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    腈菌唑手性單體對(duì)雄性麗斑麻蜥肝臟代謝功能的影響

    2018-11-28 06:38:30朱飛龍郝偉玉胡曉焦萌常靜李濟(jì)彤李建中李偉王會(huì)利
    生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:蜥蜴手性單體

    朱飛龍,郝偉玉,胡曉,焦萌,常靜,李濟(jì)彤,李建中,李偉,王會(huì)利,*

    1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049

    農(nóng)藥作為使用量最大、使用范圍最廣的化學(xué)品,其使用過(guò)程中,直接到達(dá)有害生物體的量不到施用量的0.3%,其余99.7%直接進(jìn)入環(huán)境[1],被認(rèn)為是陸地環(huán)境的主要污染物[2]。三唑類殺菌劑是農(nóng)藥發(fā)展史上最引人注目的一類農(nóng)藥,它能通過(guò)抑制羊毛甾醇14α-脫甲基酶(CYP51)來(lái)限制真菌麥角甾醇的生物合成[3],從而達(dá)到殺菌的效果。因此,三唑類殺菌劑被大量使用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)之中,用來(lái)保護(hù)農(nóng)作物或蔬菜免受真菌感染[4]。三唑類殺菌劑大多都有手性,它們有1個(gè)或2個(gè)手性中心,擁有多個(gè)對(duì)映體[5]。不同對(duì)映體對(duì)生物體的毒性、致癌性、致突變性以及內(nèi)分泌干擾都有一定的對(duì)映選擇性[6]。腈菌唑是一種常見(jiàn)的三唑類殺菌劑,它有一個(gè)手性中心,2個(gè)對(duì)映體,被歸類為中等有毒物。2014年糧農(nóng)組織/世衛(wèi)組織農(nóng)藥殘留聯(lián)合會(huì)議(JMPR)發(fā)現(xiàn),腈菌唑影響老鼠/兔子的繁殖和發(fā)育能力,并導(dǎo)致一些幼仔出現(xiàn)死亡、肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化、肝細(xì)胞肥大和睪丸萎縮[7]。先前的研究也表明了腈菌唑?qū)τ丑w間的不同生理和生物學(xué)特性[7-9]。因此,有必要從對(duì)映體的層面對(duì)腈菌唑的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)有一個(gè)準(zhǔn)確而完整的評(píng)價(jià)。

    肝臟能夠利用各種代謝解毒酶,是解毒過(guò)程和氧化應(yīng)激發(fā)生的重要場(chǎng)所[10],同時(shí)也是大多數(shù)外源物質(zhì)代謝的主要部位。細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450, CYP450)是一相代謝酶,它們?cè)谕庠次镔|(zhì)的代謝和解毒方面起重要作用[11-12]。當(dāng)外源物質(zhì)的毒性超過(guò)肝臟代謝承受能力時(shí),就會(huì)造成肝臟損傷,并對(duì)CYP450酶基因的表達(dá)產(chǎn)生一定影響。之前的研究表明,伊曲康唑暴露對(duì)大鼠的肝臟造成了一定程度的組織病理學(xué)損傷[10]。在氟康唑和丙環(huán)唑暴露后,大鼠肝組織出現(xiàn)了細(xì)胞肥大現(xiàn)象且CYP450酶基因(如CYP1A2、CYP2G1、CYP3A3等)的表達(dá)也發(fā)生了改變[13]。因此,肝組織病理學(xué)變化和CYP450酶基因的表達(dá)變化可以作為評(píng)價(jià)外源物質(zhì)毒性的指標(biāo)。

    爬行動(dòng)物在生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著重要地位,但對(duì)爬行類動(dòng)物生態(tài)毒理學(xué)方面的研究相對(duì)較少[14],更缺乏農(nóng)藥等環(huán)境污染物對(duì)爬行動(dòng)物毒性作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)[15]。與其他爬行動(dòng)物(鱷魚(yú)或海龜)不同,蜥蜴體型小,對(duì)環(huán)境變化敏感,易于在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[16]。因而,近年來(lái),許多研究都使用蜥蜴來(lái)研究爬行動(dòng)物毒理學(xué)[16-17]。麗斑麻蜥(Eremiasargus)是我國(guó)的本土蜥蜴,廣泛分布于長(zhǎng)江以北。目前,我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了麗斑麻蜥的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并對(duì)其生物學(xué)背景進(jìn)行了初步研究。因此,在本研究中,麗斑麻蜥被選為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)代表爬行動(dòng)物進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)研究。

