接骨木鐮刀菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基篩選

楊 波，郭成瑾，王喜剛，沈瑞清,

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 植物保護研究所，銀川 750002)

鐮刀菌屬(Fusarium)真菌是一類分布極其廣泛的真菌[1]，其中的許多種都能嚴(yán)重危害經(jīng)濟作物。通過寄生植物維管束系統(tǒng)，損壞輸導(dǎo)組織，產(chǎn)生某些毒素，可造成作物重大損失，嚴(yán)重時顆粒無收[2]。如尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)可在油桐、西瓜、黃瓜等作物上引起一種毀滅性病害——枯萎病[3-5]；禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)可侵染小麥引起赤霉病[6-7]；燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)、尖孢鐮刀菌均可引起大蒜干腐病[8-9]；茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌等引起甘薯爛根病[10]；接骨木鐮刀菌(Fusariumsambucinum)、茄病鐮刀菌和銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)等是引起甘肅、黑龍江、內(nèi)蒙古等地馬鈴薯干腐病的主要致病菌[11-13]。

接骨木鐮刀菌作為一種致病鐮刀菌，據(jù)有關(guān)報道，它不僅是引起國內(nèi)外馬鈴薯病害的主要病原菌[14-15]，而且是中國甘肅[12]、河北、內(nèi)蒙古[13]、黑龍江[11]及新疆[16]多個馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢病原菌，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。接骨木鐮刀菌在已知培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量不大，因此，一種能夠促進接骨木鐮刀菌產(chǎn)生大量孢子的培養(yǎng)基在致病性等相關(guān)研究中至關(guān)重要。在篩選促進鐮刀菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的研究上，中國學(xué)者做了大量研究。李健等[17]研究結(jié)果表明，以狗尾草玉米淀粉培養(yǎng)基進行鐮刀菌培養(yǎng)，在菌落生長和分生孢子產(chǎn)孢量方面都顯著優(yōu)于其他雜草培養(yǎng)基和日常真菌培養(yǎng)基；在對串珠鐮刀菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的研究中，中國學(xué)者研究表明，蠶豆葉培養(yǎng)基能夠促進串珠鐮刀菌產(chǎn)生大量的分生孢子[18]。有研究認(rèn)為鐮刀菌屬許多種的分離菌株往往有產(chǎn)生豐富菌絲的趨勢而不形成孢子，接骨木鐮刀菌雖然能夠產(chǎn)生孢子，但其在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量往往達不到配制特定濃度孢子懸浮液的要求，且一般情況下接骨木鐮刀菌在合成培養(yǎng)基上生長時，生長和產(chǎn)孢能力都有一定程度的退化，理想的培養(yǎng)基仍然有待開發(fā)[1]。

本試驗選取8種常用鐮刀菌培養(yǎng)基[18-20]，通過菌落生長量和產(chǎn)孢量的測定，從中選出幾種較好的培養(yǎng)基，然后自配5種新的培養(yǎng)基觀察接骨木鐮刀菌的生長量和產(chǎn)孢量，篩選最佳培養(yǎng)基，為以后研究接骨木鐮刀菌提供一種理想培養(yǎng)基，方便科研工作者在研究中配制特定濃度的孢子懸浮液。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：N-34-1號菌株(2017年從采自寧夏西吉縣馬鈴薯‘青署9號’病薯上分離得到)，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子學(xué)鑒定為接骨木鐮刀菌(Fusariumsambucinum)，現(xiàn)保存于寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所實驗室。

常用培養(yǎng)基[19-21]：PSA培養(yǎng)基，VBC培養(yǎng)基，CMC培養(yǎng)基，麥粒培養(yǎng)基，CMA培養(yǎng)基，燕麥培養(yǎng)基，馬鈴薯牛肉膏培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基。

自配培養(yǎng)基：WOA培養(yǎng)基，WLA培養(yǎng)基，OLA培養(yǎng)基，OSA培養(yǎng)基，LSA培養(yǎng)基(自配培養(yǎng)基配方見表1)。

