選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑對(duì)創(chuàng)傷后異位骨化形成的預(yù)防作用及對(duì)OPG/RANKL信號(hào)通路的影響

馮祁軍 范存義 劉師良 吳可沁 季斌

[摘要] 目的 探討選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑對(duì)創(chuàng)傷后異位骨化的預(yù)防作用及對(duì)OPG/RANKL信號(hào)通路的影響。方法 實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分成對(duì)照組（C組）、模型組（M組）和帕瑞昔布低劑量組（P1組）、中劑量組（P2組）、高劑量組（P3組），M、P1、P2及P3組建立異位骨化模型，期間給予生理鹽水或帕瑞昔布（4、8、12 mg/kg）。X線評(píng)估異位骨化形成情況，免疫組化方法檢測(cè)OPG、RANKL蛋白的表達(dá)，RT-PCR法測(cè)定TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組異位骨化明顯增多（P<0.05），TNF-α、IL-1β mRNA及OPG蛋白表達(dá)明顯增多（P<0.05），OPG/RANKL比值明顯增大（P<0.05）；與模型組比較，中、高劑量帕瑞昔布組異位骨化明顯減少（P<0.05），TNF-α、IL-1β mRNA及OPG蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.05），OPG/RANKL比值明顯降低（P<0.05），隨著劑量增加減少越明顯（P<0.05）。 結(jié)論 OPG/RANKL信號(hào)通路的激活可能是創(chuàng)傷后異位骨化形成的重要因素，中、高劑量帕瑞昔布能降低OPG/RANKL比值，對(duì)預(yù)防異位骨化有積極作用。

[關(guān)鍵詞] 異位骨化；環(huán)氧化酶2抑制劑；TNF-α mRNA；IL-1β mRNA；OPG/RANKL

[中圖分類號(hào)] R687.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）21-0016-05

[Abstract] Objective To investigate the preventive effect of selective cyclooxygenase 2 inhibitor on heterotopic ossification after trauma and its effect on OPG/RANKL signaling pathway. Methods The experimental rabbits were randomly divided into control group（group C）， model group（group M） and parecoxib low dose group（group P1）， medium dose group（group P2）， high dose group（group P3）. M， P1， P2 and P3 groups established heterotopic ossification model. Saline or parecoxib was given（4， 8， 12 mg/kg）. Heterotopic ossification was evaluated by X-ray. Immunohistochemistry was used to detect the expression of OPG and RANKL protein， and the expression of TNF-α and IL-1β mRNA was determined by RT-PCR. Results Compared with the control group， the heterotopic ossification in the model group was increased significantly（P<0.05）. TNF-α， IL-1β mRNA and OPG protein expression was increased significantly（P<0.05）. The ratio of OPG/RANKL was increased significantly（P<0.05）； compared with the model group， the heterotopic ossification in the medium-dose and high-dose parecoxib group was significantly reduced（P<0.05）. TNF-α， IL-1β mRNA and OPG protein expression was decreased significantly（P<0.05）. OPG/RANKL ratio was significantly lower（P<0.05）. The decrease was more significant along with the increase of doses（P<0.05）. Conclusion Activation of OPG/RANKL signaling pathway may be an important factor in the formation of heterotopic ossification after trauma. Medium and high-doses of parecoxib can reduce the ratio of OPG/RANKL， which has a positive effect in the prevention of heterotopic ossification.

[Key words] Heterotopic ossification； Cyclooxygenase 2 inhibitor； TNF-α mRNA； IL-1β mRNA； OPG/RANKL

異位骨化（heterotopicossification，HO）是指在非骨組織中出現(xiàn)骨形成[1]，其嚴(yán)重影響患者肢體功能的恢復(fù)。目前HO的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此很難找到有效的防治方法。傳統(tǒng)的防治方法，如非甾體類藥物因胃腸道刺激較大、血小板減少等不良反應(yīng)導(dǎo)致部分患者停藥，并且對(duì)于術(shù)后惡心、嘔吐及不能進(jìn)食的患者不是理想選擇[2]。Kelllinsalmi等[3]研究發(fā)現(xiàn)選擇性COX-2抑制劑帕瑞昔布可以抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，抑制骨修復(fù)階段成骨細(xì)胞標(biāo)記分子的表達(dá)，從而抑制成骨細(xì)胞活性，可以有效預(yù)防異位骨化。研究證實(shí)[4]：護(hù)骨素（OPG）和核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）可直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的形成及功能，OPG/RANKL系統(tǒng)是調(diào)節(jié)骨代謝最后的共同通路。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[5]：腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素（IL-1β）是創(chuàng)傷后組織中重要的炎癥因子，在激活OPG/RANKL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著舉足輕重的作用。然后，TNF-α、IL-1β及OPG/RANKL信號(hào)通路在異位骨化中的作用機(jī)制尚未明確。本研究擬采用Michelsson方法[6]建立異位骨化模型，觀察不同劑量選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑帕瑞昔布對(duì)創(chuàng)傷后異位骨化的預(yù)防作用及對(duì)OPG/RANKL信號(hào)通路表達(dá)的影響，旨在探討創(chuàng)傷后異位骨化的形成機(jī)制以及環(huán)氧化酶2抑制劑帕瑞昔布鈉對(duì)創(chuàng)傷后異位骨化防治的藥理作用，為防治異位骨化提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