    為了探究腈菌唑?qū)τ丑w對(duì)麗斑麻蜥肝臟的毒性影響,受試蜥蜴分別暴露于(+)-腈菌唑(MT1)和(-)-腈菌唑(MT2),對(duì)蜥蜴肝組織切片和代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化進(jìn)行觀察記錄。本研究探討了腈菌唑2種單體對(duì)蜥蜴肝臟的毒性差異,為三唑類手性農(nóng)藥對(duì)蜥蜴或其他爬行動(dòng)物的毒理學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 化學(xué)品和試劑

    分析純的腈菌唑消旋體(純度>99.0%)從農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)化學(xué)品控制研究所(北京)獲得。其他相關(guān)液體試劑均購(gòu)自化學(xué)試劑有限公司(北京)。單體分離前,外消旋的腈菌唑儲(chǔ)存在乙腈(分析純)中,4 ℃避光保存。

    1.2 腈菌唑單體分離

    在Agilent 1260高效液相色譜(HPLC)上使用手性柱(CHIRALCEL OD-3R)分離(+)-腈菌唑(MT1)和(-)-腈菌唑(MT2)。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm,流動(dòng)相為乙腈和純水(40:60,V/V)的混合物,流速為1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量為20 μL。分離得到的2種對(duì)映異構(gòu)體的純度均>97%。分離后,將MT1和MT2溶于乙醇中,然后用玉米油(乙醇∶玉米油1:9,V/V)稀釋?;旌弦涸? ℃中遮光貯存,暴露實(shí)驗(yàn)前先平衡至室溫,然后混合均勻使用。

    1.3 蜥蜴飼養(yǎng)

    成年(約2~3年)的雄性蜥蜴來(lái)自我們實(shí)驗(yàn)室的蜥蜴繁殖基地(北京昌平區(qū))。在暴露實(shí)驗(yàn)中使用體重(4.0~4.5 g)和長(zhǎng)度(50~60 mm)相似的蜥蜴。蜥蜴放置在一個(gè)5 m×1.2 m×0.4 m的室內(nèi)玻璃箱中,底部覆蓋有10 cm厚的細(xì)砂土。在玻璃箱中,放置一些水碟、遮蔽物和樹(shù)枝,箱內(nèi)控制溫度(26~30 ℃)和濕度(30%~50%)以及足夠的光照(光暗比為12 h:12 h)以保持蜥蜴健康的日常生活。另外,蜥蜴每天喂食2次活的黃粉蟲(chóng)(Tenebriomolitor),并且每2天清除一次它們的排泄物。

    1.4 劑量選擇和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    由于對(duì)爬行動(dòng)物的毒理學(xué)研究較少,爬行動(dòng)物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估通常用鳥(niǎo)類來(lái)替代[17]。腈菌唑?qū)B(niǎo)類的急性毒性LD50為498(408~598, 95% C.I.) mg·kg-1,被歸類為中等有毒物。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,使用5 mg·kg-1的腈菌唑暴露對(duì)蜥蜴體重造成顯著影響,但未觀察到有蜥蜴死亡。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇腈菌唑?qū)B(niǎo)類急性毒性LD50的大約1%(5 mg·kg-1)作為蜥蜴的暴露濃度。

    在實(shí)驗(yàn)之前,將所有雄性蜥蜴(n=12)分為3組(每組n=4),包括1個(gè)對(duì)照組和2個(gè)試驗(yàn)組。分組后的蜥蜴飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)玻璃箱(30 cm×30 cm×20 cm)中,飼養(yǎng)條件與1.3中提到的相同。2個(gè)試驗(yàn)組中的蜥蜴根據(jù)體重分別經(jīng)口暴露5 mg·kg-1的MT1和MT2,對(duì)照組僅施用溶劑(玉米油+乙醇)暴露,每周暴露2次,連續(xù)暴露4周。在第1、7、14和28天分別測(cè)量3組蜥蜴的體重。暴露結(jié)束后,3組蜥蜴全部處死,立即收集蜥蜴肝臟并冷凍于-20 ℃,留待進(jìn)一步分析。

