納米四氧化三鐵吸附水中六價(jià)鉻后的復(fù)合物對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性研究

李專，劉淼，陳明輝，張竹青

1. 吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，長春130012 2. 吉林省環(huán)境監(jiān)測中心站，長春130011

隨著現(xiàn)代社會(huì)經(jīng)濟(jì)和技術(shù)的快速發(fā)展，水體污染日益嚴(yán)重，已經(jīng)成為威脅和制約人類健康和發(fā)展的重要因素。重金屬污染由于具有潛在性、持久性和富集性，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康會(huì)產(chǎn)生廣泛和嚴(yán)重的危害。其中，鉻作為一種重要的工業(yè)原料，被廣泛地應(yīng)用于冶金、電鍍、染料、皮革制造等行業(yè)[1]，每年的含鉻廢物排放量高達(dá)4 080萬噸，它會(huì)以各種化學(xué)形態(tài)存在于空氣、水和土壤中，危害人們的健康并對(duì)區(qū)域生態(tài)體系造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。傳統(tǒng)用于去除鉻的方法有化學(xué)沉淀、離子交換、膜分離和生物絮凝等方法[2-4]，但是這些方法操作繁瑣、成本高、效率低和且容易造成二次污染。

近年來，磁性納米四氧化三鐵作為一種新型材料越來越受到各國學(xué)者的廣泛關(guān)注，它不僅具備常規(guī)納米材料的比表面積大、反應(yīng)活性高等優(yōu)點(diǎn)[5-8]，同時(shí)結(jié)合了四氧化三鐵的磁性特征，使重金屬的回收利用能夠得以簡單的實(shí)現(xiàn)[9]。因此，這種高效、經(jīng)濟(jì)的方法在污水治理行業(yè)中已被迅速地產(chǎn)業(yè)化。

雖然納米材料的應(yīng)用范圍十分廣泛，但是關(guān)于它們對(duì)生物和環(huán)境的毒性研究并不十分豐富，特別是，納米粒子對(duì)污染物的吸附改變了納米粒子和污染物各自的性質(zhì)方面。因此，它們的復(fù)合物的對(duì)人類和生態(tài)系統(tǒng)的毒性可能和單獨(dú)的污染物和納米粒子的毒性有所不同。例如，相比于三丁基錫單獨(dú)作用，三丁基錫/納米TiO2復(fù)合物對(duì)鮑魚胚胎的毒性更大[10]。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)納米二氧化鈦相比，二氧化鈦和葡萄糖聯(lián)合對(duì)小鼠的毒性明顯增大。Wang等[12]曾研究過，由于維生素C加速了ZnO納米粒子的溶解和Zn離子的吸收，維生素C和納米ZnO顆粒的復(fù)合物對(duì)上皮細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的毒性明顯增大。因?yàn)閰f(xié)同或抑制效應(yīng)，直接或間接機(jī)制都可以增強(qiáng)或抑制污染物的毒性，因此，納米粒子和污染物的復(fù)合物的生物毒性需要謹(jǐn)慎的評(píng)價(jià)。近年來，有不少關(guān)于納米粒子毒性的研究。然而，很少有對(duì)納米顆粒/污染物復(fù)合物的毒性研究。實(shí)際上，納米顆粒存在于任何地方，并且總是以與環(huán)境污染物的復(fù)合物形式存在。單個(gè)有毒的物質(zhì)在和納米顆粒聯(lián)合后，往往會(huì)出現(xiàn)一些不可預(yù)知的變化，可能會(huì)產(chǎn)生加和、協(xié)同或是拮抗作用[13]，研究納米顆粒/污染物復(fù)合物的毒性效應(yīng)，對(duì)于評(píng)價(jià)和預(yù)警可能導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有十分重要的意義。

本項(xiàng)研究中，使用納米四氧化三鐵(MNPs)吸附水中的鉻離子，由于鉻能夠特異性地引起腎損傷[14]，本實(shí)驗(yàn)選用人胚胎腎細(xì)胞HEK293作為生物模型，通過測定細(xì)胞活力、活性氧含量和細(xì)胞攝取量等，評(píng)估MNPs/Cr(VI)復(fù)合物對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

