磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯對(duì)L-02肝細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡損傷機(jī)制

夏滬彬，陳超，李輝,*，張運(yùn)超，王平，莊金龍，安澈，魯軍,#

1. 華東理工大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，上海 200237 2. 華東師范大學(xué) 上海市城市化生態(tài)過(guò)程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062 3. 華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，上海 200237

隨著多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)和六溴環(huán)十二烷(HBCD)的逐步禁用，作為新興的阻燃劑材料，有機(jī)磷酸酯阻燃劑(OPFRs)的使用頻率和用量大大增加[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)有機(jī)磷阻燃劑在2007年產(chǎn)量達(dá)到了70 000噸，并且以15%速率持續(xù)增長(zhǎng)[2]。磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)是最常見(jiàn)的一種有機(jī)磷酸酯阻燃劑，通過(guò)非化學(xué)鍵合的方式添加到各種使用材料中，在生產(chǎn)、消費(fèi)的環(huán)節(jié)中，它們都可能釋放到水體、氣體和土壤環(huán)境介質(zhì)中。TDCPP一般作為阻燃劑添加到聚氨酯泡沫、聚氯乙烯、聚酯纖維、環(huán)氧樹脂等材料中，這導(dǎo)致家庭紡織品、家具、裝修材料等成為室內(nèi)阻燃劑重要污染源[3]，在對(duì)美國(guó)各州抽取的125戶室內(nèi)氣體樣品檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，TDCPP檢出率達(dá)到100%，檢出平均濃度為2.021 mg·g-1[4]。隨著這些材料的廢棄、焚燒，TDCPP可能會(huì)進(jìn)入到水體和室外空氣中，從中國(guó)的黃海、東海海域采集的水體樣本中檢測(cè)出TDCPP存在，均值濃度達(dá)到109.28 ng·g-1[5]，有研究報(bào)道表明OPFRs有很大一部分可能從大氣中通過(guò)降水或降雪進(jìn)入土壤，學(xué)者在德國(guó)大學(xué)校園采集的土壤樣品中檢測(cè)到OPFRs，并且不同月份的土壤樣品中的OPFRs的含量差別較大，并且雨水和降雪中TDCPP濃度為46～100 ng·L-1，但在土壤中TDCPP的濃度低于檢出限，這可能和天氣條件有關(guān)[6]。環(huán)境介質(zhì)中TDCPP廣泛存在，然后通過(guò)生物富集進(jìn)入生物體，在瑞典深海湖中的鱸魚和中國(guó)南方珠江三角洲地區(qū)采集的淡水魚肌肉組織樣本檢測(cè)出TDCPP的存在，高達(dá)140 ng·g-1脂重和251 ng·g-1脂重[7]。研究表明甚至在代謝物、人體脂肪、精液以及母乳中有檢出[8]。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在TDCPP的毒理學(xué)方面已開(kāi)展了一些研究，發(fā)現(xiàn)其具有內(nèi)分泌干擾毒性、生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性以及潛在致癌性[9-11]，但對(duì)肝毒性方面研究明顯不足。研究顯示，TDCPP可經(jīng)皮和經(jīng)口途徑進(jìn)入生物體，并隨血液流動(dòng)擴(kuò)散到肺、肝臟以及腎臟等人體器官[12]。經(jīng)TDCPP暴露后會(huì)影響大鼠肝臟，導(dǎo)致其臟器重量明顯增加，并且在慢性暴露實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)喂食含有一定濃度的TDCPP的飼料發(fā)現(xiàn)其可誘發(fā)小鼠腎臟、睪丸和肝臟等組織產(chǎn)生腫瘤[13]。Crump等[14]研究了TDCPP和TCPP對(duì)鳥類肝細(xì)胞的影響，結(jié)果表明肝細(xì)胞的外源化合物代謝、脂肪代謝易受TDCPP和TCPP暴露的影響，并且CYP3A37基因在培養(yǎng)的雞胚肝細(xì)胞中對(duì)TDCPP暴露具有高度敏感性。利用稀有鮈鯽探究TDCPP的毒性過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，魚類肝臟組織中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶受到TDCPP的暴露影響，活性受抑制。在Sprague-Dawley大鼠的暴露實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，肝臟中代謝(細(xì)胞色素P450-3A1、CYP3A1)和甲狀腺激素(TH)清除(UGT1A6)相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平有顯著依賴性增加，2個(gè)高劑量組中觀察到肝重量的顯著增加，并且肝細(xì)胞中TRβ、TTR、UGT1A6和CYP3A1的基因和蛋白表達(dá)受到明顯的影響[15]。以上報(bào)道中均發(fā)現(xiàn)TDCPP對(duì)動(dòng)物肝臟能夠造成影響，但文獻(xiàn)中并未對(duì)其毒性作用及凋亡機(jī)制進(jìn)行具體研究。且在動(dòng)物和人體上存在種間上的差異。因此利用人體肝細(xì)胞為模型，研究其細(xì)胞和分子水平上TDCPP其對(duì)肝細(xì)胞毒性，不僅具有重要的學(xué)術(shù)理論價(jià)值，對(duì)于全面評(píng)價(jià)TDCPP的環(huán)境與人體健康風(fēng)險(xiǎn)具有重要的參考研究意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細(xì)胞系