    1.5 肝組織病理學(xué)分析

    收集得到的蜥蜴肝組織切下一小部分并儲(chǔ)存于4%的多聚甲醛中用于組織病理學(xué)分析。將肝組織包埋在石蠟中,切成矢狀切片(約5 μm),用蘇木精-伊紅(H&E)染色,然后通過(guò)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

    1.6 RNA分離和cDNA合成

    使用TrizolA+試劑(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)從蜥蜴的肝臟中提取總RNA。然后,使用Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)測(cè)量總RNA的濃度和OD260/OD280的比率,用于隨后的cDNA克隆。

    嚴(yán)格按照FastKing RT試劑盒(含gDNase)(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)的說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄大約2 μg的總RNA。首先,加入總RNA和2 μL 5×gDNA Buffer,接下來(lái)加入RNase-Free ddH2O使其體積補(bǔ)足10 μL,在42 ℃溫育3 min,然后在冰上冷卻。加入含有2 μL 10×King RT Buffer, 1 μL FastKing RT Enzyme Mix, 2 μL FQ-RT Primer Mix和5 μL RNase-Free ddH2O的混合液至最終體積為20 μL。在42 ℃溫育15 min,95 ℃加熱3 min使逆轉(zhuǎn)錄失活,反應(yīng)結(jié)束。

    1.7 實(shí)時(shí)定量PCR

    使用Talent qPCR PreMix(SYBR Green)(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,實(shí)時(shí)定量?jī)x的型號(hào)為MX3005P (Stratagene, USA),反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)包括擴(kuò)增階段和解離階段。擴(kuò)增階段程序?yàn)椋?5 ℃、3 min,接下來(lái)是95 ℃、5 s和60 ℃、32 s并循環(huán)40次。解離階段程序?yàn)椋?5 ℃、40 s,60 ℃、40 s和95 ℃、40 s。本研究中選擇的類固醇合成相關(guān)基因及其引物分別列于表1。β-Actin基因的引物序列參考之前的研究[5],其他引物由作者使用Primmer Primmer 5.0軟件(Canada)設(shè)計(jì)。在這項(xiàng)研究中,使用管家基因β-Actin來(lái)標(biāo)定mRNA的表達(dá)?;虻奶禺愋詳U(kuò)增通過(guò)熔解曲線(僅一個(gè)峰)來(lái)分析確認(rèn)。為減少蜥蜴?zhèn)€體間的基因表達(dá)差異,本實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)生物學(xué)平行,所有樣品均重復(fù)測(cè)試3次,使用△△Ct方法進(jìn)行結(jié)果分析。

    表1 定量PCR中基因表達(dá)所需引物序列Table 1 Primers used for quantitative PCR measurement of gene expression

    1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    所有數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析,并使用Levene's檢驗(yàn)數(shù)據(jù)方差的均一性。采用ANOVA方法分析對(duì)照組與暴露組之間差異。*P<0.05、**P<0.01表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    2 結(jié)果(Results)

    2.1 蜥蜴體重變化

    實(shí)驗(yàn)期間,記錄了對(duì)照組和暴露組蜥蜴在1,7,14和28 d的體重的變化(見(jiàn)表2)。在實(shí)驗(yàn)期間蜥蜴沒(méi)有出現(xiàn)中毒癥狀或死亡。與對(duì)照組相比,MT2暴露組蜥蜴在所有記錄點(diǎn)的體重均無(wú)明顯變化。然而,MT1暴露組的蜥蜴體重在28 d 時(shí)出現(xiàn)顯著下降,在其記錄點(diǎn)沒(méi)有觀察到顯著變化。說(shuō)明MT1和MT2對(duì)蜥蜴體重的影響不同,MT1暴露對(duì)蜥蜴體重的影響更明顯。

    2.2 肝組織病理學(xué)

    在28 d暴露結(jié)束后,觀察到了蜥蜴的肝組織病理學(xué)變化(圖1)。在對(duì)照組中,正常的蜥蜴肝組織細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列(圖1A)。與對(duì)照組相比,暴露組中均觀察到肝細(xì)胞的不同程度病變。例如,在MT1暴露后,肝組織細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞核聚集的現(xiàn)象并伴隨著不同程度的炎癥(圖1B)。而在MT2暴露后,觀察到了肝組織細(xì)胞的脂肪化(圖1C)。