表1 自配培養(yǎng)基的配方Table 1 The formulation of self-made media

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基對接骨木鐮刀菌菌落生長的影響 培養(yǎng)基配制好后分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝100 mL，濕熱滅菌鍋121 ℃下滅菌30 min后，倒入直徑8 cm的培養(yǎng)皿中，每種培養(yǎng)基倒3皿，每皿接入接骨木鐮刀菌的菌餅1塊(直徑5 mm)，放入恒溫培養(yǎng)箱中25.5 ℃恒溫培養(yǎng)，采用十字交叉法測量不同培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間的菌落直徑。

1.2.2 培養(yǎng)基對接骨木鐮刀菌產(chǎn)孢量的影響 培養(yǎng)基配制好后，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝100 mL，濕熱滅菌鍋121 ℃下滅菌30 min后，倒入直徑8 cm的培養(yǎng)皿中，每種培養(yǎng)基倒3皿，每皿接入接骨木鐮刀菌的菌餅1塊(直徑5 mm)，放入恒溫培養(yǎng)箱中25.5 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、3、5、7、9 d時用直徑為 5 mm 的打孔器在菌落上打菌餅，置于1 mL無菌水中制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下觀測孢子數(shù)。

1.2.3 自配培養(yǎng)基的混配方法 根據(jù)8種常用培養(yǎng)基菌落生長和產(chǎn)孢量的試驗結(jié)果，從中篩選出菌落生長快、產(chǎn)孢量大的培養(yǎng)基，將其進行兩兩減半自配，自配出5種新的培養(yǎng)基，依次命名為WOA、WLA、OLA、OSA和LSA培養(yǎng)基，再對5種自配培養(yǎng)基進行接骨木鐮刀菌生長量的測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2000 軟件進行整理，并通過SAS 8.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 常用培養(yǎng)基對接骨木鐮刀菌生長的影響

2.1.1 菌落生長 由表2可以看出，8種常用培養(yǎng)基對接骨木鐮刀菌菌落生長有一定影響。從測量的第2天開始菌落直徑逐漸變大，當(dāng)培養(yǎng)至第8天時菌落直徑均達到最大值。其中PSA培養(yǎng)基上的菌落直徑增長最快，培養(yǎng)至第4天時PSA培養(yǎng)基上的菌落直徑為5.09 cm，比PDA培養(yǎng)基上菌落直徑增加22.40%；第8天時PSA培養(yǎng)基上接骨木鐮刀菌的菌落直徑比最小的PDA培養(yǎng)基增加26.84%。差異顯著性分析表明，培養(yǎng)到 4～8 d 時，PSA培養(yǎng)基上接骨木鐮刀菌的菌落直徑和其他7種培養(yǎng)基之間差異顯著。總體來看，綜合考慮菌落生長的4個時間段，PSA培養(yǎng)基相對于其他培養(yǎng)基接骨木鐮刀菌菌落生長最明顯。

表2 接骨木鐮刀菌在8種常用培養(yǎng)基上的菌落直徑Table 2 The diameter of colonies of Fusarium sambucinum on eight common used media

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lowercases indicated significant differences(P<0.05).The same below.

2.1.2 產(chǎn)孢量 由表3可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，8種培養(yǎng)基上接骨木鐮刀菌的孢子量總體呈現(xiàn)上升趨勢。從第3天開始接骨木鐮刀菌的孢子量逐漸開始增加，除了PDA培養(yǎng)基以外的其他7種培養(yǎng)基均在觀察的第9天達到孢子量的最大值。其中麥粒培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量增長最快，培養(yǎng)至第3天時麥粒培養(yǎng)基上的孢子數(shù)比產(chǎn)孢量最少的燕麥和PSA培養(yǎng)基上的孢子量增加84.98%；當(dāng)培養(yǎng)至產(chǎn)孢量最大的第9天時，麥粒培養(yǎng)基上的孢子量比PSA、VBC、CMC、CMA和PDA培養(yǎng)基上的孢子量分別增加64.67%、94.83%、91.36%、55.15%和89.65%。

