可手術(shù)胃腸道腫瘤患者血清TK1表達(dá)及其臨床意義

胃腸道腫瘤是常見的惡性腫瘤，有關(guān)腫瘤指標(biāo)或標(biāo)志方面的研究報(bào)道文獻(xiàn)較多，但對(duì)于細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶1（Thymidine kinase 1，TK1）的研究尚不多見。TK1與細(xì)胞的增殖有關(guān)，在DNA的合成中將胸腺嘧啶核苷轉(zhuǎn)換為單磷酸胸腺嘧啶，是嘧啶補(bǔ)救合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[1]近期有研究有表明腫瘤細(xì)胞中高水平的TK1可以從細(xì)胞周期中的S期一直持續(xù)到M期，TK1的表達(dá)水平與DNA的合成具有一致性，在增殖細(xì)胞中水平升高[2]，提示TK1的表達(dá)水平可以作為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的一種標(biāo)志物。研究表明TK1水平升高與多種惡性腫瘤的較差預(yù)后相關(guān)，如慢性淋巴細(xì)胞白血病、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌等[3-5]。因此，本研究化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)65例可手術(shù)的胃腸道腫瘤患者的血清TK1表達(dá)情況，分析其與可手術(shù)胃腸道腫瘤患者臨床病理特征之間的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料

本院2016年1月—2017年9月本院住院患者65例，其中胃癌29例、結(jié)直腸癌36例。均為能手術(shù)切除的病例，而將有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的或不能手術(shù)切除的晚期病例均排除在外。對(duì)65例患者手術(shù)切除的大體病理標(biāo)本保存的蠟塊，均經(jīng)病理學(xué)復(fù)查確診明確無誤，并且術(shù)前均未為化療或放療。其中，男40例，女25例，年齡23～82歲，平均年齡（64.02±1.82）歲。按照國際AJCC標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者術(shù)后進(jìn)行TNM分析，其中I期24例，II期24例，III期10例，IV期7例。隨訪至2018年9月，隨訪時(shí)間為11～22個(gè)月，TK1陽性和陰性表達(dá)患者各失訪1例。

本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，術(shù)前均簽注知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與設(shè)備 TK1試劑盒、GIS-1型化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像分析儀均購自華瑞同康生物技術(shù)（深圳）有限公司。所有研究工作均在本院腫瘤科實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.2 TK1測(cè)定 患者空腹抽血5 ml，30 min內(nèi)高速離心，取血清備用。制備抗體稀釋液、洗液、封閉液。將內(nèi)含硝酸纖維素膜的膜板平放在一張干凈的濾紙上，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品按1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)的順序點(diǎn)樣到A1、A2、A3位置上，每孔3 μl；待測(cè)血清按每孔3μl順序點(diǎn)后面的膜上，室溫下自然晾干。打開膜板，將膜放入反應(yīng)盒內(nèi)，用配置后的稀釋液振搖洗膜2次，每次5 min。棄去洗滌液，加封閉液，室溫下振搖封閉1 h。加一抗（TK1-IgY），4℃下過夜。棄去反應(yīng)液，用洗液漂洗3次后，振搖洗滌3次，每次5 min。加而抗（生物素化抗IgY二抗），室溫下振搖反應(yīng)40 min，棄去反應(yīng)液，用洗液漂洗3次后，振搖洗滌3次，每次5 min。加鏈酶親和素-酶復(fù)合物，室溫下振搖反應(yīng)1 h。棄去封閉液，用洗液漂洗3次后，振搖洗滌3次，每次5 min。加ECL發(fā)光試劑，過膜浸濕，精確反應(yīng)1 min。將膜放入CIS-1型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行分析。上述重復(fù)3次。取3次測(cè)量值均數(shù)，測(cè)量值波動(dòng)范圍為（平均數(shù)±0.5）mg。

1.3 參考值

依據(jù)既往的大樣本臨床試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)確定的血清TK1的參考值，即血清TK1水平0.0～2.0 pmol/L為正常，＞2.0 pmol/L為異常[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman進(jìn)行等級(jí)相關(guān)分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前血清TK1表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

總陽性表達(dá)6例，陽性率9.23%。其中36例腸癌患者TK1陽性3例、陰性33例，而29例胃癌患者TK1陽性3例、陰性26例，兩者之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.08，P＞0.05）.考慮到胃癌和腸癌兩者之間TK1的表達(dá)無明顯差異，同時(shí)鑒于本組資料相對(duì)偏少，因此將兩者合并后再進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。SPSS Pearson相關(guān)性結(jié)果表明：血清TK1的表達(dá)男性明顯較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.13，P＜0.05），并且TK1表達(dá)與Her-2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.746，P＜0.05），而與年齡、T分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無貧血之間均無相關(guān)關(guān)系。胃癌、結(jié)直腸癌患者血清TK1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，見表1。

表1 胃癌、結(jié)直腸癌患者血清TK1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.2 血清TK1水平與Ki-67、Hb的關(guān)系及其相關(guān)性

血清TK1表達(dá)水平與Ki-67、Hb水平的關(guān)系，見表2和表3。SPSS Pearson相關(guān)性結(jié)果表明：TK1表達(dá)陽性患者的Ki-67水平高于陰性患者，呈正相關(guān)性（r=0.396，P＜0.01），而與Hb水平無相關(guān)性（r=-0.261 6，P＞0.05）。