    2.3 代謝相關(guān)基因表達(dá)

    對(duì)照組蜥蜴肝臟代謝相關(guān)基因的表達(dá)如表3所示。相對(duì)于管家基因β-Actin的表達(dá),CYP3A4和CYP3A7基因的表達(dá)是管家基因的18倍左右。CYP2D6和CYP2D3基因的表達(dá)也超過(guò)了管家基因,分別是管家基因的3.96倍和2.31倍。而CYP1A1和CYP2C8基因的表達(dá)卻低于管家基因,分別是管家基因的0.86倍和0.59倍。由此可知,CYP3A4和CYP3A7是蜥蜴肝臟含量最為豐富的CYP450代謝酶。

    圖1 雄性蜥蜴的肝組織切片注:(A)對(duì)照組;(B)MT1暴露組;(C)MT2暴露組。Fig. 1 Liver sections of male lizardsNote: (A) the control; (B) MT1 treated group; (C) MT2 treated group.

    濃度/(mg·kg-1)Concentration/(mg·kg-1)分組Group體重/gBody weight/g1 d7 d14 d28 d55CK(對(duì)照)4.48±0.134.25±0.114.05±0.114.28±0.08MT14.28±0.114.15±0.153.88±0.133.70±0.12?MT24.33±0.114.08±0.083.95±0.154.23±0.23

    注:數(shù)據(jù)以平均值±方差的形式表示;星號(hào)表示與對(duì)照組相比有顯著差異(*P<0.05);MT1表示(+)-腈菌唑,MT2表示(-)-腈菌唑。

    Note: The data was expressed as mean±S.E.; asterisks indicate significant difference compared to the control (*P<0.05); MT1 and MT2 are two enantiomers; MT1 stands for (+)- myclobutanil, and MT2 stands for (-)- myclobutanil.

    腈菌唑手性單體對(duì)蜥蜴肝臟代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響如圖2所示。由圖可知:MT1暴露對(duì)CYP1A1的基因表達(dá)沒(méi)有明顯影響,而在MT2暴露時(shí),CYP1A1基因受到顯著抑制,表達(dá)量為對(duì)照組的41.36%(P<0.05);在MT1和MT2暴露下,CYP3A4、CYP3A7和CYP2D3的基因表達(dá)雖有變化,但都不顯著(P>0.05);CYP2D6基因表達(dá)在MT1暴露下變化不大,而在MT2暴露下出現(xiàn)了顯著上調(diào)(P<0.05);特別的,CYP2C8基因表達(dá)在MT1暴露下顯著上調(diào)(P<0.05),在MT2暴露下卻出現(xiàn)了顯著下調(diào)(P<0.05),這可能與手性單體間的對(duì)映選擇性有關(guān)。

    圖2 MT1和MT2對(duì)雄性蜥蜴代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響注:* 代表處理組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。Fig. 2 Effects of MT1 and MT2 on the expression of metabolic related genes in male lizardNote: * represents significant difference between treated and control groups (P<0.05).

    基因GeneCPY1A1CYP2D6CYP3A4CYP3A7CYP2C8CYP2D3相對(duì)表達(dá)倍數(shù)Relative expression fold0.86±0.073.96±0.7517.96±3.1918.08±3.850.59±0.142.31±0.62

    3 討論(Discussion)

    體重的變化是評(píng)價(jià)蜥蜴成長(zhǎng)的重要指標(biāo)[18]。在本研究中,經(jīng)過(guò)28 d的暴露,觀察到MT1暴露組的蜥蜴體重顯著下降(P<0.05),而MT2暴露組蜥蜴體重雖有變化,但不顯著(P>0.05)。與MT1暴露結(jié)果類似,50 mg·kg-1氟蟲(chóng)脲暴露也能造成繁殖階段的蜥蜴體重發(fā)生顯著下降[19]。體重的減輕對(duì)蜥蜴的代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖都有著一定影響。因此,與MT2相比,MT1暴露對(duì)蜥蜴正常生長(zhǎng)影響更大。