磁性納米四氧化三鐵(球形，99.0%)購自阿拉丁公司，人胚胎腎細(xì)胞系HEK293購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，DMEM培養(yǎng)基購自康寧公司(Manassas, VA, USA)，胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司(Grand Island, NY, USA)。其他試劑均為分析純，購自北京化工制藥廠。

表1 實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)Table 1 Experimental group design

注：MNPs表示納米四氧化三鐵。

Note： MNPs stand for magnetite Fe3O4nanoparticles.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)選取了人胚胎腎細(xì)胞HEK293作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其為貼壁細(xì)胞，將其培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(FBS)、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的改良的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。

將濃度為500 mg·L-1重鉻酸鉀的儲(chǔ)備液分別稀釋至0、10、20和30 mg·L-1，用磁性納米四氧化三鐵分別吸附上述濃度的重鉻酸鉀溶液。吸附實(shí)驗(yàn)是通過適量的MNPs(4 g·L-1)與Cr(VI)溶液混合，在50 mL離心管中，用0.1 mol·L-1的HNO3和NaOH溶液調(diào)整pH，25 ℃下，150 r·min-1震蕩4 h后，用超強(qiáng)磁鐵進(jìn)行分離，棄上清液，用去離子水將沉淀清洗2～3遍，真空干燥，制得粉末狀的含有不同Cr(VI)含量的MNPs/Cr(VI)復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度請(qǐng)見表1。

取對(duì)數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，加入1.8 mL新鮮的培養(yǎng)基和0.2 mL的不同濃度的Cr(VI)溶液、MNPs及MNPs/Cr(VI)溶液，染毒時(shí)間為24 h。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 吸附實(shí)驗(yàn)

將濃度為500 mg·L-1重鉻酸鉀的儲(chǔ)備液分別稀釋至0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 mg·L-1，吸附實(shí)驗(yàn)步驟同上(1.2)，吸附后用超強(qiáng)磁鐵吸附MNPs，測定上清液中Cr(VI)含量，Cr(VI)離子的殘留液濃度用二苯碳酰二肼分光光度法測定。所有的實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度為(25±1) ℃。

1.3.2 表征

利用掃描電子顯微鏡(SEM, FESEM 6700F, JEOL, Japan)表征MNPs和MNPs/Cr(Ⅵ)復(fù)合物的形貌及粒徑。使用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS, Nano ZS90, Malvern, UK)檢測MNPs和MNPs/Cr(Ⅵ)復(fù)合物的流體動(dòng)力學(xué)大小，使用DLS分析之前樣品需要先超聲處理。利用X射線衍射儀(XRD, Bruker D8, Germany)進(jìn)行樣品掃描，表征其晶相組成和晶化程度，通過特定衍射峰確定物質(zhì)的形態(tài)。

1.3.3 細(xì)胞活力

細(xì)胞暴露于各染毒組后，利用帶相差的倒置光學(xué)顯微鏡(Leica, DMI3000B, Germany)觀察各組細(xì)胞的形態(tài)，并選取典型成像記錄，放大倍數(shù)為200倍。利用WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(碧云天，中國)測定細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)步驟按說明書操作。

1.3.4 活性氧含量測定

活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一種通過測量熒光探針DCFH -DA水平，測定細(xì)胞內(nèi)ROS含量試劑盒。將細(xì)胞暴露于各染毒組后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入1 mL稀釋好的DCFH-DA溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，用PBS洗滌3次，收集細(xì)胞，用熒光分光光度計(jì)檢測。具體實(shí)驗(yàn)步驟見說明書(南京建成生物工程研究所)。

