基于基因測序魚露發(fā)酵橘青霉YL-1鑒定及安全性評價

宋佳佳，古汶玉，林昌浩，張曉勇，甘忠宏，謝 莉，高向陽,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 514642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 514642）

真菌毒素是真菌代謝產(chǎn)生的次級天然毒性物質(zhì)，主要包括黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素、赭曲霉毒素、棒曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、青霉毒素等，它們幾乎能污染所有食用和飼用農(nóng)產(chǎn)品并對人類和動物健康造成巨大威脅[1-2]。橘青霉（Penicillium citrinum）是絲狀真菌，青霉屬，能作為發(fā)酵菌株[3]。青霉能產(chǎn)黃曲霉毒素和青霉毒素等真菌毒素[4]，易使果蔬作物致病[5]；部分青霉亦具有很高經(jīng)濟價值，如能產(chǎn)有機酸、制酶制劑、產(chǎn)青霉素等。由于青霉所具有的兩面性，其應(yīng)用備受爭議。

真菌菌株YL-1是從中國潮汕傳統(tǒng)釀造魚露中分離的一株耐鹽、高產(chǎn)蛋白酶菌株[6-7]，經(jīng)多方鑒定為P. citrinum，其能有效縮短魚露發(fā)酵時間，能促進魚露風(fēng)味形成[8]，但P. citrinum YL-1是否能產(chǎn)真菌毒素鮮見報道?；驕y序技術(shù)可為真菌毒素研究提供一種便捷手段，能評估預(yù)測真菌潛在的毒素代謝途徑和基因。吳榮等[9]運用基因測序技術(shù)對華根霉進行基因組測序，對基因序列進行功能注釋及代謝分析，顯示華根霉中僅存在少量聚酮合成、萜類化合物合成途徑代謝基因，并未注釋到根霉素、小孢根霉素及典型絲狀真菌毒素的合成關(guān)鍵基因，且存在大量異源物質(zhì)降解途徑基因，表明華根霉基本不具備產(chǎn)目前已知的真菌毒素的關(guān)鍵基因或合成能力。對低滲及高滲壓條件下的茯磚茶發(fā)酵黑曲霉進行基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序，基因功能注釋及聯(lián)合代謝分析均未檢測到與致癌物產(chǎn)生有關(guān)的基因簇，從基因水平和轉(zhuǎn)錄水平驗證了茯磚茶發(fā)酵黑曲霉的安全性[10]。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展及完善，菌株基因測序越來越常態(tài)化，這為工業(yè)菌株的安全評價提供了一種可靠模式。

本實驗通過分析P. citrinum YL-1基因組，主要針對非核糖體多肽合成代謝（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）、聚合酮酶代謝（polyketide synthase，PKS）、PKS-NRPS聯(lián)合代謝和萜類化合物代謝、氨基酸相關(guān)代謝等涉及產(chǎn)真菌毒素基因和途徑進行分析[11]，從基因水平判定P. citrinum YL-1安全性，彌補傳統(tǒng)手段針對真菌毒素檢測存在的缺陷。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

菌株YL-1由中國著名汕頭魚露廠所產(chǎn)魚露發(fā)酵液中分離[6]。

硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、氯化鉀、硫酸亞鐵（均為分析純） 廣州精科儀器試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷、瓊脂糖、Gold View染液、冰醋酸、乙二胺四乙酸 廣州生工生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ba600mot普通生物學(xué)顯微鏡 廣州匯騰科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀美國Bio-Rad公司；YA28X-4T/10高壓滅菌鍋 上海江霞閥門成套設(shè)備有限公司；SW-CJ-1G型單人凈化工作臺廣州瑞智設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株YL-1培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

察式培養(yǎng)基配制參考Xiao Yunzhu[6]、Xie Li[8]等方法，10%鹽度察式液體培養(yǎng)基在原基礎(chǔ)加入對應(yīng)濃度氯化鈉。菌株YL-1經(jīng)10%鹽度察式培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，菌體挑于顯微鏡下壓片觀察。

1.3.2 菌株YL-1分子生物學(xué)鑒定

參照ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM試劑盒提取菌株YL-1 DNA，依據(jù)霉菌通用ITS1/ITS4引物擴增YL-1菌株ITS基因序列。反應(yīng)體系共25 μL，包含Premix Taq 12.5 μL，ITS1及ITS4各1 μL，YL-1菌株DNA 1 μL，無菌水9.5 μL。95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 次循環(huán)，72 ℃延伸10 min。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果，并切取合適條帶進行純化，并送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序[6]。