人正常肝細(xì)胞HL-7702(L-02)細(xì)胞，由華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器與試劑

酶標(biāo)儀(TECAN GENios, Switzerland)，熒光酶標(biāo)儀(FLX800，BioTek公司，USA)，流式細(xì)胞儀(FACSCalibur, BD公司，USA)，熒光定量PCR儀(LightCycler480II, Roche公司，Switzerland)，熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i, Japan)，水平電泳儀(HE-120，上海天能科技有限公司)，超凈臺(tái)(BHC-1300ⅡA/B2，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司)。

TDCPP(純度>96%，上海泰坦科技股份有限公司)，高糖培養(yǎng)基DMEM(gibco公司)，胎牛血清(gibco公司)，熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，青鏈霉素(上海生工生物工程股份有限公司)，胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)，MTT(北京索萊寶科技有限公司)，Annexin V -FITC/PI凋亡試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，活性氧檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，Beta actin mouse monoclonal抗體(Proteintech Group公司)，Bax rabbit polyclonal抗體(Proteintech Group公司)，Bcl-2 rabbit polyclonal抗體(Proteintech Group公司)，Caspase-3 rabbit polyclonal抗體(Proteintech Group公司)，N-乙酰半胱氨酸(NAC, 純度99%，上海阿拉丁試劑有限公司)，其余試劑為分析純。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與TDCPP溶液配制

L-02細(xì)胞接種含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的培養(yǎng)基中，用25 cm2無(wú)菌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，置于CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2條件下生長(zhǎng)。24 h后，37 ℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)輕緩漂洗細(xì)胞2次，再加5 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2日更換培養(yǎng)液。顯微鏡下觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%～80%時(shí)，用0.25%含EDTA胰酶消化，4 ℃條件下1 000 r·min-1離心5 min后傳代。

TDCPP溶液配制：稱取430.9 mg TDCPP于10 mL容量瓶中，二甲基亞砜(DMSO)定容，得到100 mmol·L-1母液，4 ℃儲(chǔ)備，臨用前，用完全培養(yǎng)基依次配制成100、50、25、5、1 μmol·L-1的TDCPP溶液。以含1‰ DMSO的完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組。

1.4 細(xì)胞相對(duì)活力檢測(cè)

取一瓶對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS漂洗細(xì)胞2次，胰蛋白酶消化后制成濃度約為1×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，再轉(zhuǎn)移至50 mL無(wú)菌離心管搖勻，均勻接種于96孔培養(yǎng)板中(6×10排孔加200 μL細(xì)胞懸浮液，孔板周圍一圈加入200 μL PBS)，每取加6孔搖勻一次。于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜(16 h)。棄液，加入含100、50、25、5、1、0 μmol·L-1的TDCPP污染物培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3 d。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT液(5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上液，加150 μL DMSO至每孔中，37 ℃條件下振蕩10 min后于用酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)各孔吸光度值(OD)，3次重復(fù)，并計(jì)算其平均值，并按公式(1)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。

RAC(%)=(OD濃度-OD調(diào)零)/(OD對(duì)照-OD調(diào)零)×100%

(1)

RAC為細(xì)胞相對(duì)活力；OD濃度為實(shí)驗(yàn)組吸光度值；OD調(diào)零為調(diào)零組吸光度值；OD對(duì)照為對(duì)照組吸光度值。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