表2 TK1陽性、陰性患者Ki-67、Hb水平比較

表3 血清TK1水平與Ki-67、Hb的關(guān)系及其相關(guān)性

2.3 65例患者手術(shù)前后三次血清TK1表達(dá)水平的比較

對(duì)65例患者進(jìn)行了血清TK1水平共6個(gè)月的追蹤隨訪，以動(dòng)態(tài)觀察其手術(shù)前后以及與化療等治療之間的關(guān)系，測(cè)定了3次血清TK1水平，即術(shù)前1次、術(shù)后1個(gè)月（化療前）和術(shù)后6個(gè)月（化療結(jié)束后）共3次。3次檢測(cè)中，共有TK1陽性9例，其中術(shù)前TK1陽性6例（具體結(jié)果見表3，病例號(hào)1～6）；術(shù)后1個(gè)月陽性6例，其中新增陽性3例（見表4，病例號(hào)7～9）；術(shù)后6個(gè)月陽性6例，均為術(shù)前和術(shù)后1個(gè)月陽性患者，并無新增病例。

表4 術(shù)前、術(shù)后1個(gè)月、術(shù)后6個(gè)月血清TK1陽性病例情況

2.4 隨訪結(jié)果

隨訪至2018年9月，結(jié)果為：TK1陽性死亡3/6（50.0%）、存活3/6（50.00%），TK1陰性死亡5/59（8.47%）、存活54/59（91.53%），兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.498，P＜0.01）。

3 討論

TK1是細(xì)胞周期中S期DNA合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[7]，參與DNA合成和修復(fù)，與細(xì)胞增殖活動(dòng)密切相關(guān)[8]，在腫瘤細(xì)胞增殖過程中明顯升高，近期有研究[9]表明食道癌、胃癌、結(jié)直腸癌等患者的血清TK1的陽性率高于正常對(duì)照組，并且TK1在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，預(yù)示著預(yù)后不良[3-5，10]。并且對(duì)于治療有較大的價(jià)值，在肺癌、宮頸癌和肝癌等治療中都有臨床意義[11-12]，表明TK1能夠表示腫瘤細(xì)胞的增殖程度、因而可以判斷腫瘤的惡性程度，進(jìn)而可以判斷腫瘤的治療效果和預(yù)后。

本次研究結(jié)果表明TK1陽性率為9.23%（6/65），低于Bagegni等[13]TK1在結(jié)腸癌中的陽性率59.21%，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是多方面的，可能本研究入組對(duì)象均為手術(shù)患者，沒有轉(zhuǎn)移等IV期晚期患者，可能影響了TK1的陽性率。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TK1表達(dá)與患者的T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等均無相關(guān)關(guān)系，與Liu MH等[14]TK1在胃癌、結(jié)腸癌和肺癌等中隨著分期有增高趨勢(shì)不相一致，與Miettinen等[10]在晚期非小細(xì)胞肺癌中與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)的結(jié)果一致、但與其TMN分期有關(guān)的結(jié)果不一致。本研究分析選擇的病種及其病情程度（即分期等）有關(guān)不完全相同有關(guān)，比如Liu MH等[14]文章中包含了肺癌等病例，而Miettinen等[10]基本為晚期病例，他們應(yīng)用的是TMN分期，包括了很多有轉(zhuǎn)移在內(nèi)的IV期患者，而本研究中入組患者均為符合手術(shù)治療適應(yīng)證者，患者均無晚期病例或T分期者。這可能是引起結(jié)果不完全一致的主要原因。當(dāng)然也不排除由于本研究樣本量太小，對(duì)于確切的原因，有待于進(jìn)一步深入研究。

研究發(fā)現(xiàn)TK1的表達(dá)與患者的性別、Her-2的表達(dá)和Ki-67的水平具有相關(guān)性。目前臨床普遍認(rèn)為：Her-2是胃癌的獨(dú)立的不良預(yù)后因素，雖然在腸癌中的研究略少，與胃癌患者中表達(dá)結(jié)果相符。Ki-67是胃腸道腫瘤患者疾病嚴(yán)重程度、預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)，通常來說Ki-67陽性表達(dá)越高，表明腫瘤惡性程度越高，患者治療預(yù)后越差。因此，胃腸道惡性腫瘤患者術(shù)前加強(qiáng)患者Ki-67表達(dá)水平能評(píng)估患者疾病嚴(yán)重程度，有助于指導(dǎo)患者手術(shù)治療，使得患者的治療更具科學(xué)性[11]。但是，本研究中亦存在諸多不足，一方面本研究時(shí)間及隨訪時(shí)間較短，可能對(duì)本研究結(jié)果產(chǎn)生偏差；另一方面實(shí)驗(yàn)中納入的病例數(shù)較少，上需要大樣本容量進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，胃腸道癌癥患者術(shù)前血清TK1的表達(dá)與Her-2表達(dá)和Ki-67表達(dá)有關(guān)。檢測(cè)術(shù)前血清TK1對(duì)于指導(dǎo)合理治療和判斷患者的預(yù)后有一定意義。