    盡管MT2暴露對(duì)蜥蜴的體重影響不大,但蜥蜴的肝臟還是觀察到了細(xì)胞的脂肪化(圖1C)。這可能是肝組織細(xì)胞面對(duì)外源物質(zhì)入侵的一種應(yīng)激反應(yīng),造成肝細(xì)胞脂質(zhì)攝取增加而脂肪氧化減少,導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積,肝臟肥大。之前研究也發(fā)現(xiàn),在高劑量的腈菌唑、丙環(huán)唑和三唑酮暴露下,出生后92 d的雄性大鼠肝臟細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞肥大現(xiàn)象[4]。在MT1暴露組觀察到蜥蜴肝組織細(xì)胞核聚集,這可能是MT1誘導(dǎo)的產(chǎn)物在肝細(xì)胞中聚集,占據(jù)了大量的細(xì)胞空間,細(xì)胞核被推到了細(xì)胞邊緣。與之相似,麗斑麻蜥在苯霜靈單體暴露后,其肝組織切片也觀察到了細(xì)胞核聚集現(xiàn)象[20]。由此可見(jiàn),腈菌唑的2個(gè)單體對(duì)蜥蜴的肝組織均造成一定程度的損傷,這將影響肝臟的正常代謝功能。

    在脊椎動(dòng)物中,唑類殺真菌劑可以調(diào)節(jié)CYP酶活性[21]。唑類可以通過(guò)與血紅素鐵相互的作用對(duì)CYP酶的活性進(jìn)行誘導(dǎo)或抑制[22]。例如,之前研究表明咪唑類酮康唑和克霉唑是CYP3A4的有效抑制劑[22-23]。然而,克霉唑的重復(fù)暴露反而對(duì)CYP3A4又產(chǎn)生了誘導(dǎo)[22]。在本研究中,MT2顯著抑制了蜥蜴CYP1A1的表達(dá),而MT1對(duì)CYP1A1基因的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響,說(shuō)明腈菌唑不同單體對(duì)蜥蜴同一基因的表達(dá)影響不同。腈菌唑手性單體對(duì)麗斑麻蜥代謝相關(guān)基因的影響是具有手性選擇性的。這種對(duì)映選擇差異也可以在CYP2C8基因的表達(dá)中明顯觀察到:MT1暴露顯著抑制了CYP2C8的表達(dá),而MT2暴露卻顯著誘導(dǎo)了CYP2C8的表達(dá)。一般來(lái)說(shuō),手性對(duì)映體是有立體選擇性的,其對(duì)生物體的影響可能完全不同[24]。之前研究發(fā)現(xiàn)手性農(nóng)藥暴露對(duì)水生生物毒性也有類似的對(duì)映選擇效應(yīng)[6,25-26]。CYP3A亞族是促成人肝微粒體中主要藥物代謝(> 60%)的最豐富的CYP酶之一[27]。同樣的,在本研究中我們發(fā)現(xiàn)CYP3A4和CYP3A7也是麗斑麻蜥肝臟中含量最為豐富的CYP450代謝酶。然而,無(wú)論MT1還是MT2暴露,CYP3A4和CYP3A7的基因表達(dá)都沒(méi)有發(fā)生明顯變化。在CYP2D亞族中,MT1暴露下CYP2D6和CYP2D3的基因表達(dá)未發(fā)生明顯變化;而在MT2暴露下,CYP2D6基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào),CYP2D3基因的表達(dá)仍未發(fā)生明顯變化。這說(shuō)明同一CYP亞族基因間的表達(dá)在不同腈菌唑單體暴露下也是有差異的。通常,抑制CYP亞型基因表達(dá)能夠降低由該特定亞型代謝底物的代謝和肝臟清除,而誘導(dǎo)CYP酶基因表達(dá)可以導(dǎo)致底物的代謝和肝臟清除增加[28]。因此,蜥蜴體內(nèi)CYP代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)變化也從一定層面上反映著MT1和MT2對(duì)蜥蜴肝臟代謝的影響。由以上結(jié)果可知,不同腈菌唑單體對(duì)蜥蜴體重、肝組織病理學(xué)以及代謝相關(guān)基因的表達(dá)影響不同,具有一定的對(duì)應(yīng)選擇性。

    致謝:感謝中科院生態(tài)環(huán)境研究中心郭寶元副研究員對(duì)實(shí)驗(yàn)和文章的指導(dǎo)。

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