利用Annexin V -FITC/PI雙染標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)來(lái)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)細(xì)胞密度生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%，胰蛋白酶消化后制成濃度約為1×105個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔加入2 mL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜(16 h)，吸去舊液，加入含不同濃度的TDCPP污染物的完全培養(yǎng)基以及NAC(1 mmol·L-1)和NAC(1 mmol·L-1)+100 μmol·L-1TDCPP的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組為含1‰ DMSO的完全培養(yǎng)基，設(shè)置3復(fù)孔于每組濃度。于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄舊培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入0.25%不含EDTA胰蛋白酶400 μL，將消化細(xì)胞收集于離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，再用1 mL PBS洗細(xì)胞2次，然后棄上清，每管加入350 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-FITC染液，室溫避光條件下孵育15 min，再加入10 μL PI染液，室溫下避光染色5～10 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡率檢測(cè)，使用Flowjo 7.6.1軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 細(xì)胞活性氧水平(ROS)測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化將細(xì)胞制成分散的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)·mL-1，然后接種于96孔培養(yǎng)板中，在每孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜，棄液，將含不同濃度的TDCPP污染物完全培養(yǎng)基加入黑孔板，陽(yáng)性對(duì)照組按活性氧試劑盒說(shuō)明1:1 000稀釋使用(Positive組)，陰性對(duì)照組加入為含1‰ DMSO的完全培養(yǎng)基，每組5復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，移去上清液，每孔加入100 μL DCFH-DA應(yīng)用液(10 μmol·L-1)，37 ℃條件下避光孵育25 min后，去DCFH-DA染液，用無(wú)血清培養(yǎng)液清洗細(xì)胞3次，然后加入100 μL PBS，用熒光酶標(biāo)儀(Ex: 480 nm, Em: 538 nm)測(cè)定熒光強(qiáng)度，通過(guò)熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)的氧自由基水平。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

細(xì)胞總RNA提?。航臃N于6孔板中的細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度的TDCPP暴露后，按試劑盒說(shuō)明書方法提取細(xì)胞總RNA，并用Nanodrop2000C型分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和含量。

cDNA合成：按天根公司試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。

目的基因檢測(cè)：按表1加qRT-PCR反應(yīng)體系，定量的相關(guān)引物序列如表2，以β-actin作為內(nèi)參基因。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)

收集不同濃度暴露后的細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，根據(jù)BCA法測(cè)得的蛋白濃度確定上樣體積(以上樣量為50 μg計(jì)算體積)，垂直電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)至不同的硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加Bax、Bcl-2或caspase-3兔源多克隆抗體，4 ℃條件下封閉過(guò)夜，TBST(三羥甲基氨基甲烷吐溫)緩沖液晃洗3次，每次15 min。然后加入鼠抗兔IgG二抗，常溫晃洗1 h，TBST洗3次，每次10 min。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，以紅外激光成像系統(tǒng)掃描和分析圖像，最后計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 數(shù)據(jù)分析方法

采用SSPS 22.0軟件(SPSS Inc.)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和回歸分析。采用ANOVA方法分析實(shí)驗(yàn)暴露組與空白對(duì)照組之間的差異，P<0.05、P<0.01表示差異顯著。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表示方式為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系Table 1 Components of real time qPCR

表2 研究中的目的基因與引物序列Table 2 Genes and primers used in this study

圖1 磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)對(duì)L-02細(xì)胞生存率的時(shí)間、劑量影響效應(yīng)注：數(shù)據(jù)表達(dá)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=6；*P<0.05、** P<0.01，與對(duì)照組比較。Fig. 1 Dose and time-dependent toxic effects of tris(1,3-dicholor-2-propyl)phosphate (TDCPP) on cell viability of L-02 cellsNote: All data were expressed as mean±SEM, n=6; *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

2 結(jié)果(Results)

2.1 TDCPP對(duì)人體肝細(xì)胞相對(duì)活力影響

如圖1所示，有機(jī)磷酸酯類阻燃劑TDCPP能影響L-02肝細(xì)胞存活率，并且細(xì)胞存活率與TDCPP存在時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系。隨著染毒濃度從0 μmol·L-1向100 μmol·L-1的增加，染毒24 h的L-02細(xì)胞的存活率相對(duì)于對(duì)照組降至59.2%±2.8%，染毒48 h的L-02細(xì)胞的存活率相對(duì)于對(duì)照組降至38.0%±3.6%，染毒72 h的L-02細(xì)胞的存活率相對(duì)于對(duì)照組降至26.1%±3.9%。用SSPS22.0的線性回歸分析，計(jì)算得到相應(yīng)的回歸方程y=a×x+b中a和b常量值，再將x(%)代表的存活率值設(shè)置為50，最后計(jì)算得到24 h、48 h、72 h的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為116.56 μmol·L-1、81.89 μmol·L-1、65.11 μmol·L-1。對(duì)細(xì)胞活存活率影響表明TDCPP具有細(xì)胞毒性。

