環(huán)境DNA(eDNA)宏條形碼技術(shù)對枝角類浮游動物物種鑒定及其生物量監(jiān)測研究

孫晶瑩，楊江華，張效偉

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，基于環(huán)境DNA(eDNA)序列解析混合樣本或環(huán)境介質(zhì)物種組成的eDNA宏條形碼(eDNA Metabarcoding)技術(shù)[1]被逐漸應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域，如微生物多樣性分析、罕見種和入侵物種監(jiān)測、浮游植物[2]、水生動植物生物多樣性分析、食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)重建等[3-5]研究。目前，eDNA宏條形碼研究多集中在物種識別和物種多樣性分析，關(guān)于其對物種定量關(guān)系的研究相對較少，這也為該技術(shù)在實際環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用帶來困難。

浮游動物是水生生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，作為生物標(biāo)志物能很好地指示水環(huán)境質(zhì)量[6-7]，如龜甲輪蟲(Keratellasp.)、臂尾輪蟲(Brachionussp.)、秀體溞(Diaphanosomasp.)、擬裸腹溞(Moinodaphniasp.)等可以作為水體富營養(yǎng)化的指示生物[7]。2017年，有研究首次建立了太湖流域浮游動物條形碼數(shù)據(jù)庫[8]，并開發(fā)了基于eDNA的物種識別和高通量生物監(jiān)測技術(shù)用于太湖流域浮游動物多樣性研究，而且發(fā)現(xiàn)eDNA宏條形碼技術(shù)能夠顯著提高浮游動物物種識別能力和簡化浮游動物多樣性分析[4,9-14]。盡管這上述研究發(fā)現(xiàn)浮游動物生物量與序列數(shù)之間存在一定線性關(guān)系，并提出可用物種序列數(shù)評估物種豐度，但在eDNA宏條形碼技術(shù)對物種定量的準(zhǔn)確性方面并未做深入探討，浮游動物eDNA宏條形碼技術(shù)的定量體系仍然不夠完善。

傳統(tǒng)水生生物學(xué)研究中，大多通過人工鑒別物種多樣性和生物量來反映物種豐度。盡管傳統(tǒng)定量方法簡單，但其未考慮物種個體差異，并且需要專業(yè)的物種鑒定人員、耗時耗力[9-10]。eDNA宏條形碼是對eDNA的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，通過高通量測序進(jìn)行序列識別[15]，其基本檢測單位為eDNA[16]，這與傳統(tǒng)以生物個體數(shù)為直接觀測單位進(jìn)行定量分析差異巨大，如何采用eDNA定量監(jiān)測不同物種的豐度問題尚未得到徹底解決。雖然eDNA宏條形碼和熒光定量PCR(Quantitative PCR, qPCR)[17-18]均通過檢測物種DNA濃度反映物種多度，充分考慮了物種個體差異(尤其是幼體和成體的區(qū)別)，理論上提供了更加準(zhǔn)確的物種定量結(jié)果，但是eDNA宏條形碼多采用通用引物擴(kuò)增環(huán)境中的多個物種，并在PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行集中測序，沒有對PCR過程進(jìn)行連續(xù)檢測，其定量結(jié)果的可靠性還有待研究(表1)。eDNA宏條形碼技術(shù)定量研究的缺乏，也極大的限制了該技術(shù)在實際環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用。

本研究以太湖流域常見浮游動物擬同形溞(Daphniasimiloides)、大型溞(Daphniamagna)、蚤狀溞(Daphniapulex)、多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)、老年低額溞(Simocephalusvetulus)為研究對象，通過浮游動物不同個體數(shù)混合和研究qPCR和eDNA宏條形碼技術(shù)對浮游動物定量準(zhǔn)確性，提出基于eDNA 宏條形碼技術(shù)的浮游動物物種定量體系。主要分以下四方面進(jìn)行研究：(1) eDNA宏條形碼通用引物和qPCR物種特異性引物設(shè)計和選擇；(2) qPCR物種定量標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建；(3) 用eDNA宏條形碼方法定量物種相對豐度驗證；(4) eDNA宏條形碼物種相對豐度定量與qPCR物種定量結(jié)果的比較。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗對象

