)上進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組如下：

1組：未處理秸稈；2組：氨水；3組：2%NaOH+CaO；4組：雙氧水；5組：氨水+雙氧水；6組：2%NaOH+CaO+雙氧水；7組：氨水+2%NaOH+CaO+雙氧水；8 組：2%NaOH+CaO+氨水+雙氧水；9組：氨水+雙氧水+2%NaOH+CaO；10組 ：2%NaOH+CaO+雙 氧水+氨 水 ；11 組 ：2%NaOH+CaO+雙氧水+氨水+雙氧水；12組：2%NaOH+CaO+氨水 （同時(shí)加入）+雙氧水；13組：2%NaOH+CaO+氨水+雙氧水 （同時(shí)加入）；14組：2%NaOH+CaO+氨水。復(fù)合處理中液固比均以第一個(gè)處理試劑液固比為準(zhǔn)。

1.2.3 纖維素酶和木聚糖酶酶解預(yù)處理秸稈 酶解處理是以5%（m/V）秸稈加到蒸餾水中，酶負(fù)荷量為纖維素酶32.3 FPU/g秸稈（相當(dāng)于14.2 mg蛋白質(zhì)/g秸稈）和木聚糖酶550 U/g秸稈（相當(dāng)于0.6 mg蛋白質(zhì)/g秸稈），用0.05 mol/L HCL或Ca（OH）2上清液調(diào)整pH至4.8， 在50°C和180 r/min的搖床中酶解48 h，酶解結(jié)束后100°C處理30 min使酶解反應(yīng)終止，酶解產(chǎn)物50°C烘干，粉碎。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.4.1 還原糖測(cè)定 取處理后秸稈5.0000 g，加入50 mL蒸餾水，浸泡24 h，濾紙過(guò)濾，取濾液測(cè)還原糖，采用 DNS 法（Miller，1959）。

1.2.4.2 木質(zhì)纖維素的測(cè)定 采用濾袋法。中性洗滌纖維（NDF）采用國(guó)標(biāo)GB/T20806-2006；酸性洗滌纖維（ADF）采用Van Soest測(cè)定法；酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）采用國(guó)標(biāo)GB/T20805-2006。計(jì)算方法：

式中：Y表示相對(duì)于處理前秸稈中各指標(biāo)的含量；X表示處理秸稈中各指標(biāo)的含量；W1表示處理后秸稈干物質(zhì)重量；W2表示處理前秸稈干物質(zhì)重量；

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan’s多重比較，差異顯著用p＜0.05表示，所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化鈣+2%氫氧化鈉處理對(duì)秸稈酶解效果的影響 氧化鈣+2%氫氧化鈉正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見(jiàn)表4和表5。由表4可知，RA＞RB＞RC＞RD，說(shuō)明處理溫度對(duì)玉米秸稈酶解作用影響最大，其次為處理時(shí)間，再次為氧化鈣濃度，而液固比的影響較小。由表5可知各因素對(duì)還原糖的提高無(wú)顯著影響。因此，根據(jù)正交表得出最佳處理?xiàng)l件為 A3B2C2D3，即處理溫度 80 °C，時(shí)間 6 h，氧化鈣濃度 9%，液固比 11∶1。

表4 氧化鈣+2%氫氧化鈉正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 氧化鈣+2%氫氧化鈉正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.2 氨水處理對(duì)秸稈酶解效果的影響 氨水正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見(jiàn)表6和表7。由表6可知，RC＞RA＞RD＞RB，說(shuō)明氨水濃度對(duì)玉米秸稈酶解作用影響最大，其次處理溫度，再次液固比，而處理時(shí)間的影響較小。由方差分析表7可知，氨水濃度對(duì)還原糖得率有顯著影響，其他各因素影響不顯著。因此，根據(jù)正交表得出最佳處理?xiàng)l件為A4B2C4D2，即處理溫度 80 °C，時(shí)間 12 h，氨水濃度15%，液固比 9∶1。