2.2 TDCPP影響人體肝細(xì)胞的凋亡

如圖2所示，TDCPP影響L-02細(xì)胞凋亡，使其凋亡率增加，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。L-02細(xì)胞隨著染毒濃度增加其凋亡率均呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，在低濃度1 μmol·L-1、5 μmol·L-1，細(xì)胞的早期凋亡率及晚期凋亡率增加不明顯。但在25 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞早期凋亡率增加，與對(duì)照組差異顯著(P<0.01)，細(xì)胞晚期凋亡率減少，50 μmol·L-1暴露條件下，細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增強(qiáng)，在100 μmol·L-1TDCPP染毒總凋亡率相對(duì)對(duì)照組具有顯著性差異，高達(dá)25.58%±1.612%。NAC組總凋亡率為2.30%±0.110%。NAC+100 μmol·L-1組總凋亡率為9.10%±0.631%，相對(duì)于100 μmol·L-1TDCPP總凋亡率明顯減少。但總體上看，在TDCPP暴露24 h條件下，L-02細(xì)胞的凋亡率明顯增強(qiáng)。

圖2 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)暴露于TDCPP的細(xì)胞凋亡率注：A為對(duì)照組；B為1 μmol·L-1組；C為5 μmol·L-1組；D為25 μmol·L-1組；E為50 μmol·L-1組；F為100 μmol·L-1組；G為NAC+100 μmol·L-1組；H為NAC組；NAC為N-乙酰半胱氨酸。Fig. 2 Annexin V-FITC/PI assay of the apoptosis ratio of TDCPP-exposed L-02 cellsNote: A, control; B, 1 μmol·L-1; C, 5 μmol·L-1; D, 25 μmol·L-1; E, 50 μmol·L-1; F, 100 μmol·L-1; G, NAC+100 μmol·L-1; H, NAC; NAC stands for N-acetylcysteine.

2.3 TDCPP影響細(xì)胞活性氧水平

生物在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生ROS這一中間產(chǎn)物，它具有重要的生理功能。在有害刺激條件下過(guò)量產(chǎn)生時(shí)，可造成機(jī)體細(xì)胞不同程度的氧化損傷。熒光探針DCFH-DA，是目前應(yīng)用最為廣泛的一種檢測(cè)ROS的方法。本研究發(fā)現(xiàn)：24 h暴露后，細(xì)胞活性氧水平開(kāi)始隨著TDCPP暴露濃度的增加而遞增，從5 μmol·L-1開(kāi)始，ROS水平的變化與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，在100 μmol·L-1時(shí)達(dá)到一個(gè)最高水平，為對(duì)照組2.07±0.07倍，差異顯著(P<0.01)，這可能與高劑量刺激造成大量細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。

2.4 TDCPP影響p53凋亡信號(hào)通路基因表達(dá)

p53凋亡信號(hào)通路指的是p53介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑：由于一些外界刺激，通過(guò)DNA損傷等引起細(xì)胞內(nèi)p53蛋白水平升高，然后激活下游的線粒體凋亡途徑(細(xì)胞凋亡3條主要通路之一)中關(guān)鍵基因(基因包括p53、Bax、Bcl-2、Apaf-1、caspase-9、caspase-3等)的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。p53凋亡信號(hào)通路是凋亡過(guò)程中重要的一條通路。

研究結(jié)果表明，隨著TDCPP濃度增加可以促凋亡基因Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，Bax/Bcl-2隨著暴露濃度增加而增加。此外，TDCPP處理組caspase-3、caspase-9、p53和Apaf-1的表達(dá)也增強(qiáng)(圖4)。p53基因是調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA修復(fù)和凋亡相關(guān)基因，隨著暴露濃度增加p53mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，在50 μmol·L-1、100 μmol·L-1表達(dá)量為對(duì)照組4.25±0.439，5.84±0.107倍，這可能部分解釋了本研究中TDCPP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率改變。caspase-9是凋亡執(zhí)行基因caspase-3的上游，其表達(dá)量(表4)也隨著TDCPP濃度增加而增加?；騝aspase-3的作用是作為凋亡最終的執(zhí)行基因，在25 μmol·L-1暴露條件下暴露24 h后，其mRNA相對(duì)對(duì)照組表達(dá)量達(dá)到4.38±0.633倍。