實驗采用的5種浮游動物，大型溞(D.magna)、擬同形溞(D.similoides)、蚤狀溞(D.pulex)、多刺裸腹溞(M.macrocopa)、老年低額溞(S.vetulus)分離自太湖流域，并在實驗室馴化培養(yǎng)超過1年，培養(yǎng)于pH為7.8～8.3的曝氣水中，每周換水3次，投喂密度為6×106～8×106cells·mL-1的斜生柵藻。食物培養(yǎng)方法：在滅菌的BG11培養(yǎng)液中接入斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)，曝氣培養(yǎng)3～4 d，離心濃縮。

表2 qPCR引物設(shè)計Table 2 The primer for qPCR

注：物種特異性引物名稱對應(yīng)物種，即大型溞，COI.DM；蚤狀溞，COI.DP；擬同形溞，COI.DS；多刺裸腹溞，COI.M；老年低額溞，COI.SV。Tm表示引物退火溫度。

Note： species-specific primers correspond to species names.Daphniamagna, COI.DM;Daphniapulex, COI.DP;Daphniasimiloides, COI.DS;Moinamacrocopa, COI.M;Simocephalusvetulus, COI.SV. Tm stands for melting temperature.

圖1 eDNA宏條形碼技術(shù)對浮游動物物種定量檢測Fig. 1 Quantitative monitoring of zooplankton species with eDNA metabarcoding technology

1.2 研究方法

利用通用Folmer引物[19]擴(kuò)增出大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞、老年低額溞、擬同形溞COI片段，并將PCR產(chǎn)物克隆到pEASY?-T3(TransGen Biotech)中，構(gòu)建qPCR標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。同時利用COI片段設(shè)計qPCR特異性引物和eDNA宏條形碼通用引物(表2)。5種枝角類分別按照固定個體數(shù)量混合，然后分別用qPCR和eDNA宏條形碼技術(shù)進(jìn)行物種定量分析(圖1)。

1.2.1 單物種DNA提取

使用E.A.N.A.?Tissue DNA Kit(OMEGA)試劑盒提取單物種DNA，具體操作如下：用無菌無酶吸管挑取10只生物個體，將水吸干，加入200 μL TL Buffer、25 μL OB Protease Solution渦旋混勻，55 ℃水浴裂解約3 h，每20～30 min拿出渦旋；13 000×g離心5 min取上清；加220 μL BL Buffer渦旋混勻，70 ℃孵育10 min；加220 μL無水乙醇后過HiBind?DNA Mini柱富集DNA；分別加500 μL HBC Buffer和700 μL DNA Wash Buffer清洗DNA，重復(fù)2次后用100 μL Elution Buffer洗脫；用Qubit 2.0測定DNA濃度。

1.2.2 混合物種DNA提取

5種枝角類按照表3進(jìn)行混合，共7個處理組，大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞、老年低額溞在每個處理組間生物個體數(shù)不變，均為5只，擬同形溞在7個處理組間不斷增加1～320只，每個處理組設(shè)置3個重復(fù)。

混合浮游動物使用MO BIO PowerWater?DNA Isolation Kit (QIGEN)進(jìn)行DNA提取。具體操作如下：將濾膜放入5 mL PowerWater?Bead離心管中加1 mL 55 ℃預(yù)熱的裂解液，用MO BIO Votex Adapter 13000-V1-15混勻裂解10 min，離心取上清。后續(xù)提取步驟與單物種提DNA方法相似：去雜質(zhì)，清洗DNA，洗脫。用Qubit 2.0(Thermo Fisher Scientific, USA)進(jìn)行DNA濃度測定。