1.3.5 納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)的攝取

1.3.5.1 定性

將暴露于各染毒組下的HEK293細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，用胰酶消化后，收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1 mL離心管內(nèi)離心10 min(2 000 r·min-1)，然后固定于2.5%戊二醛(4 ℃)，隨后固定于1%鋨酸中1 h，用PBS洗3次，然后用乙醇逐級(jí)脫水并包埋。對(duì)包埋好的細(xì)胞進(jìn)行切片，最后在透射電鏡下觀察拍片(TECNAI G20 TWINW, FEI, USA)。

1.3.5.2 定量

將暴露于各染毒組下的HEK293細(xì)胞，分別用PBS洗滌3次，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，3 000 r·min-1離心后，將細(xì)胞沉淀物在3 mL硝酸(HNO3)和1 mL的過氧化氫(H2O2)用超聲波消化。通過ICP-MS(NexION 350X, USA)中測定細(xì)胞中鐵和鉻的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)每組做3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)進(jìn)行表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis )

2.1 吸附實(shí)驗(yàn)

飽和吸附量是通過等溫線計(jì)算得出的。吸附等溫線是指一定溫度下，達(dá)到吸附平衡時(shí)，單位質(zhì)量的吸附劑對(duì)吸附物質(zhì)的吸附量與吸附物質(zhì)的溶液濃度關(guān)系[15]。表征這一平衡有多種數(shù)學(xué)模型，其中Langmuir模型是最常見的表征吸附劑的吸附容量的數(shù)學(xué)模型[15]，如下公式所示。

式中，qe(μg·mg-1)為平衡吸附量；qm(μg·mg-1)為飽和吸附量；Ce(μg·L-1)為吸附平衡時(shí)的濃度；b(L·μg-1)為Langmuir吸附平衡常數(shù)。擬合參數(shù)見表2。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制了納米Fe3O4顆粒對(duì)溶液中Cr(VI)的Langmuir模型等溫吸附曲線(圖1)，并獲得了吸附等溫模型相對(duì)應(yīng)的參數(shù)數(shù)據(jù)，吸附數(shù)據(jù)在Langmuir吸附模型下的相關(guān)系數(shù)(r2=0.999)，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的Cr(VI)濃度范圍內(nèi)，納米Fe3O4顆粒對(duì)溶液中重金屬Cr(VI)離子的吸附類型屬于一種單層的吸附過程，通過等溫吸附曲線，可以計(jì)算出納米Fe3O4顆粒對(duì)Cr(VI)的單層飽和吸附量qm為13.42 mg·g-1(表2)。

圖1 納米Fe3O4顆粒對(duì)Cr(VI)的Langmuir模型等溫吸附曲線注：qe為平衡吸附量；Ce為吸附平衡時(shí)的濃度。Fig. 1 Langmuir model isothermal adsorption curve of Cr(VI) with Fe3O4 nanoparticlesNote: qe stands for the equilibrium adsorption capacity; Ce stands for the equilibrium concentration.

2.2 表征

納米材料的尺寸、形態(tài)及化學(xué)成分是納米毒性研究的重要特征[16]。MNPs和MNPs/Cr(VI)顆粒大小一致，分布均勻，單分散性好，顆粒均呈球形，平均粒徑為10～20 nm。MNPs和MNPs/Cr(VI)在培養(yǎng)基中的流體動(dòng)力學(xué)直徑分別為216 nm、512 nm(表3)。納米顆粒在溶液中的直徑遠(yuǎn)大于干燥時(shí)的直徑，這是由于顆粒在溶液中容易聚團(tuán)導(dǎo)致[17-19]。

利用X射線圖譜分析了納米Fe3O4晶體材料的物相組成(圖2c)。MNPs樣品在2θ為30.1°、35.6°、43.2°、56.9°和62.6°處均具有明顯的特征峰，這些特征峰的位置分別對(duì)應(yīng)Fe3O4反尖晶石結(jié)構(gòu)的(220)晶面、(311)晶面、(400)晶面、(511)晶面以及(440)晶面。通過軟件Jade6.0檢索分析，MNPs樣品的特征峰位置和強(qiáng)度均與JCPDS標(biāo)準(zhǔn)卡片NO.19-0629四氧化三鐵的衍射峰位置相一致，歸屬于反尖晶石結(jié)構(gòu)。與Cr(VI)反應(yīng)后，納米Fe3O4峰強(qiáng)度顯著下降。同時(shí)，在反應(yīng)介質(zhì)中檢測到Fe2O3和(Fe0.6Cr0.4)2O4顆粒。證明了MNPs/Cr(VI)復(fù)合物的形成。