依據(jù)BLAST軟件及GenBank數(shù)據(jù)庫比對測定菌株的ITS基因序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行分析，選取1 株雅致放射毛霉菌株（Actinomucor elegans strain QH23）及3 株霉菌模式種的ITS基因序列作為外群，采用MEGA 5.05軟件分析菌株YL-1系統(tǒng)發(fā)育，依據(jù)Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株YL-1的系統(tǒng)發(fā)育樹[6]。

1.3.3 菌株YL-1保藏

菌株YL-1鑒定為P. citrinum，經(jīng)廣東省微生物研究中心再次鑒定后保藏。

1.3.4 菌株P(guān). citrinum YL-1樣品制備及測序

10%鹽度察式液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株YL-1，菌液12 000 r/min離心10 min，獲得P. citrinum YL-1菌體，-80 ℃保藏送樣測序，菌株基因組survey測序由廣州美吉生物科技有限公司完成。

1.3.5 P. citrinum YL-1基因組掃描測序數(shù)據(jù)

P. citrinum YL-1委托廣州美吉生物科技有限公司應(yīng)用Illumina平臺HiSeq測序技術(shù)進行基因組survey測序，原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，對序列數(shù)據(jù)進行堿基質(zhì)控及數(shù)據(jù)質(zhì)量剪切及評估。運用SOAPdenovoV2.04組裝軟件對優(yōu)化序列進行拼接，再利用GapCloser v1.12軟件對組裝結(jié)果進行堿基校正及局部內(nèi)洞填充。對獲取的優(yōu)化序列進行包括rRNA/tRNA查找、重復(fù)序列篩選等生物信息分析；其他匹配基因相關(guān)信息獲取來自網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫公布數(shù)據(jù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.3.6 P. citrinum YL-1 survey測序基因預(yù)測與注釋

利用GeneMark軟件與Augustus軟件分析優(yōu)化序列，評估預(yù)測編碼區(qū)及基因，得到基因序列信息后上傳至NR、GO、Genes、String等數(shù)據(jù)庫并進行比對，從而獲得預(yù)測基因的注釋信息。

1.3.7 基因組比較

依據(jù)MUMmer工具包中Mummer程序比對P. citrinum YL-1基因組與其他典型的產(chǎn)真菌毒素菌的菌株的基因組信息，評估P. citrinum YL-1基因組產(chǎn)真菌毒素性能。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0進行初步處理；基因進化樹采用MEGA N-J法構(gòu)建，其他圖像采用Origin Pro 8.5、Adobe_Photo shop_CS5及Vision 2003處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 YL-1菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

如圖1所示，在顯微鏡下觀察菌株YL-1形態(tài)學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)分生孢子鏈為明顯的分散柱狀，大多分生孢子梗從基質(zhì)生出，梗壁平滑，少量從氣生菌絲生出，且長度較??；孢子近球形，大小2.5～3.2 μm，孢子壁圓滑；呈帚狀枝單輪生或雙輪生；每輪梗基3～5 個，大小為8.0～16×2.5～3.0 μm，頂端膨大，囊狀；中部瓶狀，梗頸短，大小為8.0～9.0×2.0～2.5 μm。在形態(tài)學(xué)上與青霉屬菌株相近。

2.2 YL-1菌株ITS基因序列的PCR擴增

1%瓊脂糖凝膠電泳顯示YL-1菌株ITS基因序列PCR擴增的DNA長度在500～750 bp之間，條帶清晰，亮度高。達到常規(guī)ITS基因序列鑒定要求。如圖2所示，經(jīng)測定，其DNA長度為bp。

圖2 菌株YL-1的ITS擴增序列電泳圖Fig. 2 PCR amplification of the ITS sequence of strain YL-1

2.3 菌株YL-1鑒定及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于ITS基因序列相似性構(gòu)建菌株YL-1系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed for strain YL-1 based on ITS gene sequence similarity

依據(jù)BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知模式霉菌序列對菌株YL-1的ITS序列進行同源性比對，結(jié)果表明，菌株YL-1與Penicillium同源性極高。構(gòu)建進化樹如圖3所示，菌株YL-1與P. citrinum處于同一分支上，且同源性高達99%，因此確定菌株YL-1為P. citrinum（P. citrinum YL-1，NCBI登錄號：KF544957）。

2.4 菌株YL-1保藏

菌株YL-1交由廣東省微生物菌株保藏中心再次鑒定為P. citrinum，鑒定結(jié)果與本實驗室鑒定結(jié)果一致；并對菌株進行保藏，保藏號GDMC60027，保藏方式為-80 ℃真空冷凍凍干。