取40只雄性新西蘭白兔，體重2.5～3.0 kg，由嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SYXK（2014-0017）。用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（C組）、模型組（M組）、帕瑞昔布低劑量組（P1組）、帕瑞昔布中劑量組（P2組）、帕瑞昔布高劑量組（P3組），每組8只。

1.2 藥品與儀器

注射用帕瑞昔布鈉（生產(chǎn)廠家：Pharmacia and Upjohn Company，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20130044，規(guī)格40 mg）；兔抗兔OPG抗體和兔抗兔RANKL抗體（美國(guó)SANTA CRUZ公司）；SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德公司），L-多聚賴氨酸（武漢博士德公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）。主要儀器：Motic6.0圖像分析軟件、光密度校正片（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）、空間校正片（廈門Motic圖像分析有限公司）。RT-PCR反應(yīng)儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)分公司）。

1.3 動(dòng)物模型制備及分組處理

各組新西蘭實(shí)驗(yàn)兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用水合氯醛麻醉，先行右側(cè)股骨正側(cè)位X攝片確保無異位骨化形成，模型組和帕瑞昔布低劑量組、帕瑞昔布中劑量組、帕瑞昔布高劑量組新西蘭實(shí)驗(yàn)兔每天最大范圍屈伸活動(dòng)膝關(guān)節(jié)5 min，活動(dòng)后用石膏固定右膝和右踝關(guān)節(jié)（石膏繃帶制成13～15 cm長(zhǎng)，10～12層厚，前窄后寬的3/4 管狀石膏條帶），右髖關(guān)節(jié)不固定，將兔放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。這個(gè)操作每星期6 d持續(xù)5周。操作后第1天，P1、P2、P3組即分別給予帕瑞昔布鈉4、8、12 mg（kg·次），每日2次，加入適量生理鹽水中靜脈滴注，連續(xù)5周，對(duì)照組與模型組給予等量生理鹽水靜脈注射。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 異位骨化形成評(píng)價(jià) 各組新西蘭白兔分別在造模后的第6周，攝右股骨正側(cè)位X線片，評(píng)價(jià)異位骨化是否發(fā)生及異位骨化的范圍。異位骨化形成的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照Scott等[7]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無反應(yīng)；Ⅰ級(jí)，骨膜反應(yīng)；Ⅱ級(jí)，異位骨形成但少于股骨長(zhǎng)度的一半；Ⅲ級(jí)，異位骨形成大于等于股骨長(zhǎng)度的一半。計(jì)算各組的平均分級(jí)（由兩名主任醫(yī)師共同評(píng)級(jí)）。（0 級(jí)例數(shù)×0+Ⅰ級(jí)例數(shù)×1+Ⅱ級(jí)例數(shù)×2+Ⅲ級(jí)例數(shù)×3）/總例數(shù)=平均分級(jí)。

1.4.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)OPG、RANKL表達(dá)的變化 切取標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，10% EDTA溶液脫鈣，石蠟包埋，切成4～5 μm薄片。切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟水化，高溫抗原修復(fù)，3%過氧化氫封閉，滴加OPG和RANKL一抗，室溫孵育1 h，滴加二抗，DAB顯色，復(fù)染，封片，光學(xué)顯微鏡下判定結(jié)果。每例切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，同一載玻片上OPG和RANKL染色選取相同位置的高倍視野，按染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比評(píng)分。染色強(qiáng)度分為：無色（0分），淡黃色（1分），棕黃色（2分），棕褐色（3分）；陽性細(xì)胞數(shù)分為：<5%（0分），5%～25%（1分），26%～50%（2分），>50%（3分）。染色強(qiáng)度得分乘以陽性細(xì)胞數(shù)得分相得出OPG和RANKL蛋白表達(dá)綜合評(píng)分，取5個(gè)高倍視野綜合評(píng)分的平均分值作為OPG和RANKL最終表達(dá)水平。計(jì)算OPG平均分值和RANKL平均分值的比值，即為OPG/RANKL比值。