差異顯著性分析表明，當(dāng)培養(yǎng)到第3～7天時，麥粒培養(yǎng)基上的孢子量與其他幾種培養(yǎng)基之間差異顯著；培養(yǎng)至孢子量最大的第9天時，麥粒、燕麥和馬鈴薯牛肉膏3種培養(yǎng)基之間孢子量無顯著性差異，而與其余4種培養(yǎng)基差異顯著?？傮w來看，在接骨木鐮刀菌產(chǎn)孢的4個時間段內(nèi)，與其他培養(yǎng)基相比較，麥粒培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量的增幅最明顯，其次為馬鈴薯牛肉膏和燕麥培養(yǎng)基。

表3 接骨木鐮刀菌在8種常用培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量Table 3 Sporulation of Fusarium sambucinumon on eight common used media

2.2 自配培養(yǎng)基對接骨木鐮刀菌生長的影響

2.2.1 菌落生長 由表4可以看出，以常用培養(yǎng)基PDA為對照，5種自配培養(yǎng)基對菌落生長有一定的促進作用，生長速度均大于PDA培養(yǎng)基。隨著培養(yǎng)時間的增加，接骨木鐮刀菌在6種培養(yǎng)基上的菌落直徑也呈現(xiàn)遞增趨勢，當(dāng)培養(yǎng)至第5天時菌落直徑達到最大值。其中WLA培養(yǎng)基上的菌落直徑增長最快，培養(yǎng)至1 d時，生長最快的WLA培養(yǎng)基比對照PDA培養(yǎng)基的菌落直徑增加 20.83%；培養(yǎng)至菌落直徑最大的第5天時，WLA培養(yǎng)基菌落直徑比對照PDA培養(yǎng)基上菌落直徑增加9.57%。差異顯著性分析表明，培養(yǎng)到第2～4天時，WLA培養(yǎng)基上的菌落直徑與其他5種培養(yǎng)基之間差異顯著；培養(yǎng)5 d時，WLA培養(yǎng)基與WOA、OSA、LSA和PDA培養(yǎng)基之間差異顯著。綜上所述，5種自配培養(yǎng)基中WLA培養(yǎng)基對接骨木鐮刀菌的菌落直徑影響最明顯，而其他4種之間差異不顯著，但培養(yǎng)效果都優(yōu)于PDA培養(yǎng)基。

表4 接骨木鐮刀菌在5種自配培養(yǎng)基上的菌落直徑Table 4 The colony diameter of Fusarium sambucinum grown on five self-made media and control medium(PDA)

2.2.2 產(chǎn)孢量 自配培養(yǎng)基對接骨木鐮刀菌產(chǎn)孢量的影響見表5。結(jié)果表明，5種自配培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量隨時間的延長均呈現(xiàn)遞增的趨勢。從第3天開始，各個培養(yǎng)基上接骨木鐮刀菌的孢子量逐漸增加，在測量的第9天時孢子量達到最大值。其中孢子量增長最快的是WLA和OLA培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第3天時，WLA和OLA培養(yǎng)基上的孢子量比對照PDA培養(yǎng)基分別增加84.53%和88.18%；第5天時產(chǎn)孢量最大的OLA培養(yǎng)基比對照PDA培養(yǎng)基增加88.81%；第7天時產(chǎn)孢量最大的WLA培養(yǎng)基比PDA培養(yǎng)基增加87.42%；當(dāng)培養(yǎng)至第9天時，WLA培養(yǎng)基上接骨木鐮刀菌的產(chǎn)孢量則明顯高于其他幾種培養(yǎng)基，WLA培養(yǎng)基上的孢子量比WOA、OLA、OSA、LSA和PDA培養(yǎng)基分別增加78.96%、34.73%、88.49%、65.87%和90.68%。差異顯著性分析表明，培養(yǎng)到第9天時WLA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量與其他5種培養(yǎng)基差異顯著。綜合考慮培養(yǎng)的幾個階段，從產(chǎn)孢量上考慮，WLA和OLA培養(yǎng)基對接骨木鐮刀菌的產(chǎn)孢量具有很好的促進作用，其中最好的是WLA培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