圖2 MNPs和MNPs/Cr(VI)的X射線圖Fig. 2 Characterization of MNPs and MNPs/Cr(VI) adducts by XRD

參數(shù) Parameterqm/(μg·mg-1)b/(L·μg-1)r2數(shù)值 Value13.421.420.999

注：qm表示飽和吸附量；b是Langmuir吸附平衡常數(shù)；r2是模型相關(guān)系數(shù)。

Note：qmstands for the saturated adsorption capacity;bstands for the Langmuir equilibrium constant;r2stands for the correlation coefficient.

表3 MNPs和MNPs/Cr(VI)復(fù)合物的表征Table 3 Characterization of MNPs and MNPs/Cr(VI) adducts

圖4 細(xì)胞活力測定結(jié)果注： *表示與對(duì)照組差異顯著，a、b、c表示MNPs/Cr(Ⅵ)與對(duì)應(yīng)濃度的Cr(VI)組差異顯著，P<0.05。Fig. 4 Cell viability assessment by quantifying mitochondria dehydrogenase activityNote: Significant differences are indicated by * vs control; significant differences are indicated by a, b, c between MNPs/Cr(Ⅵ) group and the corresponding Cr(VI) group without MNPs; P<0.05.

2.3 細(xì)胞活力

利用光學(xué)顯微鏡對(duì)各染毒組處理后的HEK293細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較(圖3)，空白對(duì)照組的細(xì)胞均貼壁生長，形態(tài)飽滿，呈規(guī)則的多角棱形，邊界清晰、排列整齊、大小均一，胞質(zhì)清透，且細(xì)胞密度較大，細(xì)胞間間隙較小。Cr(VI)處理后的細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量有一定程度的降低，并且隨著Cr(VI)濃度的增大，細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)特異性發(fā)生了改變，呈現(xiàn)出胞體發(fā)亮，收縮，逐漸失去貼壁性，有部分漂浮死亡的現(xiàn)象，細(xì)胞密度降低。而且Cr(VI)濃度越高，這些變化越為明顯。相比之下，用MNPs及MNPs/Cr(VI)處理的細(xì)胞和對(duì)照組相比，細(xì)胞表面可觀察到少量的納米顆粒，細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征無顯著差異，細(xì)胞呈單層貼壁成長，形態(tài)呈伸展的多角棱形，細(xì)胞形態(tài)均勻飽滿、排列整齊、細(xì)胞間隙較小，細(xì)胞密度較空白組并未發(fā)生顯著改變，也未發(fā)現(xiàn)大量脫落的懸浮細(xì)胞。只是隨著MNPs/Cr(VI)濃度加大，細(xì)胞表面顏色加深，這可能是由于MNPs及MNPs/Cr(VI)附著于細(xì)胞表面導(dǎo)致。MNPs/Cr(VI)復(fù)合物誘導(dǎo)的毒性遠(yuǎn)低于Cr(VI)。因此，我們推斷，與游離Cr(VI)相比，MNPs/Cr(VI)可能導(dǎo)致的細(xì)胞毒性較小。