1.4.3 采用RT-PCR法測(cè)定組織中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA的表達(dá) 取適量組織參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書用TRIzol法提取組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參，cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，分析目的基因與內(nèi)參基因吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用例/率表示，采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異位骨化造模結(jié)果

造模6周時(shí)X線攝片并計(jì)算各組平均分級(jí)，與對(duì)照組比較，模型組新西蘭實(shí)驗(yàn)兔異位骨化明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，低劑量帕瑞昔布組異位骨化有所減少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），中、高劑量組異位骨化明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與中劑量組比較，高劑量組異位骨化明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖1。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

對(duì)各組組織標(biāo)本行免疫組化染色，陽性表達(dá)著色，陰性不著色。標(biāo)本中OPG和RANKL陽性表達(dá)呈棕黃色，陽性染色細(xì)胞主要為成骨細(xì)胞、骨祖細(xì)胞、破骨細(xì)胞及成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈條帶狀或團(tuán)狀分布，著色強(qiáng)度不一。分別對(duì)異位骨化OPG、RANKL表達(dá)情況及OPG/RANKL比值進(jìn)行比較，結(jié)果如下：模型組新西蘭實(shí)驗(yàn)兔OPG表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；OPG/RANKL比值明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。與模型組比較，帕瑞昔布低劑量組OPG表達(dá)及OPG/RANKL比值有所減少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），中、高劑量組OPG表達(dá)明顯減少，OPG/RANKL比值明顯低于模型組（P<0.05），且隨著劑量增加減少越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組RANKL蛋白表達(dá)差異無顯著性（P>0.05）。見表2、圖2、圖3。

2.3 帕瑞昔布對(duì)異位骨化組織中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)的影響

模型組新西蘭白兔TNF-α mRNA、IL-1β mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，帕瑞昔布低劑量組TNF-α mRNA、IL-1β mRNA有所減少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），中、高劑量組TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)明顯減少（P<0.05），隨著劑量增加減少越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3、圖4。

3 討論

隨著人工關(guān)節(jié)的廣泛應(yīng)用及關(guān)節(jié)切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù)的推廣，近年來HO的發(fā)病率顯著上升[8]。異位骨化發(fā)生后使關(guān)節(jié)活動(dòng)受到限制，甚至導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失[9]。本實(shí)驗(yàn)通過反復(fù)暴力損傷軟組織加長(zhǎng)期固定的方法建立異位骨化模型，在建模過程中多次暴力損傷造成軟組織出血、腫脹，影響局部血液循壞，刺激炎癥反應(yīng)的發(fā)生，是造成異位骨化的首要條件。長(zhǎng)期固定可使肢體發(fā)生退行性變，軟組織鈣化，最終導(dǎo)致異位骨化形成。由建模結(jié)果可知，第6周X線可見模型組新西蘭實(shí)驗(yàn)兔右股骨外側(cè)異位骨化形成，影像學(xué)上與創(chuàng)傷所致的異位骨化相似，說明異位骨化建模是成功可靠的，有利于對(duì)異位骨化的病理和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)于造模開始24 h后給予靜脈注射低（4 mg）、中（8 mg）、高（12 mg）劑量的帕瑞昔布，觀察帕瑞昔布能否預(yù)防異位骨化形成及是否具有劑量依賴關(guān)系。結(jié)果表明，帕瑞昔布低劑量（4 mg）對(duì)異位骨化的抑制作用僅限于微觀病理形態(tài)學(xué)的改變，對(duì)異位骨化的形成沒有明顯作用。當(dāng)帕瑞昔布達(dá)到中劑量（8 mg）時(shí)對(duì)異位骨化的形成明顯抑制改善，并隨著藥物劑量的增大，對(duì)異位骨化的抑制效果更明顯。

異位骨化的組織學(xué)特征為成纖維細(xì)胞活動(dòng)增加，纖維組織異常增生，繼而出現(xiàn)玻璃樣變性形成，最終鈣質(zhì)沉積及新骨形成[10]。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是骨質(zhì)重塑過程中兩個(gè)主要細(xì)胞，正常情況下維持在一定的平衡水平[11]。OPG和RANKL均主要由成骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生[12]，OPG可增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性及分化，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)鈣化及骨質(zhì)形成；RANKL能與破骨細(xì)胞上的RANK結(jié)合促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化并增強(qiáng)其活性，促進(jìn)骨質(zhì)破壞和吸收[13]。本研究對(duì)新西蘭實(shí)驗(yàn)兔異位骨化組織中OPG和RANKL蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明異位骨化組織中有OPG和RANKL蛋白表達(dá)陽性，主要位于成骨細(xì)胞、骨祖細(xì)胞、破骨細(xì)胞及成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)。與正常組織比較，發(fā)現(xiàn)OPG表達(dá)在異位骨化組織中明顯增加，主要由新生骨組織間成骨細(xì)胞表達(dá)并與鈣質(zhì)沉積的部位關(guān)系密切，提示OPG可能參與創(chuàng)傷后異位骨化形成過程，而且OPG/RANKL的比值也顯著升高。以上結(jié)果表明，OPG/RANKL信號(hào)通路是骨代謝中重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，可能在異位骨化形成過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

