自然發(fā)酵豆醬中明串珠菌的分離鑒定

張 平，張鵬飛，劉斯琪，岳媛媛，烏日娜*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

發(fā)酵食品是在一系列微生物共同作用下發(fā)酵而成的食品，通過發(fā)酵不僅可以保存易腐食品，而且可以改善食品的生物利用性[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的復(fù)雜性是有目共睹的，其中的微生物資源亟待人們開發(fā)利用。豆醬又名黃豆醬、黃醬或大豆醬，在我國東北地區(qū)也被稱為大醬，是一種營養(yǎng)豐富、香氣馥郁的傳統(tǒng)發(fā)酵大豆食品[2-3]。豆醬不僅美味可口，還含有豐富的生物活性物質(zhì)使其具有良好的保健功能，研究表明，豆醬具有抗癌[4]、有助于肝臟解毒、促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞的復(fù)活、抑制腫瘤[5]、預(yù)防高血壓和降血壓[6]、控制肥胖[7]、增強(qiáng)免疫功能、改善和預(yù)防過敏[8]、抑制膽固醇吸收、除卻放射性物質(zhì)、防止胃潰瘍、抗氧化等功能[9]。在豆醬的自然發(fā)酵過程中，乳酸菌是與豆醬風(fēng)味息息相關(guān)的細(xì)菌，它能夠利用大豆中的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等，分解成為小分子的醛、酸、酯等風(fēng)味物質(zhì)，使豆醬的pH值和各種養(yǎng)分發(fā)生變化[10-11]。

明串珠菌是一種G+C含量低于50%的異型發(fā)酵乳酸菌，兼性厭氧，菌落為圓形，直徑小于1.0 mm，呈灰白色，光滑濕潤，中心凸起但邊緣整齊，透明度較低[12]，其大小約為0.7 μm×1.2 μm，在電鏡下通常為橢圓形或球形，以成對或短鏈形態(tài)排列，極少為長鏈，革蘭氏染色呈陽性。明串珠菌屬于化能有機(jī)營養(yǎng)型，在兼性厭氧環(huán)境中生長情況最佳，即0.05 g/100 mL cysteine·HCl、19.8% CO2、11.4% H2和N2。其生長要求培養(yǎng)基內(nèi)包含復(fù)雜的生長素和氨基酸。屬內(nèi)所有種的生長均離不開煙酸、硫胺素、泛酸、生物素，但都不需要鈷胺素和對氨基苯甲酸。明串珠菌能夠以碳水化合物為發(fā)酵底物來維持生長，同時伴隨產(chǎn)生D-乳酸、乙酸、細(xì)菌素、胞外多糖、甘露醇、雙乙酰等代謝產(chǎn)物[13-16]，而明串珠菌的這些特性使其在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品保健等領(lǐng)域的發(fā)展擁有廣闊前景。

明串珠菌的生存環(huán)境十分廣泛[17-18]，植物表面和根部較為常見。據(jù)報道明串珠菌是豆醬發(fā)酵初期的優(yōu)勢菌，對豆醬的啟動發(fā)酵起到了重要的作用[19]。明串珠菌能夠在發(fā)酵制品中代謝產(chǎn)生葡聚糖、甘露醇等多種功能化合物，可用于生產(chǎn)代血漿、保健性食品甜味劑、選擇性刺激腸道內(nèi)有益微生物的生長繁殖；也可代謝產(chǎn)生雙乙酰等多種風(fēng)味物質(zhì)，影響發(fā)酵制品的風(fēng)味[20]；還可代謝生成細(xì)菌素，對一些常見致病菌等有抑制作用[21]，能夠用作新型食品防腐劑和飼料添加劑，除此之外明串珠菌還能產(chǎn)酸[22]、代謝生成K族維生素等。因此，明串珠菌在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域一直受到人們的關(guān)注。然而，目前對豆醬中明串珠菌的研究鮮有深入報道。

