不同氮磷配施對(duì)黨參根部生長及其活性成分的影響

李瑩瑩，彭玉婷，徐曉藍(lán)，梁宗鎖，2，董娟娥

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310038)

黨參是中國大宗常用藥材之一。桔?？泣h參屬植物黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.的干燥根為中藥材黨參，其性甘、平，用于脾肺氣虛、氣血不足、津傷口渴等癥[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們生活水平提高，醫(yī)療事業(yè)不斷進(jìn)步，黨參需求日益增大，而黨參野生資源品質(zhì)下降[2]，為增大黨參藥源、保障黨參市場供給，人工栽培成為必然。但長期以來，中國黨參人工栽培受傳統(tǒng)種植習(xí)慣影響，缺乏系統(tǒng)栽培理論基礎(chǔ)，產(chǎn)量難以滿足市場供應(yīng)，因此，規(guī)范黨參栽培技術(shù)，提高其產(chǎn)量勢在必行。研究表明，合理施用氮磷肥料可促進(jìn)丹參的生長及活性成分的累積[3]；翟彩霞等[4]研究發(fā)現(xiàn)，施氮對(duì)黃芩根系生長及黃芪甲苷含量影響最大，但施氮量超過一定限度時(shí)，增產(chǎn)幅度反而降低；晉小軍等[5]指出，柴胡的產(chǎn)量和氮磷鉀肥料的施用量有密切聯(lián)系。目前，關(guān)于黨參的研究主要集中于其化學(xué)成分[6-8]及藥理作用[9-11]方面，而關(guān)于黨參施肥體系的研究相對(duì)較少。

本試驗(yàn)通過測定不同氮磷配施下黨參根部的生理指標(biāo)及黨參炔苷、紫丁香苷和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)，研究氮磷肥對(duì)黨參根部生長及其活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，旨在確定適宜寧夏回族自治區(qū)隆德縣實(shí)驗(yàn)區(qū)黨參生長的施肥組合，為其他地區(qū)黨參種植栽培提供參考，為黨參的規(guī)范化栽培與種植技術(shù)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于寧夏回族自治區(qū)固原市隆德縣沙塘鎮(zhèn)藥材示范基地，該地海拔1 846 m，年均氣溫5.1 ℃，年平均日照時(shí)數(shù)2 228 h，無霜期平均124 d，年均降水量745.4 mm。耕層(0～20 cm)土壤含硝態(tài)氮34.9 mg/kg，銨態(tài)氮11.8 mg/kg，速效磷16.3 mg/kg，速效鉀505.8 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試黨參種苗由隆德縣藥材辦提供。供試氮肥為尿素[w(N)= 46%]，磷肥為磷酸二銨[w(P2O5)≥46%]。

試驗(yàn)設(shè)10個(gè)處理，重復(fù)3次，共計(jì)30個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為24 m2(6 m × 4 m)。各處理施肥量如表1所示。于2016年3月底進(jìn)行移栽，栽植行距為20 cm ，株距為15 cm，栽植密度為33.33萬株/hm2。試驗(yàn)地每公頃施農(nóng)家肥2 000 kg作為基肥，后進(jìn)行整地，各小區(qū)按表1施肥量施入底肥，不追肥。

表1 不同處理施肥配比Table 1 Amount of different fertilizer treatments

1.3 儀器與試劑

Waters 1525高效液相色譜儀，Waters 2487紫外檢測器，Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器，Sunfire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，breeze色譜工作站(美國Waters公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；SB25-DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；超純水機(jī)(優(yōu)普)；德國艾科勒(ACCULAB)ALC系列電子天平。

色譜乙腈及甲醇(美國天地有限公司)；黨參炔苷(購自北京博易匯科生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：161224)；蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(購自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：D17041901)；紫丁香苷(購自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：D17051102)。

1.4 采樣與指標(biāo)測定

分別于8月20日、10月17日及11月11日進(jìn)行采樣，選取各小區(qū)長勢基本一致的10株樣品進(jìn)行采挖，洗凈泥沙。

1.4.1 黨參根長、根粗及根鮮干質(zhì)量測定 采用游標(biāo)卡尺測量根直徑，鋼尺測量根長，電子天平測量單根鮮質(zhì)量，后放入烘箱105 ℃殺青30 min，60 ℃烘至恒量，再用電子天平稱其單根干質(zhì)量。烘干后的黨參打粉，過65目篩。

1.4.2 黨參炔苷、紫丁香苷及蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 將11月11日采集的樣品進(jìn)行測定。采用高效液相色譜法，參照關(guān)琳靜等[12]的方法，并做相應(yīng)的改動(dòng)，檢測波長為220 nm；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。流動(dòng)相為乙腈(A)-0.02%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～5 min，A為10%～12%，5～15 min，A為12%～15%，15～20 min，A為15%～28%，20～30 min，A為28%，30～35 min，A為28%～70%，35～45 min，A為70%。