為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇通過測定線粒體脫氫酶的活性來確定細(xì)胞的活力。細(xì)胞活力的測定結(jié)果見圖4。和細(xì)胞形態(tài)觀測結(jié)果相似，與對(duì)照組相比，Cr(VI)處理后的細(xì)胞活力濃度依賴性降低，Cr(VI)處理后的各組細(xì)胞活性分別降低至81.2%、73.7%和55.3%。暴露于MNPs下細(xì)胞活力為86.2%，與對(duì)照組相比活性略有下降。暴露于MNPs/Cr(VI)復(fù)合物后的各組細(xì)胞活力分別為85.1%、83.6%和81.4%，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性略有下降；與MNPs組比較，細(xì)胞活性無顯著性差異；與對(duì)應(yīng)濃度Cr(VI)作用的細(xì)胞相比，MNPs/Cr(VI)作用的細(xì)胞活性均顯著升高。同時(shí)，細(xì)胞活性沒有隨著MNPs/Cr(VI)中Cr(VI)濃度的增加而下降；這說明MNPs/Cr(VI)復(fù)合物性質(zhì)比較穩(wěn)定，沒有大量的Cr(VI)溶出。同時(shí)可以推斷，MNPs及MNPs/Cr(VI)復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性影響很小。

2.4 活性氧測定

活性氧含量是納米顆粒誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的最常見評(píng)價(jià)手段之一[20-21]。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后，體內(nèi)的ROS會(huì)明顯上升，過量的ROS會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，產(chǎn)生氧化損傷。結(jié)果顯示(圖5)：和對(duì)照組相比，在Cr(VI)的作用下，細(xì)胞的ROS水平明顯上升，且具有濃度依賴性關(guān)系；與各濃度Cr(VI)組別相比，對(duì)應(yīng)濃度組的MNPs/Cr(VI)復(fù)合物處理后的HEK293細(xì)胞的ROS水平顯著降低。和單獨(dú)MNPs組相比較，各濃度MNPs/Cr(VI)復(fù)合物組的ROS水平?jīng)]有顯著差異。

圖5 各處理組細(xì)胞的ROS活性注： *表示與對(duì)照組差異顯著，a、b、c表示MNPs/Cr(Ⅵ)與對(duì)應(yīng)濃度的Cr(VI)組差異顯著，P<0.05。Fig. 5 ROS generation in HEK293 cells from different treatment groupsNote: Significant differences are indicated by * vs control; significant differences are indicated by a, b, c between MNPs/Cr(Ⅵ) group and the corresponding Cr(VI) group without MNPs; P<0.05.

2.5 納米顆粒在細(xì)胞中的攝取

為了進(jìn)一步評(píng)估細(xì)胞毒性，利用透射電鏡觀察MNPs和MNPs/Cr(VI)復(fù)合物在HEK293細(xì)胞中的整個(gè)內(nèi)化過程(圖6)。由圖6觀察到HEK293細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，僅有極少量的MNPs及MNPs/Cr(VI)顆粒，顆粒位于質(zhì)膜附近的囊泡之中；顆粒沒有出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)和線粒體附近。與空白組比較，Cr(VI)刺激下的細(xì)胞形態(tài)變形，細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞質(zhì)溢出[22]。而MNPs組和MNPs/Cr(VI)組的細(xì)胞形態(tài)基本完整，在亞細(xì)胞水平上沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞損傷。因此推斷，納米顆?？赡苁且苑菗p傷細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的。

圖6 透射電鏡下納米顆粒在HEK293細(xì)胞的定位注： (a) 對(duì)照組；(b) Cr(VI)；(c) MNPs；(e) MNPs/Cr(VI)復(fù)合物；(d)和(f)是(c)和(e)的放大圖。Fig. 6 Electron micrograph of MNPs and MNPs/Cr(VI) adducts before and after uptake into HEK293 cellsNote: TEM images of HEK293 cells from group (a) control, (b) Cr(VI), (c) MNPs, and (e) adducts; (d) and (f) are enlarged from (c) and (e).