因此，本實驗旨在從傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬中分離明串珠菌，并對菌株的益生特性進(jìn)行篩選，以期篩選出益生性優(yōu)良的明串珠菌菌株，并為明串珠菌進(jìn)一步研究、開發(fā)、保護(hù)以及在工業(yè)化生產(chǎn)方面的應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

采自東北6 個地區(qū)（遼寧省沈陽市沈河區(qū)、遼寧省沈陽市遼中區(qū)、遼寧省沈陽市新民市、遼寧省丹東市、遼寧省阜新市、吉林省四平市）的傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬，共計56 份豆醬樣品。包括沈陽3 份樣品、遼中9 份樣品、新民12 份樣品、丹東12 份樣品、阜新10 份樣品、四平10 份樣品。

1.1.2 試劑

10×TE緩沖液、1 mol/L Tris-HCl Buffer、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，pH 8.0）、10%十二烷基硫酸鈉溶液（sodium dodecyl sulfate，SDS）、20 mg/mL蛋白酶K、10 mol/L十六烷基三甲基溴化銨溶液（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、0.7 mol/L NaCl溶液、酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）溶液、氯仿-異戊醇（24∶1）溶液、冰異丙醇。所有試劑均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，10 g牛肉浸膏，4 g酵母粉，2 g K2HPO4，1 g Tween-80，20 g葡萄糖，2 g檸檬酸三鈉，0.58 g MgSO4·7H2O，0.25 g MnSO4·4H2O，5 g三水乙酸鈉，1 000 mL蒸餾水。用于明串珠菌的分離培養(yǎng)，以及菌株的生理特征鑒定。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2%瓊脂粉。用于明串珠菌的分離培養(yǎng)。

MRS半固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0.75%瓊脂粉。用于明串珠菌的分離培養(yǎng)。

BL固體培養(yǎng)基：20 g蛋白胨，10 g乳糖，5 g牛膽鹽，20 g瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水，pH 7.4。用于明串珠菌的分離培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

GMSX280手提式壓力蒸汽滅菌器 北京中科路達(dá)實驗儀器有限公司；DNP-9022電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Mastercycler nexus SX1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀Eppendorf（中國）有限公司；DYY-12生化電泳儀 北京六一生物科技有限公司；GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 明串珠菌的富集和分離純化

取適量白菜洗凈擦干、切成小塊后放入榨汁機(jī)打漿并過濾、離心然后加入NaCl至終質(zhì)量濃度為3 g/100 mL，于121 ℃滅菌20 min。取5 g豆醬加入50 mL白菜汁液中，25 ℃密閉靜置培養(yǎng)7 d。無菌條件下，取培養(yǎng)7 d后的白菜汁液體1 mL，加入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，得到豆醬樣品質(zhì)量濃度為10-2g/mL，按照10 倍稀釋法將樣品稀釋至10-8g/mL。取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/mL 5 個梯度樣品100 μL分別涂布接種于含2 g/100 mL CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基、BL固體培養(yǎng)基，置于厭氧培養(yǎng)罐中，25 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。挑取單個的明串珠菌典型菌落，純化2～3 次，直至得到單菌落。對獲得的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色并置于顯微鏡下觀察，將鏡檢結(jié)果為純培養(yǎng)物、具有明串珠菌細(xì)胞形態(tài)的革蘭氏陽性球菌穿刺于MRS半固體培養(yǎng)基或劃線轉(zhuǎn)入MRS固體斜面培養(yǎng)基中，低溫保存，供進(jìn)一步實驗之用。

1.3.2 明串珠菌的形態(tài)特征和生理生化特征鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[23]，進(jìn)行生態(tài)學(xué)特征和生理生化特征鑒定。