供試品溶液的制備：精確稱取黨參粉末1.0 g，加入甲醇25 mL，精密稱量，超聲30 min，放冷，以甲醇補(bǔ)足失重，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)约状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得[12]。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取黨參炔苷、紫丁香苷和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品適量，以甲醇溶解，制成1 mL含黨參炔苷100 μg、紫丁香苷6 μg、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 2 μg的混合溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取混合對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣4、8、12、16、20 μL，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，得黨參炔苷回歸方程為Y=117 182X-6 578，R2= 0.999 8，紫丁香苷回歸方程為Y=2×106X-5 475.7，R2=0.999 7，蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ回歸方程為Y=1×106X+20 573，R2= 0.999 1，黨參炔苷進(jìn)樣量為0.400～2.000 μg，紫丁香苷進(jìn)樣量在0.024～0.120 μg，蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ進(jìn)樣量在0.002～0.040 μg時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

對(duì)照品與黨參樣品HPLC色譜圖見圖1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著)，用OriginPro 9.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮磷配施對(duì)黨參根部生長的影響

2.1.1 對(duì)黨參根長的影響 由圖2可知，8月20日，除N1P1外，各處理根長均高于N0P0，其中N2P2及N2P3根長顯著高于N0P0，根長最大的處理為N2P3，較最小處理N1P1增加30.8%。10月17日，各處理的根長均高于N0P0，其中N2P2、N3P2、N1P3與N0P0差異顯著，根長最優(yōu)處理為N2P2，較最小處理N0P0根增加23.5%。11月11日，各施肥處理根長均高于N0P0，除N1P1、N2P1、N3P3外，均與N0P0差異顯著，N1P3處理下根長最大，較N0P0增加35.2%?？傮w而言，在N1(氮肥施用量為120 kg/hm2)水平下，隨著磷肥用量的增加，根長逐漸增長；在N2(氮肥施用量為150 kg/hm2)及N3(氮肥施用量為180 kg/hm2)水平下，磷肥施入量增加，呈先增長后降低的趨勢，說明磷肥對(duì)黨參根長具有一定作用，并且在不同氮水平下，磷肥對(duì)黨參根長的影響并不一致。在P1(磷肥施用量為225 kg/hm2)水平，隨著氮肥施入量增加，根長呈上升趨勢；在P2(磷肥施用量為300 kg/hm2)水平下，氮肥施入量增加，根長先增長后降低；而在P3(磷肥施用量為375 kg/hm2)水平下，各處理表現(xiàn)并不一致。說明氮肥能影響黨參根長，在不同磷水平下，氮肥對(duì)黨參根長的影響并不一致。采樣期間，各處理黨參的根長均不斷增長，11月11日根長最大。表明，氮肥及磷肥對(duì)黨參根長均有一定影響，合理的氮磷配比能促進(jìn)黨參根部的伸長，施肥處理N1P3，最有利于黨參根部的伸長。

A.對(duì)照品 Reference substance；B.黨參樣品 The sample of Codonopsis pilosula；1.紫丁香苷 Syringin；2.黨參炔苷 Lobetyolin；3.蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ Atractylenolide Ⅲ

2.1.2 對(duì)黨參根粗的影響 由圖3可知，采樣期間，各處理根粗均不斷增加，施肥處理的根粗均高于N0P0。8月20日，根粗最大的處理為N2P2，其次為N1P3，并顯著高于N0P0，最大處理為N0P0的1.52倍。10月17日，根粗最大的處理為N2P2，其次為N2P3，與N0P0差異顯著，最大根粗為最小根粗的1.30倍。11月11日，根粗最大的處理為N2P2，其次為N1P3、N1P2，與N0P0差異顯著，最大根粗為最小根粗的1.37倍。采樣期間，N1水平的各處理隨著磷肥施入量的增加根粗逐漸增加；N2水平，磷肥施入量增加，各處理生長根粗呈先增加后降低的趨勢；N3水平下，各處理生長趨勢不一致。在P1及P2水平下，各處理隨著氮肥施入量增加呈先增長后減小趨勢；在P3水平下，氮肥施入量增加，各處理根粗不斷減小。由此可知，適宜的施氮量及施磷量對(duì)黨參根部的增粗均有促進(jìn)作用。黨參根粗最優(yōu)處理為N2P2。

圖2 不同施肥配比下黨參根長Fig.2 Root length of Codonopsis pilosula under different fertilization treatments

圖3 不同施肥配比下黨參根粗Fig.3 Root width of Codonopsis pilosula under different fertilization treatments