為了量化MNPs和MNPs/Cr(VI)在細(xì)胞中的攝取，用ICP-MS測定細(xì)胞內(nèi)的金屬含量。經(jīng)MNPs和MNPs/Cr(VI)復(fù)合物處理后的細(xì)胞，鐵和鉻含量如圖7～8所示，細(xì)胞內(nèi)檢測出的鐵和鉻元素，是細(xì)胞攝取了MNPs和MNPs/Cr(VI)復(fù)合物導(dǎo)致的；與透射電鏡觀察結(jié)果一致，進(jìn)入細(xì)胞的MNPs和各濃度組MNPs/Cr(VI)顆粒分別為總添加量的1.1%、0.65%、0.72%和0.58%，MNPs/Cr(VI)組在細(xì)胞中檢測到的Fe含量較MNPs組更低，說明細(xì)胞對(duì)MNPs/Cr(VI)的攝取量比MNPs組更少。從鉻在細(xì)胞內(nèi)的攝取量的結(jié)果分析，MNPs/Cr(VI)復(fù)合物比較穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)大量的Cr(VI)溶出。

圖7 MNPs和MNPs/Cr(VI)復(fù)合物處理后細(xì)胞內(nèi)的鐵含量注： *表示與對(duì)照組差異顯著，a、b、c表示MNPs/Cr(Ⅵ)與對(duì)應(yīng)濃度的Cr(VI)組差異顯著，P<0.05。Fig. 7 Cell uptake of iron after being treated with MNPs and MNPs/Cr(VI) adductsNote: Significant differences are indicated by * vs control; significant differences are indicated by a, b, c between MNPs/Cr(Ⅵ) group and the corresponding Cr(VI) group without MNPs; P<0.05.

圖8 MNPs和MNPs/Cr(VI)復(fù)合物處理后細(xì)胞內(nèi)的鉻含量注： *表示與對(duì)照組差異顯著，a、b、c表示MNPs/Cr(Ⅵ)與對(duì)應(yīng)濃度的Cr(VI)組差異顯著，P<0.05。Fig. 8 Cell uptake of chromium after being treated with MNPs and MNPs/Cr(VI) adductsNote: Significant differences are indicated by * vs control; significant differences are indicated by a, b, c between MNPs/Cr(Ⅵ) group and the corresponding Cr(VI) group without MNPs; P<0.05.

3 討論(Discussion )

體外毒性評(píng)估是納米毒理學(xué)的重要評(píng)估工具。本研究使用人類胚胎腎細(xì)胞HEK293作為研究對(duì)象，評(píng)估MNPs/Cr(VI)復(fù)合物誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的能力。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：MNPs和MNPs/Cr(VI)復(fù)合物并未導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和密度的顯著改變，在MNPs的吸附下，MNPs/Cr(VI)復(fù)合物顯著改善了Cr(VI)誘導(dǎo)的破壞效應(yīng)。這是Cr(VI)離子累積水平降低所產(chǎn)生的結(jié)果。該結(jié)果同時(shí)證明了MNPs/Cr(VI)復(fù)合物對(duì)HEK293細(xì)胞沒有顯著的細(xì)胞毒性。

氧化應(yīng)激是細(xì)胞毒性最重要的機(jī)理之一[23]。眾所周知，氧化劑會(huì)通過干擾氮代謝來抑制細(xì)胞生長，Cr(VI)是一種強(qiáng)大的氧化劑，能夠與化合物發(fā)生氧化還原反應(yīng)直接產(chǎn)生ROS，同時(shí)也可以與巰基(-SH)結(jié)合，消耗各種抗氧化物(如超氧化物歧化酶SOD，谷胱甘肽GSH等)間接產(chǎn)生ROS，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化損傷[24]。產(chǎn)生的ROS將擾亂氮代謝抑制細(xì)胞生長。細(xì)胞毒性通常是來自顆粒毒性和氧化損傷[25-26]。因此，細(xì)胞活力的降低可能是納米顆粒與代謝中間體(如H2O2或H+)相互作用的結(jié)果[27]。本研究的結(jié)果表明，經(jīng)MNPs處理后，顯著降低了Cr(VI)對(duì)HEK293細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的破壞作用。同時(shí)，MNPs/Cr(VI)復(fù)合物沒有引發(fā)細(xì)胞的氧化損傷。Heike等[28]曾研究過，納米鈀/磁性鐵對(duì)選定的哺乳動(dòng)物和魚細(xì)胞系的活力幾乎沒有產(chǎn)生影響，也沒有引發(fā)氧化損傷，這一研究結(jié)果與本項(xiàng)研究的結(jié)果基本一致。