圖4 不同濃度TDCPP暴露影響L-02細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)注：將β-actin作為內(nèi)參基因；數(shù)據(jù)結(jié)果為與對(duì)照組的比值；n=3。Fig. 4 Effects of different concentrations of TDCPP on L-02 cell apoptosis-related gene expressionsNote: take β-actin as a reference gene; the results were relative to the control group and normalized using β-actin mRNA; n=3.

圖5 TDCPP影響L-02細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)(A：蛋白印跡；B：量化)Fig. 5 Effects of TDCPP on the protein expressions related to apoptosis in L-02 cells (A: Western blot; B: quantitation of the expressions)

實(shí)驗(yàn)組Experiment groups早期凋亡/%Early stage apoptosis/%晚期凋亡/%Late stage apoptosis/%總凋亡/%Total apoptosis/%Control2.42±0.0570.38±0.3322.80±0.2761 μmol·L-13.00±0.0070.29±0.0143.29±0.0215 μmol·L-15.66±0.3251.08±0.3186.74±0.007?25 μmol·L-18.29±0.12??0.53±0.1068.81±0.014?50 μmol·L-117.75±1.344??5.74±0.742??23.49±0.601??100 μmol·L-125.30±1.556??0.28±0.05725.58±1.612??NAC+100 μmol·L-18.77±0.278?0.33±0.4119.10±0.631?NAC2.16±0.0370.14±0.0162.30±0.110

注：P<0.05、**P<0.01，與對(duì)照組比較。

Note： *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

表4 不同濃度TDCPP暴露后L-02細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Table 4 Relative gene expressions in L-02 cell after exposure to different concentrations of TDCPP (mean±SEM)

2.5 TDCPP影響B(tài)ax、Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)

Bax、Bcl-2和caspase-3是線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白。如圖5所示，L-02肝細(xì)胞經(jīng)不同濃度TDCPP作用24 h后，促凋亡Bax蛋白表達(dá)水平隨濃度逐漸增加而遞增；抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)水平隨濃度增加而遞減，且與對(duì)照組均有顯著差異性(P<0.05)；此外，Bax/Bcl-2兩蛋白間的比值關(guān)系是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，在5 μmol·L-1、25 μmol·L-1和100 μmol·L-1TDCPP作用后，Bax/Bcl-2比值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，最高為對(duì)照組的4.34倍。同樣，caspase-3蛋白表達(dá)水平也隨濃度增加而增加，100 μmol·L-1時(shí)為對(duì)照組的3.50倍。

3 討論(Discussion)

肝臟是動(dòng)物最重要的代謝器官，負(fù)責(zé)體內(nèi)多種酶的合成以及外源有害物質(zhì)的清除，對(duì)于維持生物體代謝平衡和消除外源物質(zhì)毒性具有重要作用。在美國(guó)麻省總醫(yī)院的男性成人[18]和西雅圖地區(qū)兒童[19]的尿液樣品中都檢測(cè)到TDCPP主要代謝物BDCPP的存在，這表明TDCPP對(duì)人體健康有直接影響，并且人體肝臟是其重要的一個(gè)作用靶器官。因此研究利用人體正常肝細(xì)胞，研究其毒性效應(yīng)及機(jī)制，對(duì)肝毒性具有直接的指示作用。Zhang等[20]利用人體肝癌細(xì)胞系HepG2/C3A研究TDCPP的半數(shù)效應(yīng)濃度24 h-EC50和72 h-EC50為167.9 μmol·L-1和84 μmol·L-1，Crump等[14]利用禽類原代肝細(xì)胞的暴露實(shí)驗(yàn)得到的半數(shù)致死濃度24 h-LC50為(62.0±37.7) μmol·L-1，本研究中利用MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估TDCPP對(duì)人體正常肝細(xì)胞L-02暴露24 h、48 h、72 h的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為116.56 μmol·L-1、81.89 μmol·L-1、65.11 μmol·L-1，結(jié)果表明對(duì)于TDCPP暴露的敏感性：禽類原代肝細(xì)胞<人體正常肝細(xì)胞<人體肝癌細(xì)胞。