2.1.3 對(duì)黨參根鮮干質(zhì)量的影響 由圖4和圖5可知，采樣期間，黨參根鮮干質(zhì)量均不斷增長，各施肥處理黨參的根鮮干質(zhì)量均高于N0P0。8月20日，根鮮質(zhì)量最大的處理為N2P3，為N0P0的2.04倍；除N1P1、N2P1、N3P1外，其余處理組的根鮮質(zhì)量顯著高于N0P0。10月17日，根鮮質(zhì)量最優(yōu)處理為N2P2，高出N0P0 41%，N0P0與N1P3、N2P1、N2P2、N2P3間差異顯著。11月11日，根鮮質(zhì)量最大處理為N2P2，是N0P0的1.62 倍，除N3P3外，均與N0P0差異顯著。總體而言，在N1水平下，隨著磷肥施入量增加，各處理組的根鮮質(zhì)量逐漸增大；N2水平下，磷肥施入量增加，根鮮質(zhì)量先增長后減??；而N3水平下，磷肥施入量增加，根鮮質(zhì)量逐漸減小。在P1水平下，隨著施氮量增加，呈現(xiàn)上升趨勢；在P2水平下，施氮量增加，根鮮質(zhì)量先增長后降低；而在P3水平下，N1P3與N2P3根鮮質(zhì)量均高于N3P3。黨參根干質(zhì)量的變化趨勢與根鮮質(zhì)量變化大致相同，且在3次采樣期間，N1P3與N2P2的根干質(zhì)量均高于其他處理組。因此，氮肥及磷肥對(duì)黨參根部增量均有一定影響，合理的氮磷肥量能有效促進(jìn)黨參根質(zhì)量的增加，施肥處理N1P3和N2P2最適宜黨參根質(zhì)量的增加。

2.2 不同施肥配比對(duì)黨參炔苷、紫丁香苷和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2.1 對(duì)黨參炔苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由圖6可知，各施肥處理黨參炔苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于N0P0，最高的處理為N1P3，其次為N2P2和N2P1。在N1水平下，N1P1與N1P2差異不大，而N1P3明顯高于N1P1和N1P2；在N2水平下，N2P1和N2P2相差不大，但N2P3明顯低于N2P1和N2P2；在N3水平下，各處理間差異不大。N3水平處理的黨參炔苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低，說明氮肥施用量過高可能會(huì)減弱對(duì)黨參炔苷積累的促進(jìn)作用。在P1及P2水平下，N2P1明顯高于N1P1和N3P1，N2P2明顯高于N1P2和N3P2；但在P3水平下，N1P3明顯高于N2P3和N3P3。因此，合理的氮磷肥施用量能促進(jìn)黨參炔苷的積累，施肥量過高或過低對(duì)黨參炔苷積累的促進(jìn)效果不明顯，施肥處理N1P3在本研究中有利于黨參炔苷的積累。

圖4 不同施肥配比下黨參根鮮質(zhì)量Fig.4 Root fresh mass of Codonopsis pilosula under different fertilization treatments

圖5 不同施肥配比下黨參根干質(zhì)量Fig.5 Root dry mass of Codonopsis pilosula under different fertilization treatments

2.2.2 對(duì)黨參紫丁香苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由圖7可知，各施肥處理的黨參紫丁香苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于不施肥處理N0P0，紫丁香苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的處理為N1P3，其次為N2P2和N2P1。在N1水平下，N1P1與N1P2相差不大，但N1P3明顯高于N1P1和N1P2；在N2水平下，N2P1和N2P2明顯高于N2P3；在N3水平下，各處理差異不明顯。在P1及P2水平下，N2P1及N2P2明顯高于N1P1、N1P3和N2P1、N2P3；在P3水平下，N1P3明顯高于N2P3和N3P3。由此，施用氮磷肥對(duì)黨參紫丁香苷的積累具有促進(jìn)作用，在本次試驗(yàn)中，最有利于紫丁香苷積累的施肥組合為N1P3。

**表示差異性極顯著(P<0.01)，下同

圖7 不同施肥配比下黨參紫丁香苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.7 Mass fraction of syringin in Codonopsis pilosula under different fertilization treatments

2.2.3 對(duì)黨參蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由圖8可知，蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的處理為N1P1，但除N2P2與N3P3外，均高于N0P0。各施肥處理間無明顯變化趨勢。因此，總體而言，施用氮磷肥有利于黨參蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的積累，推測低施肥量處理于其更有利。在本次試驗(yàn)中，最適宜蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ積累的處理為N1P1。

圖8 不同施肥配比下黨參蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.8 Mass fraction of atractylenolide Ⅲ in Codonopsis pilosula under different fertilization treatments