1.2.3 引物設(shè)計

用Folmer引物[19-20](表2)分別對5個不同枝角類物種的DNA進(jìn)行線粒體COI區(qū)域擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系：總體積50 μL，包含Transtaq SuperMix (TransGen Biotech) 25 μL，ddH2O 21 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL；擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s。用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行條帶檢測，用MicroElute DNA Clean Up Kit (OMEGA)純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序(南京金斯瑞)，獲得5個物種的標(biāo)準(zhǔn)COI片段。用Primer premier 6設(shè)計物種qPCR特異性引物(表2)，每對引物均獲得單一清晰的特異性條帶。使用VECTOR NTI軟件進(jìn)行序列比對，根據(jù)兼并引物設(shè)計原則進(jìn)行通用引物設(shè)計(表2)。

1.2.4 浮游動物實時熒光qPCR定量

將Folmer引物擴(kuò)增的5個物種標(biāo)準(zhǔn)COI片段的特異性序列導(dǎo)入pEASY?-T3載體，構(gòu)建5個物種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。操作步驟：將準(zhǔn)備好的PCR產(chǎn)物和T3克隆載體輕輕混勻后置于冰上進(jìn)行載體連接約5～10 min；然后將插入標(biāo)準(zhǔn)COI片段的T3載體導(dǎo)入Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，輕彈混勻冰浴進(jìn)行轉(zhuǎn)化；均勻涂布在LB培養(yǎng)基板上，過夜培養(yǎng)。挑選陽性克隆到50 mL無菌LB培養(yǎng)基中搖菌6 h，EasyPure Plasmid MiniPrep Kit (TransGen Biotech)提取質(zhì)粒DNA，分別用物種特異性引物和M13引物(表2)擴(kuò)增檢測。用Qubit 2.0進(jìn)行質(zhì)粒DNA定量，每個物種的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍間隔向下稀釋5個數(shù)量級。

qPCR(三步法)實驗反應(yīng)體系20 μL：TranStart Top Green qPCR Supermix (TransGen Biotech) 10 μL，ddH2O 7.8 μL，COI特異性引物0.4 μL，DNA模板1 μL，Passive Reference Dye 0.4 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，40個循環(huán)(94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s)，信號采集設(shè)置在退火步驟，采集時間31 s。

根據(jù)DNA濃度及計算公式計算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)(見1.4)。將稀釋的5個質(zhì)粒DNA樣品所得CT值與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后拷貝數(shù)(log10轉(zhuǎn)化)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每個樣品拷貝數(shù)，每個樣品3個重復(fù)。

1.2.5 eDNA宏條形碼分析

在通用引物前加上8個堿基短序列來區(qū)分不同處理組(表4)。PCR反應(yīng)體系共50 μL，包括Phusion酶0.5 μL，ddH2O 31.5 μL，HF Buffer 10 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL。擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性30 s，35個循環(huán)反應(yīng)，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，E.Z.N.A.TME-Z 96×5 Cycle-Pure Kit (OMEGA)試劑盒純化樣品，Qubit 2.0進(jìn)行DNA濃度檢測，各樣品按50 ng等量混合構(gòu)建DNA文庫。取混合DNA 100 μL再一次純化(Agencourt AMPure XP kit, Becman Coulter)，用Ion Plus Fragment Library Kit (Life Technoloiges)試劑盒構(gòu)建DNA文庫，Agilent 2100檢測DNA文庫質(zhì)量，稀釋DNA文庫至100 pmol·L-1用Ion torrent OT2 200 Kit(Life Technoloiges)試劑盒將測序文庫連接到Ion Sphere Particles(ISPs)表面，用Ion torrent PGM(Life Technoloiges, USA)測序儀進(jìn)行測序。

表3 混合樣品中物種個體數(shù)和擬同形溞占比Table 3 The number of species in multi-species samples and the proportion of Daphnia similoides

1.3 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)計算公式：

Copies = [(6.02×1023)×C/(L×660)]×V

(1)

Copies為拷貝數(shù)；C為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA濃度，單位ng·μL-1；L為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA長度，單位bp；V為實時熒光qPCR體系中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA體積。