1.3.3 16S rDNA分子鑒定

采用CTAB法[24]提取明串珠菌基因組DNA，利用微量紫外分光光度計檢測疑似菌株的DNA濃度和純度。以明串珠菌疑似菌株基因組總DNA為PCR擴(kuò)增模板，利用16S rRNA基因通用引物[25-26]27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG-3’）和1495R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL PCR體系：10×PCR buffer（含Mg2+）5 μL，10 pmol/μL 27F和1495R各2 μL，dNTP Mix 4 μL，Taq DNA polymerase 0.6 μL?；蚪MDNA模板在反應(yīng)體系內(nèi)終質(zhì)量濃度為200 ng/μL，剩余的體系體積用ddH2O補(bǔ)齊。PCR條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 個循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物送交至上海桑尼生物科技有限公司測序。將測序得到的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行BLAST同源性比對，通過BLASTn（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）完成序列比對。

1.3.4 明串珠菌的耐酸、耐膽鹽性能比較

益生菌若在人體內(nèi)定植并發(fā)揮有益作用，就必須能夠耐受人體胃腸道的極端環(huán)境，根據(jù)人體胃腸道環(huán)境條件（進(jìn)食后胃液的pH值不小于3.5，小腸膽鹽質(zhì)量濃度基本保持在0.03～0.3 g/100 mL之間），本實驗將明串珠菌益生特性篩選的條件定為：pH 3.0、膽鹽質(zhì)量濃度0.3 g/100 mL。將活化后明串珠菌2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）接種量接種于pH 3.0的現(xiàn)配MRS液體培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)。采用傾注法對培養(yǎng)0、1、2、3 h的菌懸液進(jìn)行活菌計數(shù)。將活化后明串珠菌以2%的接種量接種到含0.3 g/100 mL牛膽鹽的現(xiàn)配MRS液體培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)。采用傾注法對培養(yǎng)0、2、4、6 h的菌懸液進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.3.5 分離株的保存

采用真空冷凍干燥法對菌體進(jìn)行凍干保存。將明串珠菌菌株活化，于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用滅菌生理鹽水沖洗菌體沉淀并混勻，再于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，再次收集菌體沉淀，如此重復(fù)2～3 次洗滌菌體。向菌體沉淀中加入15 g/100 mL滅菌脫脂乳1 mL，充分混勻后分裝于凍存管，預(yù)凍過夜后使用真空冷凍干燥機(jī)將其凍干，并置于-80 ℃的超低溫冰箱中保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 明串珠菌的分離結(jié)果

采用含2 g/100 mL CaCO3的MRS培養(yǎng)基和BL培養(yǎng)基對豆醬中明串珠菌進(jìn)行分離篩選，因目前還沒有一種培養(yǎng)基能夠精確地從樣品中選擇性培養(yǎng)明串珠菌，故本實驗從豆醬中初步分離的菌株并不能確認(rèn)為明串珠菌屬細(xì)菌，仍需要進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子鑒定才能最終認(rèn)定為明串珠菌。根據(jù)明串珠菌的形態(tài)學(xué)特征，挑取MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后菌落呈灰白色、表面光滑、邊緣整齊、黏稠有光澤、直徑約1 mm的菌株并保存。本實驗共從56 份豆醬樣品中初步分離出118 株菌株，經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定后，有81 株菌株為革蘭氏陽性菌，除去其中的34 株桿菌，剩余的47 株球菌被初步鑒定為明串珠菌疑似菌株。部分明串珠菌疑似菌株的革蘭氏染色鏡檢圖片見圖1。

圖1 部分明串珠菌疑似菌株的革蘭氏染色圖片（×100）Fig. 1 Gram staining of some suspected Leuconostoc strains (× 100)