3 討論及結(jié)論

合理施肥可以增加植物種植產(chǎn)量。研究顯示，合理施肥可使黨參的產(chǎn)量及品質(zhì)得到顯著提升[13-15]。因而在生產(chǎn)中探究合理的施肥配比及施肥量對(duì)于黨參栽培技術(shù)的研究具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，適宜的氮磷肥施用量對(duì)黨參根長、根干鮮質(zhì)量具明顯促進(jìn)作用，這與胡佳棟等[13]、龔成文等[16]的研究一致。

植物體內(nèi)有諸多重要的化合物，諸如核酸、蛋白質(zhì)、葉綠素等，其不可或缺的組分便是氮元素[17]，而氮元素是黨參生長發(fā)育最重要的元素，缺乏氮素會(huì)造成黨參根系短小，植株生長緩慢。磷素的缺失會(huì)抑制細(xì)胞分裂，造成植物生長停滯，阻礙蛋白質(zhì)的合成及糖的運(yùn)輸，致使植株生長緩慢[18]。因此，適當(dāng)施用氮磷肥對(duì)于黨參根部的生長而言是必要的。該試驗(yàn)中， P1水平處理下的黨參根長、根粗、根鮮質(zhì)量和根干質(zhì)量低于P2水平，說明P1水平的磷肥施用量難以滿足黨參根部生長需求，致使其生長緩慢，因此N2P1處理的黨參根部生長指標(biāo)有所下降。 N1P3及N2P2處理下的黨參根長、根粗、根鮮質(zhì)量和根干質(zhì)量均達(dá)到最大值。而N3水平下的黨參根長、根粗及根鮮質(zhì)量和根干質(zhì)量均低于N2水平，這可能是由于N2水平的氮肥足以滿足黨參生長的需求，氮肥施用量過多會(huì)導(dǎo)致地上部分徒長，消耗大量營養(yǎng)，反而影響根的生長[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在氮肥施用量較高時(shí)，增加磷肥的施用量會(huì)使黨參根部的生長呈下降趨勢，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)黨參根部氮素濃度較高，而磷素供應(yīng)量的增加又促進(jìn)了黨參對(duì)氮素的吸收[20]，因而產(chǎn)生高氮脅迫，抑制黨參根部的生長。研究證明，施氮量增加，水稻植株對(duì)磷肥的吸收量有所提升[21]，因此，磷肥濃度較高時(shí)，增加氮肥施用量可能會(huì)使黨參根部過高的磷素水平再度提高，造成高磷脅迫，從而使黨參根部生長減弱。

本研究表明，適當(dāng)施用氮肥及磷肥能促進(jìn)黨參炔苷、紫丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的積累。其原因可能是黨參炔苷、紫丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ均為次生代謝物，而施肥能提高有效氮含量，使得 NH4+含量升高，促進(jìn)氮代謝的進(jìn)程，增加氨基酸積累量，而大多數(shù)氨基酸能明顯促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成[22-23]。在本次試驗(yàn)中，N2P1處理的黨參根部生理指標(biāo)雖有所下降，而活性成分質(zhì)量卻沒有明顯下降，可能就是因?yàn)榇龠M(jìn)活性成分黨參炔苷、紫丁香苷合成的主要是氮元素。

適宜的氮磷肥施用量能促進(jìn)黨參根部的生長及黨參炔苷、紫丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的積累。本次試驗(yàn)中，除蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在N1P1下質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高外，處理N1P3及N2P2的黨參根長、根粗、根鮮干質(zhì)量及黨參炔苷、紫丁香苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為最高水平。目前，黨參干貨市場價(jià)格為40元/kg左右，尿素價(jià)格約為2元/kg，磷酸二銨約為3元/kg，按11月11日采集的黨參樣品計(jì)算，處理N0P0、N1P3、N2P2產(chǎn)量分別為813.25 kg/hm2、1 256.54 kg/hm2、1 289.87 kg/hm2,扣除相應(yīng)的肥料成本，處理N0P0、N1P3、N2P2收益分別為32 530.0元、48 896.6元、50 394.8元。可知施用氮磷肥帶來的收益遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不施肥，而N2P2處理收益更優(yōu)于N1P3。因此建議試驗(yàn)點(diǎn)優(yōu)先采用施入尿素150 kg/hm2、磷酸二銨300 kg/hm2來種植黨參，其次可采用施用尿素120 kg/hm2、磷酸二銨375 kg/hm2。綜上所述，黨參栽培過程中，應(yīng)考慮黨參種類、施肥配比、生產(chǎn)地土壤與氣候條件等各種因素的相互作用，確定合適的施肥量[16]，以保證黨參生長需求，提升黨參品質(zhì)。