測序數(shù)據(jù)處理方法：利用Fastx toolkits將FASTQ文件轉(zhuǎn)換成FASTA格式文件和相應(yīng)的質(zhì)控文件；在QIIME(Quantitative Insights into Microbial Ecology)綜合計算平臺下去除Q < 20的低質(zhì)量序列，包括引物錯配和長度小于110 bp大于120 bp的序列，在COI313引物組去除長度小于250 bp的序列和引物錯配序列。使用UCHIME程序識別并去除嵌合子；利用基于UPARSE算法的USEARCH計算OTUs(Operational Taxonomic Units)，并用SAP(Statistical Assignment Package)進(jìn)行基于NCBI核酸數(shù)據(jù)庫的OTUs序列注釋。以上測序數(shù)據(jù)處理均在Linux系統(tǒng)下操作完成。形成注釋的OTUs文件后用R語言進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法：qPCR和eDNA宏條形碼2種定量方法的計量單位不同，結(jié)果比較需標(biāo)準(zhǔn)化。用“Hellinger”轉(zhuǎn)化方法將qPCR物種拷貝數(shù)與eDNA宏條形碼物種序列數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。SPSS 22.0進(jìn)行線性回歸分析，相關(guān)回歸圖形在Tableau和GraphPad Prism 5軟件中繪制。

2 結(jié)果(Results)

2.1 qPCR物種特異性引物與eDNA宏條形碼引物

圖2 4對通用引物瓊脂糖凝膠電泳測試圖，5個物種簡稱見表2附注，Ladder為100 bp。Fig. 2 The chart of 4 pairs of universal primer agarose gel electrophoresis test. The short names of 5 species referred to table 3 note, ladder is 100 bp.

序號No.Barcode序列Barcode sequence序號No.Barcode序列Barcode sequence1AGATGCAG12AGCTGCTG2AGATGCTC13ATCAGATC3AGCAGAGC14ATCAGCTG4AGCAGATG15ATCATCAG5AGCAGCAG16ATCATCTC6AGCAGCTC17ATCTCATC7AGCATCTG18ATCTCTGC8AGCATGAG19ATCTGAGC9AGCTCAGC20ATCTGATG10AGCTCATG21ATCTGCAG11AGCTGATC

圖3 eDNA宏條形碼通用引物COI116和COI313在物種識別上結(jié)果對比注：左COI.116(COI116)引物可以將5個物種同時檢測出，而右COI.313(COI313)引物不能檢測出蚤狀溞。Fig. 3 The differences in species identification of universal primer COI116 and COI313 for eDNA metabarcoding technologyNote: the left primer COI.116 (COI116) identify 5 species at the same time; the right one can not identify D. pulex.

圖4 物種拷貝數(shù)與個體數(shù)占比間的關(guān)系注：A圖表示擬同形溞在DR1～DR7組中個體數(shù)占比與其拷貝數(shù)相關(guān)性，包括擬合曲線和95%置信區(qū)間；B圖表示其他4個物種在DR1～DR7組間拷貝數(shù)的變化。Fig. 4 The relationship between species copies and the proportion of species individualsNote: (A) the correlation of Daphnia similoides copies and proportion of individuals among DR1-DR7 treatment, including fitting curve and 95% confidence interval; (B) The change of the other 4 species copies among DR1-DR7 treatment.

短COI116較符合eDNA宏條形碼通用引物篩選標(biāo)準(zhǔn)。5個物種特異性引物PCR產(chǎn)物長度分別為大型溞166 bp，蚤狀溞117 bp，擬同形溞152 bp，多刺裸腹溞111 bp，老年低額溞250 bp。共設(shè)計出4對通用引物，分別對5個物種DNA進(jìn)行PCR測試，引物3即COI116(表2)可以同時擴(kuò)增出5個物種，且PCR產(chǎn)物長度、凝膠電泳條帶清晰單一，為最符合條件的引物對(圖2)。因此選用COI116引物進(jìn)行eDNA宏條形碼定量后續(xù)引物測試。