2.2 明串珠菌的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征鑒定結(jié)果

從傳統(tǒng)豆醬中分離得到的47 株菌中，有22 株菌株的運(yùn)動性以及在37 ℃、pH 6.5、pH 4.8、3.0 g/100 mL NaCl、6.5 g/100 mL NaCl和10%乙醇溶液條件下的生長情況（表1），與文獻(xiàn)[23]中記錄的明串珠菌特征基本一致。對符合明串珠菌菌株生理特性的22 株菌進(jìn)行一系列生化實驗后，共有6 株菌株表現(xiàn)為過氧化氫酶（接觸酶）陰性、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、精氨酸水解陰性等特性，被初步認(rèn)定為明串珠菌屬細(xì)菌。結(jié)合葡聚糖生成實驗（圖2）和碳水化合物利用實驗（表1）進(jìn)一步表明：菌株MC3、LBQ、LBH不能生成葡聚糖，而菌株FX6、WQD、WDX能發(fā)酵產(chǎn)生葡聚糖。同時，6 株菌株均能夠利用果糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖，但在阿拉伯糖、熊果苷、纖維素、纖維二糖、核糖、海藻糖、木糖的利用上均具有一定差異，因此根據(jù)文獻(xiàn)[23]將MC3、LBQ、LBH菌株鑒定為乳酸明串珠菌，而將FX6、WQD、WDX菌株鑒定為腸膜明串珠菌腸膜亞種。

表1 部分明串珠菌疑似菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of suspected Leuconostoc strains

圖2 部分明串珠菌疑似菌株葡聚糖生成實驗結(jié)果Fig. 2 Dextran production from sucrose by suspected Leuconostoc strains

2.3 明串珠菌的分子生物學(xué)鑒定

利用微量紫外-可見分光光度計檢測6 株明串珠菌疑似菌株DNA的濃度和純度，發(fā)現(xiàn)菌株的DNA質(zhì)量濃度均在200 ng/μL左右，且OD260nm/OD280nm值基本處于1.6～1.8之間，符合PCR擴(kuò)增體系的要求，可以進(jìn)行下一步PCR擴(kuò)增實驗。以獲得的明串珠菌疑似菌株DNA作為模板，按照PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，所有菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物均于1 500 bp處有單一明亮的條帶，符合測序工作的要求。將測序結(jié)果中6 株明串珠菌疑似菌株的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比對分析，得到6 株明串珠菌屬細(xì)菌，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 明串珠菌16S rRNA序列同源性對比結(jié)果Table 2 Homology alignment of 16S rRNA sequences of suspected Leuconostoc strains

由表2可以看出，6 株菌鑒定結(jié)果均為明串珠菌（Leuconostoc）。其中菌株MC3、LBQ、LBH為乳酸明串珠菌（L. lactis），菌株FX6、WQD、WDX為腸膜明串珠菌腸膜亞種（L. mesenteroides subsp. mesenteroides），與形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征鑒定結(jié)果一致。目前分子生物學(xué)鑒定最常用的是16S rDNA/rRNA序列分析技術(shù)，因16S rDNA/rRNA具有保守性，在漫長進(jìn)化過程中幾乎保持恒定，可以由此進(jìn)行物種的系統(tǒng)發(fā)育分析，同時又含有可變區(qū)域，能夠揭示出物種的特定核算序列，為分子生物學(xué)鑒定基礎(chǔ)。

2.4 明串珠菌的耐酸耐膽鹽性能比較

利用比濁法測定6 株供試菌株的生長曲線，利用菌懸液的濃度與混濁度呈正比的特性，采用分光光度計測量菌懸液的光密度來推算菌液的濃度。以測得的光密度OD600nm為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)作圖，繪制6 株明串珠菌屬細(xì)菌在6 h內(nèi)的生長曲線，見圖3。

圖3 明串珠菌菌株生長曲線Fig. 3 Growth curves of six Leuconostoc strains

如圖3所示，6 株明串珠菌屬細(xì)菌生長曲線的趨勢相似，在0～2 h內(nèi)生長較為緩慢，而在2～6 h內(nèi)迅速生長，6 h后OD600nm均達(dá)到了1.200 0以上；其中，菌株MC3的生長速度最快，菌株WQD的生長速度最慢。

將6 株明串珠菌菌株分別接種到pH值為3.0的新鮮配制的MRS液體培養(yǎng)基中，于0、1、2、3 h進(jìn)行傾注平板法活菌計數(shù)，結(jié)果如表3所示。