表6 氨水正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 氨水正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.3 雙氧水處理對(duì)秸稈酶解效果的影響 雙氧水正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見(jiàn)表8和表9。由表8 可知，RC＞RD＞RB＞RA，說(shuō)明雙氧水濃度對(duì)玉米秸稈酶解作用影響最大，其次液固比，再次處理時(shí)間，而處理溫度的影響較小。由方差分析表9可知，各因素對(duì)還原糖得率無(wú)顯著影響。因此，根據(jù)正交表得出最佳處理?xiàng)l件為A1B2C3D4，即處理溫度50°C，時(shí)間 4 h，雙氧水濃度 4%，液固比13∶1。

表8 雙氧水正交試驗(yàn)結(jié)果

表9 雙氧水正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.4 單一和復(fù)合化學(xué)處理對(duì)秸稈中木質(zhì)纖維素含量的影響 根據(jù)上述正交試驗(yàn)結(jié)果得出各單一化學(xué)處理最佳條件為：9% 氧化鈣 （上清液）+2%氫氧化鈉以液固比11∶1，80°C處理 6 h；15% 氨水濃度以液固比 9∶1，80°C 處理 12 h；4%雙氧水以液固比13∶1，50°C處理4 h。將單一和復(fù)合化學(xué)處理對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表10。由表10可知，未處理玉米秸稈中的纖維素含量為38.13%，半纖維素含量為30.52%，木質(zhì)素含量為7.38%。與未處理組相比，除雙氧水處理組外，不同處理組玉米秸稈中纖維素含量相對(duì)增加了0.28%～7.7%，半纖維素含量均顯著降低（p＜0.05）；除氧化鈣+氫氧化鈉處理組，木質(zhì)素含量顯著降低 （p＜0.05），其中2%NaOH+CaO+雙氧水+氨水+雙氧水組半纖維素和木質(zhì)素降解率最高，分別為72.94%（p＜0.05）和79.95%（p＜0.05）。氨水和雙氧水處理均能顯著提高木質(zhì)素降解率，且二者復(fù)合處理效果更好；而低濃度氧化鈣+氫氧化鈉處理對(duì)木質(zhì)素降解效果不顯著，氧化鈣+氫氧化鈉與雙氧水復(fù)合效果顯著優(yōu)于單獨(dú)處理。

表10 不同處理對(duì)秸稈中木質(zhì)纖維素含量及酶解后還原糖產(chǎn)量的影響

與未處理組相比，除雙氧水和2%NaOH+CaO+氨水+雙氧水（同時(shí)加入）組外，玉米秸稈酶解后所得還原糖均顯著增加（p＜0.05）。與酶解未處理秸稈相比，氨水+雙氧水及2%NaOH+CaO+雙氧水+氨水+雙氧水組酶解后還原糖含量提高6.02倍（p＜0.05）和 6.10倍（P ＜0.05）。與氨水組對(duì)比，2%NaOH+CaO+氨組酶解還原糖顯著降低（p＜0.05），這表明堿與氨水復(fù)合處理具有負(fù)效應(yīng)，同時(shí)堿與雙氧水及氨水與雙氧水復(fù)合處理具有正效應(yīng)。

3 討論

3.1 氧化鈣+2%氫氧化鈉處理對(duì)秸稈酶解效果的影響 氧化鈣是一種來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉的原料，對(duì)處理過(guò)程中所產(chǎn)生的糠醛、乙酸等次生產(chǎn)物具有很好的解毒作用（Heredia-Olea等，2012；Cao等，2012）。氫氧化鈉作為強(qiáng)堿，在高濃度高溫的條件下，能夠有效地去除木質(zhì)素，且提高酶解效率（李忠等，2013；陳廣銀等，2011）。 而秸稈作為飼料資源開(kāi)發(fā)，對(duì)化學(xué)試劑的濃度范圍有嚴(yán)格的要求，兩種低濃度堿結(jié)合在秸稈預(yù)處理應(yīng)用方面有著廣闊的前景 （Zhang等，2011）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在9%氧化鈣（上清液）+2%氫氧化鈉以液固比11∶1，80°C處理6 h條件下對(duì)玉米秸稈酶解效果較顯著，但是對(duì)木質(zhì)素去除效果不顯著，其原因是低濃度堿只能對(duì)纖維素起到潤(rùn)漲作用，以促進(jìn)酶解。歐陽(yáng)嘉等（2010）曾用20%（m/m）氫氧化鈉，80°C處理1 h，總糖得率較未處理秸稈提高46.66%，而本研究使酶解還原糖含量較未處理秸稈提高2.25倍。