通用引物COI116和COI313[4,8,11]在5個物種檢測結(jié)果中存在明顯差異(圖3)。隨機(jī)將5個物種DNA與南大校內(nèi)池塘eDNA混合在一起作為引物測試標(biāo)準(zhǔn)樣品，結(jié)果表明，COI116引物擴(kuò)增目的條帶長116 bp，能同時檢測出5個物種，且擴(kuò)增產(chǎn)物中不包含這5個物種外的其他物種序列；COI313引物擴(kuò)增目的條帶長313 bp，能同時檢測出4個物種，無法檢測出蚤狀溞，而且對裸腹溞的檢測率差，但能夠檢測出樣品中包含的其他物種。COI116更加適合進(jìn)行eDNA宏條形碼定量研究。

2.2 qPCR方法對多物種混合樣品中單物種的定量分析

構(gòu)建的5個物種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒長度和濃度分別為：大型溞質(zhì)粒長度3 205 bp，質(zhì)粒DNA濃度13.9 ng·μL-1；擬同形溞質(zhì)粒長度3 191 bp，質(zhì)粒DNA濃度22 ng·μL-1；蚤狀溞質(zhì)粒長度3 156 bp，質(zhì)粒DNA濃度17.5 ng·μL-1；多刺裸腹溞質(zhì)粒長度3 150 bp，質(zhì)粒DNA濃度13.5 ng·μL-1；老年低額溞質(zhì)粒長度3 289 bp，質(zhì)粒DNA濃度16.6 ng·μL-1。

qPCR物種拷貝數(shù)與個體數(shù)相對比例變化呈顯著正相關(guān)。相對比例變化的擬同形溞在不同處理組間標(biāo)準(zhǔn)化拷貝數(shù)變化與其個體數(shù)占比線性回歸(圖4A)，擬同形溞標(biāo)準(zhǔn)化拷貝數(shù)隨著其在DR1-DR7處理組個體數(shù)占比增加而明顯增加。占比由0.27增加至0.98，增加了0.71，拷貝數(shù)與物種占比間存在顯著相關(guān)性(R2=0.929,P<0.0001)；而大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞和老年低額溞雖然在7個處理組間個體數(shù)目未發(fā)生變化，但相對占比不斷減小，4個物種標(biāo)準(zhǔn)化拷貝數(shù)值總和隨著個體占比的減小而顯著減少，由1.69降至0.30，降低了1.39(圖4B)。5個物種拷貝數(shù)均與個體數(shù)相對比例變化呈相同趨勢變化。

2.3 eDNA宏條形碼對混合物種的定量分析結(jié)果

eDNA宏條形碼定量分析的序列數(shù)與物種個體數(shù)相對占比呈一致性變化趨勢。COI116引物高通量測序結(jié)果按錯配堿基數(shù)小于3個，最低相似度為95.69%，共篩選出DNA序列27 069條(110～120 bp)，聚類23個OTUs，其中大型溞OTUs 6個，蚤狀溞1個，擬同形溞4個，老年低額溞3個，多刺裸腹溞9個。在DR1-DR7處理組間，eDNA宏條形碼所獲得的擬同形溞標(biāo)準(zhǔn)化序列數(shù)由0.17增加至0.69，增加了0.52，標(biāo)準(zhǔn)化序列數(shù)與相對比例呈顯著正相關(guān)(R2=0.885,P<0.0001)(圖5A)；大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞、老年低額溞4個物種標(biāo)準(zhǔn)化后序列數(shù)由1.74降為1.30，下降了0.44，標(biāo)準(zhǔn)化后序列數(shù)隨DR1-DR7組間物種相對比例減少而減少(圖5B)。高通量分析序列數(shù)與物種相對比例間的關(guān)系和qPCR物種拷貝數(shù)與物種相對占比的關(guān)系呈現(xiàn)一致性變化趨勢。

圖5 物種序列數(shù)與個體數(shù)占比間的關(guān)系注：A圖表示擬同形溞在DR1～DR7組中個體數(shù)占比與其序列數(shù)相關(guān)性，包括擬合曲線和95%置信區(qū)間；B圖表示其他4個物種在DR1～DR7組間序列數(shù)的變化。Fig. 5 The relationship between species sequences and the proportion of species individualsNote: (A) the correlation of Daphnia similoides sequences and proportion of individuals among treatment DR1-DR7, including fitting curve and 95% confidence interval; (B) The change of the other 4 species sequences among treatment DR1-DR7.