TNF-α和IL-1β是OPG/RANKL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的常見炎癥激活因子[14]。TNF-α及IL-1β在炎癥因子網(wǎng)絡(luò)中處于炎癥因子瀑布的最上游，介導(dǎo)了一系列的不同的炎性反應(yīng)，當(dāng)組織內(nèi)高表達(dá)TNF-α及IL-1β時(shí)，促進(jìn)了下游炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，引起組織損傷[15]。Guo等[16]研究發(fā)現(xiàn)：TNF-α可激活OPG/RANKL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提高間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力，增強(qiáng)堿性磷酸酶（ALP）的活性，提高骨化能力。Fukai等[17]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞大量表達(dá)成骨細(xì)胞特需的基因和骨基質(zhì)，間接減弱破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)。IL-1β還可通過OPG/RANKL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力。本研究進(jìn)一步對(duì)新西蘭實(shí)驗(yàn)兔異位骨化模型組織標(biāo)本中進(jìn)行TNF-α mRNA、IL-1β mRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組TNF-α mRNA、IL-1β mRNA的含量明顯增高，提示創(chuàng)傷后組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)水平上調(diào)是HO形成的重要機(jī)制。TNF-α、IL-1β在HO形成中表達(dá)增高，改變了局部組織環(huán)境，纖維細(xì)胞異常增生，OPG 合成增加及OPG/RANKL比值增加，從而抑制了破骨細(xì)胞的分化和活性，使成骨活動(dòng)得到增強(qiáng)，鈣質(zhì)沉積和新骨形成增加，最終導(dǎo)致異位骨化的形成。

目前臨床上應(yīng)用非甾體類藥物通過抑制環(huán)氧化酶達(dá)到預(yù)防異位骨化的目的，但確切作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究[18]。帕瑞昔布是首個(gè)可肌肉注射或靜脈滴注的選擇性COX-2抑制劑，對(duì)COX-2的抑制強(qiáng)度是COX-1的2.8萬倍[19]。隨著帕瑞昔布鈉的廣泛應(yīng)用，其生理病理學(xué)和藥理學(xué)的作用越來越受到關(guān)注，特別是帕瑞昔布鈉對(duì)骨代謝的作用成為近年來的研究熱點(diǎn)[20]。從本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果看，中、高劑量帕瑞昔布可明顯降低創(chuàng)傷后異位骨化組織中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA及OPG蛋白的表達(dá)，并且下調(diào)OPG/RANKL比值，隨著劑量的增加，降低程度越明顯。其可能的作用機(jī)制為：帕瑞昔布鈉靜脈注射后迅速水解為高選擇性C0X-2抑制劑伐地昔布，抑制環(huán)氧化酶-2阻止炎癥反應(yīng)，抑制花生四烯酸釋放，進(jìn)一步降低PGE表達(dá)，減少炎性因子TNF-α、IL-1β的釋放，顯著抑制OPG的表達(dá)，OPG/RANKL的比值顯著降低，抑制成骨細(xì)胞活性及分化，鈣質(zhì)沉積和新骨形成減少，最終抑制異位骨化的形成。

基于以上實(shí)驗(yàn)研究，我們認(rèn)為創(chuàng)傷后局部炎癥因子TNF-α、IL-1β的釋放及OPG/RANKL信號(hào)通路的激活可能是創(chuàng)傷后異位骨化形成的重要因素，選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑帕瑞昔布能夠明顯減輕創(chuàng)傷后局部炎癥反應(yīng)，抑制OPG/RANKL信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而抑制成骨細(xì)胞的分化和活化，進(jìn)而抑制異位骨化形成，與傳統(tǒng)的非甾體類藥物比較具有高效能、高安全性及不良反應(yīng)少的優(yōu)勢(shì)。對(duì)預(yù)防異位骨化具有積極重要的意義，同時(shí)也為臨床上開發(fā)藥物提出新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2018-01-19）