接骨木鐮刀菌在不同培養(yǎng)基上的菌落生長和產(chǎn)孢量存在明顯差異。試驗結(jié)果表明，新配的5種培養(yǎng)基中WLA為培養(yǎng)接骨木鐮刀菌的最適培養(yǎng)基，在菌落生長和產(chǎn)孢量上均優(yōu)于其他幾種培養(yǎng)基。接骨木鐮刀菌是一種重要的致病鐮刀菌，目前關(guān)于接骨木鐮刀菌的研究主要集中在分離鑒定、拮抗菌及抑菌藥劑的篩選方面。魏巍等[13]在對河北和內(nèi)蒙古馬鈴薯干腐病菌種類鑒定中發(fā)現(xiàn)，接骨木鐮刀菌是兩省的優(yōu)勢種群，分離頻率分別為50.00%和87.95%。王愛軍等[22]和崔巖等[23]分別以萎縮芽胞桿菌(B.atrophaeus)和俄羅斯木霉(Trichodermarossicum)為研究對象，發(fā)現(xiàn)他們對接骨木鐮刀菌均有很好的拮抗作用。杜密茹等[24]在對馬鈴薯鐮刀菌干腐病殺菌劑防效研究中發(fā)現(xiàn)，好力克和世高的抑菌效果最好，對菌絲和孢子的抑制率均達100%。接骨木鐮刀菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選研究至今尚未報道，而對于鐮刀菌其他種產(chǎn)孢培養(yǎng)基篩選的報道屢見不鮮，藍(lán)江林等[25]在對尖孢鐮刀菌非致病力菌株281進行培養(yǎng)基篩選試驗中發(fā)現(xiàn)，在選用的8種培養(yǎng)基中PDA和ATCC培養(yǎng)基在產(chǎn)孢量上優(yōu)于其他幾種培養(yǎng)基。溫州民等[26]則在篩選促進禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基研究中發(fā)現(xiàn)，草汁瓊脂培養(yǎng)基能夠促進禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢。

對于真菌培養(yǎng)基來說，碳、氮源和礦物質(zhì)是基本組成物質(zhì)，其中碳源的影響最大，氮源次之。通常情況下，在含有淀粉或者纖維素的基質(zhì)上，可以促進孢子形成。本試驗最終得到WLA培養(yǎng)基對接骨木鐮刀菌菌落的生長及產(chǎn)孢量都優(yōu)于其他培養(yǎng)基，而WLA培養(yǎng)基中馬鈴薯和麥粒中都含有大量的淀粉。據(jù)有關(guān)研究指出當(dāng)用單糖做碳源時不利于真菌在培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，董漢松等[27]研究認(rèn)為PDA培養(yǎng)基并不總是給予真菌最大的產(chǎn)孢量與生長量，PDA培養(yǎng)基中所含的葡萄糖為單糖，而本試驗中自配培養(yǎng)基WLA所含麥芽糖是雙糖而非單糖，這就使得自配WLA培養(yǎng)基在生長量和產(chǎn)孢量上優(yōu)于其他培養(yǎng)基。再輔以牛肉浸膏、水及瓊脂中提供的礦物質(zhì)營養(yǎng)，對接骨木鐮刀菌的生長及大量產(chǎn)孢提供優(yōu)異的環(huán)境，并且WLA培養(yǎng)基的配方簡單，所用原材料均易得，因此可作為培養(yǎng)接骨木鐮刀菌的理想培養(yǎng)基。

本試驗對接骨木鐮刀菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基進行研究，效果很明確，但針對鐮刀菌屬真菌大量產(chǎn)孢的理想培養(yǎng)基，仍有待于在試驗和實踐中去尋找，雖然本試驗最終得到的WLA培養(yǎng)基能夠促進接骨木鐮刀菌的生長及大量產(chǎn)孢，但鐮刀菌屬真菌種類繁多，接骨木鐮刀菌只是其中之一，本試驗尚未明確用WLA培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮刀菌屬真菌的其他種是否有像接骨木鐮刀菌一樣的培養(yǎng)效果，因此有待進一步的試驗與研究。