圖6 DR1～DR7處理組間擬同形溞拷貝數(shù)與序列數(shù)相關(guān)性Fig. 6 The correlation between Daphnia similoides copies and sequences among treatment DR1-DR7

2.4 qPCR & eDNA宏條形碼單物種定量比較分析

擬同形溞拷貝數(shù)與物種序列數(shù)變化呈顯著正相關(guān)，且均隨物種相對占比增加而增加。其個體數(shù)占比由4.76%增加至94.12%，標(biāo)準(zhǔn)化后物種拷貝數(shù)值隨個體占比約增加了0.71；標(biāo)準(zhǔn)化序列數(shù)值隨其個體數(shù)所占比例約增加了0.52。將標(biāo)準(zhǔn)化拷貝數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)化后的序列數(shù)進(jìn)行線性回歸(圖6)，擬同形溞從DR1組到DR7組，序列數(shù)與擬同形溞拷貝數(shù)變化趨勢一致，呈顯著正相關(guān)(R2= 0.767，P<0.0001)。大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞、老年低額溞4個物種標(biāo)準(zhǔn)化拷貝數(shù)值由DR1到DR7處理組降低了1.39，4個物種標(biāo)準(zhǔn)化序列數(shù)值由DR1到DR7處理組降低了0.44，拷貝數(shù)與序列數(shù)下降幅度不同，但是均呈現(xiàn)均勻下降趨勢。物種序列數(shù)變化與物種拷貝數(shù)趨勢一致，能夠反映物種拷貝數(shù)變化。

3 討論(Discussion)

3.1 引物偏好性對eDNA宏條形碼物種監(jiān)測、定量的影響

eDNA宏條形碼技術(shù)的定量檢測受PCR引物的偏好性影響。目前應(yīng)用于浮游動物監(jiān)測的通用引物有基于線粒體的16S rDNA[21]、COI、12S rDNA標(biāo)志基因[22-23]，基于細(xì)胞核的18S rDNA[24]、rRNA[25]和28S rDNA[26]的標(biāo)志基因。通用引物在設(shè)計時為了能同時擴(kuò)增出盡可能多的物種，簡并度較高，也導(dǎo)致引物對物種的擴(kuò)增能力存在較大差異。COI313引物是目前浮游動物宏條形碼研究最常用的引物之一[4]，具有較好的物種覆蓋度和辨識度。利用通用引物進(jìn)行混合物種DNA擴(kuò)增，通常會導(dǎo)致較大的物種擴(kuò)增效率差異[27]，有研究建議在物種監(jiān)測中不同生物類群使用不同引物[28]。其他研究也發(fā)現(xiàn)樣品重復(fù)間的引物偏差較小，而不同COI引物組間物種序列數(shù)差異較大[3]。在本研究中，COI313引物能夠在單物種測試中成功擴(kuò)增出5種枝角類的COI序列，但是，當(dāng)將5種枝角類的DNA混合在一起時，COI313引物僅能擴(kuò)增出4種浮游動物，無法擴(kuò)增出蚤狀溞，而我們根據(jù)5個物種的COI序列設(shè)計的COI116引物能夠同時擴(kuò)增出5個物種。這說明COI313引物存在明顯物種偏好性，盡管其被廣泛應(yīng)用于生物多樣性評價研究中，但是無法對多物種進(jìn)行定量檢測。為驗證宏條形碼定量檢測能力而設(shè)計的COI116引物雖然可以同時擴(kuò)增出5種枝角類，能夠用于枝角類多樣性監(jiān)測和定量分析，但是其在其他群落中普適性有待進(jìn)一步研究。綜上，eDNA宏條形碼引物在監(jiān)測、定量過程中存在較大偏好性，需根據(jù)研究目的篩選合適的引物。