表3 明串珠菌酸耐受性實驗結(jié)果Table 3 Acid tolerance of Leuconostoc strains

如表3所示，明串珠菌在pH 3.0的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～3 h，隨著時間的延長，菌株的活菌數(shù)大致呈下降趨勢。6 株菌對酸都有一定的耐受性，但菌株之間存在差異。其中菌株MC3、FX6、WDX的耐酸性較好，3 h后存活率分別為92.12%、85.16%、78.93%，不僅如此，菌株MC3和FX6在2 h后活菌數(shù)有所回升；菌株WQD對酸的耐受性最差，與0 h相比，在3 h后活菌數(shù)已經(jīng)下降了一個數(shù)量級，存活率僅達(dá)到15.08%。

將6 株明串珠菌菌株分別接種到含0.3 g/100 mL牛膽鹽的新鮮配制的MRS液體培養(yǎng)基中，于0、2、4、6 h進(jìn)行傾注平板法活菌計數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 明串珠菌膽鹽耐受性實驗結(jié)果Table 4 Bile tolerance of Leuconostoc strains

如表4所示，6 株明串珠菌實驗菌株在含0.3 g/100 mL牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～6 h，隨著時間的延長，活菌數(shù)基本呈下降趨勢，但是下降的幅度不大，說明6 株菌對牛膽鹽都有一定的耐受性?？v向?qū)Ρ?，菌株之間的活菌數(shù)各不相同，說明菌株之間對牛膽鹽的耐受性存在差異。橫向?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，菌株FX6、WDX、LBQ、WQD的膽鹽耐受性較好，6 h后存活率分別達(dá)到96.07%、88.75%、84.32%和83.06%；菌株LBH在6 株菌中對膽鹽的耐受性最差，培養(yǎng)6 h后存活率為60.53%。

綜上所述，菌株FX6、MC3、WDX對酸的耐受性較好，菌株FX6、WDX、LBQ、WQD對膽鹽的耐受性較好，故在6 株受試菌株中，菌株FX6、WDX的益生性較好。綜合考慮比較兩菌株在極端環(huán)境的存活率，菌株FX6在pH 3.0環(huán)境培養(yǎng)3 h后存活率達(dá)到85.16%，在含0.3 g/100 mL膽鹽環(huán)境培養(yǎng)6 h后存活率達(dá)到96.07%，故推斷6 株明串珠菌中菌株FX6的益生性最好。