納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)的攝取與細(xì)胞毒性直接相關(guān)，只有極少的MNPs和MNPs/Cr(VI)復(fù)合物被內(nèi)化，并且這些顆粒都積聚在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并沒有進(jìn)入到細(xì)胞核。大多數(shù)的顆粒都附著在細(xì)胞膜表面，這些顆粒在成像之前很容易被PBS洗掉。納米顆粒通過內(nèi)吞的形式被細(xì)胞吸收，內(nèi)吞作用主要分為3種類型：吞噬作用、吞飲作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。其中最常見的是非特異性途徑的吞飲作用，包括胞飲作用和巨胞飲作用，通常以質(zhì)膜內(nèi)陷形成囊泡，將顆粒物包裹運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)的方式實(shí)現(xiàn)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MNPs，聚集、沉淀、黏附在細(xì)胞周圍的納米顆粒逐漸被細(xì)胞質(zhì)膜包圍、內(nèi)陷，使包有納米顆粒的質(zhì)膜在胞內(nèi)與細(xì)胞膜完全分離，形成質(zhì)膜包被的囊泡，即初級(jí)溶酶體。盡管內(nèi)吞作用的影響因素很多，包括納米顆粒粒徑、濃度、細(xì)胞種類以及數(shù)量等因素，然而納米顆粒的大小，被普遍認(rèn)為是影響細(xì)胞攝取納米顆粒的最主要因素[30-31。由于MNPs/Cr(VI)復(fù)合物的水合粒徑尺寸相對(duì)MNPs較大，當(dāng)細(xì)胞暴露于MNPs/Cr(VI)時(shí)，細(xì)胞膜需要更多努力來啟動(dòng)內(nèi)吞作用。因此，與MNPs相比，MNPs/Cr(VI)復(fù)合物在細(xì)胞中的數(shù)量更少。

由于納米顆粒的定位對(duì)細(xì)胞毒性起著很重要作用，存在于線粒體和細(xì)胞核中的納米材料可能會(huì)對(duì)細(xì)胞正常功能產(chǎn)生干擾。然而，納米材料在細(xì)胞中定位的最常見部位是內(nèi)涵體和溶酶體[32-33]。近年來有不少相關(guān)研究報(bào)道，例如，納米銀顆粒只進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)涵體和溶酶體，其對(duì)細(xì)胞沒有產(chǎn)生明顯毒性[34]。本項(xiàng)研究表明，只有少量的MNPs/Cr(VI)納米顆粒從細(xì)胞外液中被內(nèi)吞，這些細(xì)胞外液滯留在消化液泡中，通過正常途徑代謝并且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[35]。

在本研究的實(shí)驗(yàn)濃度和作用時(shí)間下，磁性納米四氧化三鐵吸附Cr(VI)后的復(fù)合產(chǎn)物MNPs/Cr(VI)對(duì)HEK293細(xì)胞無明顯毒性效應(yīng)。只有極少量的MNPs/Cr(VI)復(fù)合物能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這些顆粒是從細(xì)胞外通過內(nèi)吞作用嵌入囊泡中進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)，MNPs/Cr(VI)復(fù)合物沒有進(jìn)入細(xì)胞核中，因此，沒有導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果對(duì)納米技術(shù)在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用有著重要的意義。由于磁性納米四氧化三鐵具有體積小、比表面積大、反應(yīng)活性高、易回收利用等特點(diǎn)，相比傳統(tǒng)的廢水處理方法，使用磁性納米四氧化三鐵處理環(huán)境污染物具有處理效率高、成本低、可再利用等優(yōu)點(diǎn)。本項(xiàng)研究表明，MNPs/Cr(VI)在一定條件下性質(zhì)較為穩(wěn)定，且對(duì)HEK293細(xì)胞沒有明顯毒性效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為深化了解MNPs及其重金屬復(fù)合物對(duì)環(huán)境的影響提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考價(jià)值。