3.2 氨水處理對(duì)秸稈酶解效果的影響 一般而言，將秸稈浸在10%（m/m）左右的氨水中處理24～48 h，可以脫除大部分木質(zhì)素和對(duì)發(fā)酵不利的乙酰基。本研究結(jié)果顯示，氨水處理在最佳條件下（15% 氨水、液固比 9∶1、80 °C 處理 12 h），對(duì)玉米秸稈酶解效果顯著。據(jù)報(bào)道，氨水處理可破壞玉米秸稈中木質(zhì)素和多糖間的結(jié)合鍵，增加纖維素含量 （易守連，2010）。本研究結(jié)果表明，氨水濃度對(duì)玉米秸稈酶解作用影響最大，且隨著氨水濃度的增加預(yù)處理玉米秸稈酶解后還原糖含量顯著增加。李靜等（2011）用15%氨水，在40°C下處理39 h，還原糖得率為3.23%，而本研究使還原糖得率提高了4倍，取得了比較滿意的結(jié)果。

3.3 雙氧水處理對(duì)秸稈酶解效果的影響 雙氧水作為強(qiáng)氧化劑，遇熱分解成水和氧氣，作為秸稈飼料處理具有綠色和無(wú)殘留的優(yōu)點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，4%雙氧水、 液固比13∶1、50°C處理4 h對(duì)玉米秸稈酶解效果不顯著。郭佩玉等（1995）報(bào)道，雙氧水處理秸稈是不可行的；但是，通過(guò)電鏡觀察其對(duì)表皮纖維細(xì)胞的作用效果甚小。

3.4 單一和復(fù)合化學(xué)處理對(duì)秸稈中木質(zhì)纖維素和酶解還原糖含量的影響 本試驗(yàn)結(jié)果顯示，氨水單獨(dú)處理、低濃度堿與雙氧水、氨水與雙氧水復(fù)合處理均能提高木質(zhì)素降解率和酶解的得糖率；堿與氨水復(fù)合處理效果小于單獨(dú)處理，且對(duì)添加次序有嚴(yán)格要求，說(shuō)明氨水與堿復(fù)合處理有負(fù)效應(yīng)，其原因?yàn)榘彼鰤A促進(jìn)了氨的分解。由于堿的潤(rùn)漲，木質(zhì)纖維素間的酯鍵發(fā)生皂化，而醚鍵發(fā)生分離，進(jìn)而溶解出半纖維素，從而有利于酶和纖維素的接觸，提高纖維素的糖化效率，從而提高還原糖產(chǎn)量（林有勝等，2009）。徐忠等（2004）的研究表明，10%氨水處理大豆秸稈24 h，使纖維素含量提高70.27%，半纖維素降解41.45%，木質(zhì)素降解30.16%。本研究利用15%氨水處理玉米秸稈12 h，秸稈中纖維素含量提高5.87%，半纖維素降解49.61%，木質(zhì)素降解44.31%。2%NaOH+CaO+雙氧水+氨水+雙氧水復(fù)合處理玉米秸稈，木質(zhì)素降解率最高可達(dá)79.95%，酶解后還原糖含量達(dá)484.61 mg/g干物質(zhì)。

4 結(jié)論

通過(guò)單一和復(fù)合處理對(duì)比表明，堿與雙氧水復(fù)合處理效果顯著優(yōu)于單獨(dú)處理；氨水在低溫、低濃度條件下單獨(dú)處理秸稈能顯著提高酶解還原糖得率；低濃度氨水與雙氧水復(fù)合處理效果優(yōu)于2%NaOH+CaO與雙氧水復(fù)合處理；2%NaOH+CaO+雙氧水+氨水+雙氧水復(fù)合處理對(duì)木質(zhì)素和半纖維素去除效果最佳。經(jīng)過(guò)堿和雙氧水復(fù)合處理后，秸稈中還原糖含量提高，木質(zhì)纖維素降低，為秸稈在單胃動(dòng)物中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。