人體胃排空時pH值約為3.0，進(jìn)食后最低可達(dá)到1.5左右。人體腸道pH值一般為8.0，進(jìn)食后食物經(jīng)過小腸大概需要1～4 h，故一般實驗選擇能夠耐受酸和膽鹽的菌株作為待開發(fā)的益生菌株。益生菌能否耐受胃酸和膽鹽，是其能夠在腸道中存活下來并發(fā)揮益生功效的基本前提。趙小茜等[27]對4 株產(chǎn)多糖植物乳桿菌進(jìn)行耐酸耐膽鹽性能實驗，以期獲得耐酸耐膽鹽的菌株，并將其投入生產(chǎn)實踐中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 株植物乳桿菌在pH 3.5的條件下生長緩慢，而在pH 3.0和2.5的條件下幾乎不生長，而在0.3%的膽鹽環(huán)境下，3 株菌存活率達(dá)到65%以上。陳欣等[28]測定4 株人源乳酸桿菌耐酸耐膽鹽能力，結(jié)果表明4株乳酸桿菌能夠耐受pH 3的酸度（存活率6.6%～71.8%）和0.3 g/100 mL的膽鹽（存活率9.2%～31.8%）。楊曉宇等[29]對30 株不同來源乳酸菌進(jìn)行耐酸耐膽鹽實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LS和LJ2菌株在pH 2.0環(huán)境下的存活率分別為135%和124%，LZ1株在pH 3.0環(huán)境下的存活率為137%，LJ1株對豬膽鹽有較高耐受能力，LT株對牛膽鹽有較高耐受能力。不同來源的益生菌耐鹽耐膽鹽性能均有差異。明串珠菌要作為益生菌在人體腸道內(nèi)定植并發(fā)揮益生作用，就必須能夠耐受人體消化道中強(qiáng)酸和高膽鹽的極端環(huán)境。本實驗對豆醬分離篩選得到的6 株明串珠菌進(jìn)行耐酸、耐膽鹽性能比較，發(fā)現(xiàn)菌株FX6、WDX能夠在pH 3.0和含0.3 g/100 mL質(zhì)量濃度膽鹽的環(huán)境中良好生長。D’Angelo等[30]對奶制品中分離得到的29 株明串珠菌屬適應(yīng)食品中應(yīng)激性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)乳酸明串珠菌的應(yīng)激適應(yīng)性最好，其次是腸膜明串珠菌，而Leuconostoc pseudomesenteroides和檸檬酸明串珠菌展現(xiàn)出最弱的應(yīng)激適應(yīng)性。菌株MC3、LBQ和LBH經(jīng)鑒定為乳酸明串珠菌，菌株FX6、WDX和WQD為腸膜明串珠菌，但菌株MC3、LBQ和LBH的耐酸耐膽鹽性并沒有顯著優(yōu)于菌株FX6、WDX和WQD，與D’Angelo等[30]研究結(jié)果不完全一致。現(xiàn)在已經(jīng)可以通過技術(shù)手段利用腸溶膠囊等方法保護(hù)耐酸性弱的菌株通過胃部，故進(jìn)行菌株篩選時，更看重菌株對人體腸道環(huán)境的耐受性。本實驗中菌株FX6、WDX、LBQ、WQD對膽鹽的耐受性較好，均可以做更深入的研究。

明串珠菌廣泛分布于環(huán)境中，根據(jù)人們長期食用含有明串珠菌的食品歷史來看，可以合理認(rèn)為明串珠菌是安全的，而且目前沒有報道有人因食用明串珠菌發(fā)酵食品導(dǎo)致感染疾病[31]。但若將明串珠菌投入生產(chǎn)實踐，其安全性仍需進(jìn)一步分析鑒定，針對本實驗中得到的菌株FX6，仍需通過吲哚實驗、硝酸鹽還原酶實驗、氨基脫羧酶實驗、溶血實驗、D-乳酸檢測及質(zhì)粒提取實驗，確定菌株是否含有有害代謝產(chǎn)物及有無耐藥性[32]，從而鑒定菌株FX6的安全性。

3 結(jié) 論

本研究采用傳統(tǒng)分離純培養(yǎng)方法，從東北地區(qū)56 份傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬樣品中成功獲得了118 株明串珠菌疑似菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色，47株菌株為革蘭氏陽性小球菌，6 株菌株符合明串珠菌屬細(xì)菌的生理生化特征。采用16S rDNA序列鑒定法對菌株進(jìn)行種屬鑒定，結(jié)果顯示其中菌株MC3、LBQ、LBH被鑒定為乳酸明串珠菌，菌株FX6、WQD、WDX被鑒定為腸膜明串珠菌腸膜亞種ATCC 8293。利用比濁法測定并繪制6 株明串珠菌供試菌株的生長曲線，其中，菌株MC3的生長速度最快，菌株WQD的生長速度最慢。對所有菌株進(jìn)行酸和膽鹽耐受性實驗，結(jié)果顯示菌株FX6、MC3、WDX對酸的耐受性較好，菌株FX6、WDX、LBQ、WQD對膽鹽的耐受性較好。綜合考慮，菌株FX6的益生性最好，在pH 3.0環(huán)境培養(yǎng)3 h后存活率可達(dá)85.16%，在含0.3 g/100 mL膽鹽環(huán)境培養(yǎng)6 h后存活率高達(dá)96.07%。接下來，對菌株FX6的安全性仍需做進(jìn)一步的分析。