3.2 qPCR與eDNA宏條形碼對浮游動物多物種定量的比較

eDNA宏條形碼定量結(jié)果與qPCR定量結(jié)果一致，eDNA宏條形碼技術(shù)可實現(xiàn)浮游動物群落半定量監(jiān)測。qPCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因定量，也能根據(jù)標(biāo)記基因?qū)ξ锓N定量[17,29]，其優(yōu)勢在于可以進(jìn)行DNA拷貝數(shù)的絕對定量[30-31]，已成為DNA定量的金標(biāo)準(zhǔn)。常用的eDNA宏條形碼物種定量研究是基于有機(jī)體的生物量與DNA的正比關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)物種序列與物種生物量、DNA濃度呈正比關(guān)系[3,32-33]，而以生物豐度為單位的eDNA宏條形碼研究很少且定量體系不夠成熟。

eDNA宏條形碼定量監(jiān)測能用于研究浮游動物物種相對豐度的變化。本研究通過對混合樣品中各物種豐度同時進(jìn)行qPCR定量和eDNA宏條形碼定量，比較qPCR拷貝數(shù)和eDNA宏條形碼序列數(shù)的關(guān)系，驗證eDNA宏條形碼定量的準(zhǔn)確性，從而構(gòu)建基于eDNA宏條形碼技術(shù)的浮游動物物種定量體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個浮游動物物種拷貝數(shù)與個體數(shù)占比呈現(xiàn)一致性趨勢變化(R2=0.929,P<0.0001)，這表明qPCR拷貝數(shù)能夠反映物種相對豐度變化趨勢，可作為衡量eDNA宏條形碼定量準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)。eDNA宏條形碼序列數(shù)與混合物種個體占比呈明顯正相關(guān)(R2=0.885,P<0.0001)，表明eDNA宏條形碼序列數(shù)變化能夠反映浮游動物類群中物種的豐度變化。將eDNA宏條形碼定量獲得的序列數(shù)與同處理組qPCR定量拷貝數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)物種序列數(shù)與拷貝數(shù)隨物種個體數(shù)所占比例變化呈現(xiàn)顯著的一致性變化(R2= 0.767,P<0.0001)。物種拷貝數(shù)與序列數(shù)下降幅度有顯著差異，主要原因可能是2種方法的定量單位不同而導(dǎo)致的通量不同，對研究結(jié)果無明顯影響。綜上所述，eDNA宏條形碼可用來研究浮游動物物種相對豐度的變化。

3.3 eDNA宏條形碼技術(shù)的半定量監(jiān)測

eDNA宏條形碼技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)浮游動物物種半定量監(jiān)測。qPCR通過連續(xù)檢測PCR過程中PCR產(chǎn)物的含量，進(jìn)而準(zhǔn)確計算模板DNA濃度。而eDNA宏條形碼技術(shù)僅僅在PCR結(jié)束后進(jìn)行測序，最終獲得的是DNA產(chǎn)物的序列數(shù)，并沒有連續(xù)檢測PCR擴(kuò)增過程，因此僅能對模板DNA進(jìn)行半定量檢測，進(jìn)而實現(xiàn)對物種生物量的半定量監(jiān)測。

綜上，在選擇適合的引物基礎(chǔ)上，eDNA宏條形碼技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)浮游動物的半定量檢測。本研究通過對5種浮游動物混合樣品中各物種豐度進(jìn)行qPCR和eDNA宏條形碼的定量分析，評估了eDNA宏條形碼定量的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，eDNA宏條形碼引物通常存在較大的偏好性，選擇適合的引物可識別生態(tài)群落中不同的物種。同時，eDNA宏條形碼與qPCR定量檢測均與物種個體數(shù)相對比例變化存在較強(qiáng)的一致性，能夠反映物種豐度變化。該研究為eDNA宏條形碼技術(shù)在浮游動物多樣性監(jiān)測和生物完整性評價中的應(yīng)用提供依據(jù)。