生物機(jī)體廣泛存在的一種應(yīng)激反應(yīng)叫做氧化應(yīng)激反應(yīng)，在引起人類機(jī)體損傷中發(fā)揮十分重要作用。己有研究顯示，當(dāng)機(jī)體組織中氧化與抗氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)失去平衡，脂質(zhì)過(guò)氧化物含量增加，抗氧化酶活性降低，從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性發(fā)生。Zhao等[15]的研究表明，TDCPP暴露通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷。TDCPP暴露通過(guò)影響SH-SY5Y細(xì)胞的ROS生產(chǎn)，介導(dǎo)下游凋亡信號(hào)通路，引起細(xì)胞凋亡，在25、50、100 μmol·L-1時(shí)，ROS是對(duì)照組的1.3±0.1、2.2±0.1、2.9±0.2倍，凋亡率為7.1%±0.8%、10.3%±0.6%、30.3%±0.2%[21]。本研究中的L-02細(xì)胞中ROS水平和細(xì)胞凋亡率均與TDCPP的暴露濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，并且在100 μmol·L-1時(shí)為對(duì)照組2.07±0.07倍，同時(shí)細(xì)胞凋亡率也高達(dá)25.58%±1.612%，但在加入抗氧化物質(zhì)NAC時(shí)，細(xì)胞凋亡率降低，說(shuō)明TDCPP引起的活性氧是引起細(xì)胞凋亡增加的原因。并且在5 μmol·L-1開(kāi)始才與對(duì)照組有顯著性差異，這可能由于低濃度時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS和自由基清除系統(tǒng)共同維持機(jī)體的氧化與抗氧化平衡，低濃度TDCPP對(duì)機(jī)體沒(méi)有明顯傷害。但是當(dāng)ROS產(chǎn)生量超過(guò)機(jī)體本身系統(tǒng)處理的平衡時(shí)，機(jī)體會(huì)刺激形成氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起組織或細(xì)胞內(nèi)氧化還原信號(hào)蛋白質(zhì)發(fā)生氧化性修飾、脂質(zhì)過(guò)氧化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能改變、DNA氧化損傷等，進(jìn)而引發(fā)特定信號(hào)級(jí)聯(lián)激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的2個(gè)主要途徑之一，主要特征是細(xì)胞色素C滲漏到細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞色素C由Bcl-2蛋白家族控制，其中促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2的是2個(gè)關(guān)鍵成員，在細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中起著重要的作用，并且細(xì)胞色素C可以與Apaf-1相互作用而激活caspase家族，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。本研究結(jié)果表明，TDCPP可以增加促凋亡基因BaxmRNA的表達(dá)，抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)，證明TDCPP的增加激活了線粒體相關(guān)的凋亡通路。Bax/Bcl-2是凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的重要參數(shù)，利用蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果，隨著TDCPP濃度增加Bax/Bcl-2比值也逐漸增大，caspase-3蛋白變化也具有同樣變化趨勢(shì)。p53基因是調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA修復(fù)和凋亡相關(guān)基因，研究發(fā)現(xiàn)p53 mRNA的表達(dá)量與TDCPP的暴露濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，說(shuō)明TDCPP能夠?qū)⒕€粒體相關(guān)的凋亡通路中p53通路激活，從而影響細(xì)胞凋亡。caspase-9是起始凋亡基因，caspase-3是凋亡執(zhí)行基因，本研究中TDCPP處理組caspase-3、caspase-9和Apaf-1的表達(dá)也明顯增強(qiáng)。這也從影響caspase家族基因表達(dá)方面解釋了本研究中TDCPP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率逐漸增加的現(xiàn)象。

綜上所述，TDCPP對(duì)人體正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞活力具有明顯抑制作用。此外，TDCPP造成細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，同時(shí)通過(guò)影響p53、Bax、Bcl-2、Apaf-1、caspase-3、caspase-9 mRNA的表達(dá)，從而激活線粒體凋亡通路，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞凋亡率增加。本文從細(xì)胞、生化和基因水平上系統(tǒng)評(píng)估TDCPP對(duì)L-02細(xì)胞的毒性作用，對(duì)TDCPP的環(huán)境與人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有重要意義。

致謝：感謝課題組全體成員在實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中的幫助與支持。