2.5 P. citrinum YL-1基因組序列特性及分析

2.5.1 P. citrinum YL-1基因組測序拼接與注釋

P. citrinum YL-1測序結(jié)果表明其基因組大小在31.92 Mb左右，大小適中，GC含量為46.27%，屬于常規(guī)真菌GC含量范圍。對基因數(shù)據(jù)進行質(zhì)量分析發(fā)現(xiàn)1 000 bp以上基因組覆蓋率為99.51%。對測序后拼接片段進行基因預(yù)測與編碼區(qū)分析，共預(yù)測得編碼基因11 980 個，平均基因長度為1 349 bp。預(yù)測基因序列轉(zhuǎn)換成蛋白序列與多個數(shù)據(jù)庫NR、KEGG、COG/KOG、Genes、GO及String進行比對，獲得相應(yīng)功能注釋信息，最終被KOG注釋基因5 417 個，被COG注釋基因4 946 個，未被KOG/COG注釋1 289 個，KOG/COG注釋率高達86.5%，表明編碼基因質(zhì)量良好；被KEGG注釋基因3 525 個（表1）。P. citrinum YL-1基因組序列原始數(shù)據(jù)NCBI登陸號：SRR6322469。

表1 組裝及注釋結(jié)果統(tǒng)計Table 1 Genomic assembly and annotation statistics

2.5.2 P. citrinum YL-1基因功能KOGs分類

對菌株進行KOGs基因注釋與功能分類可進一步揭示菌株的生理代謝過程。P. citrinum YL-1基因功能可分為24 個功能組，如圖4所示，其中約13.38%預(yù)測為常規(guī)的功能基因分組；涉及分子功能的也較多，包括基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、翻譯、重組和核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成、翻譯后修飾及信號傳導(dǎo)機制，蛋白翻轉(zhuǎn)和分子伴侶、碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝及氨基酸運輸與代謝等，在250～400之間；而針對細胞保護、胞外結(jié)構(gòu)及核結(jié)構(gòu)注釋的基因較少，幾乎沒有注釋到細胞修飾相關(guān)的基因；約7.65%的預(yù)測基因由于蛋白質(zhì)功能不能確定，匹配性較差，所具備的生理功能尚不清楚，未能有良好匹配結(jié)果。而在次級代謝中，存在較多的降解途徑，主要涉及對芳香族類化合物、萜烯類化合物等，這與魚露發(fā)酵中豐富的風(fēng)味物質(zhì)形成可能相關(guān)，魚露在發(fā)酵初期優(yōu)勢菌經(jīng)分泌各種酶（主要為蛋白酶）水解魚體生成多種氨基酸、糖類，這些物質(zhì)通過一系列的變化進一步形成醛類、酮類、芳香族類及萜烯類化合物，構(gòu)成魚露發(fā)酵后期特殊的色澤、香氣，并最終賦予魚露特征滋味[12]；同時KOGs注釋也匹配到一些與藥物代謝的途徑，可能與青霉屬菌株具有產(chǎn)青霉素等同源性基因相關(guān)[13]。

圖4 P. citrinumYL-1預(yù)測基因KOGs分類Fig. 4 KOGs functional classi fi cation of predicted genes of P. citrinum YL-1

2.6 P. citrinum YL-1產(chǎn)真菌毒素相關(guān)代謝途徑分析

據(jù)報道，已有400多種真菌毒素相繼被發(fā)現(xiàn)，其中包含霉菌毒素300多種。對這些真菌毒素的產(chǎn)生途徑分析可知，大多毒素形成都需要通過PKS、NRPS等四大途徑及關(guān)鍵基因調(diào)控，極少部分通過氨基酸代謝等途徑產(chǎn)生[9]?；赑. citrinum YL-1基因組分析與基因注釋結(jié)果，分析涉及到的途徑及關(guān)鍵基因，可以從基因水平上評估P. citrinum合成真菌毒素的潛在可能性及產(chǎn)真菌毒素的能力。

2.6.1 非核糖體多肽類與聚酮代謝

大多數(shù)真菌毒素合成中的關(guān)鍵代謝途徑是非核糖體多肽類與聚酮代謝及混合代謝。在青霉屬中，多數(shù)真菌毒素也是由這些代謝途徑產(chǎn)生前體物質(zhì)，再經(jīng)過催化和后期修飾合成，典型的如黃曲霉毒素[14]、青霉素[15]等真菌毒素的前體物質(zhì)。另外在曲霉中也有報道PKS-NRPS是環(huán)匹阿尼酸生物合成的關(guān)鍵途徑[16]；紅曲霉被運用于我國傳統(tǒng)釀造工業(yè)中，研究發(fā)現(xiàn)少量紅曲霉也能產(chǎn)生毒素，并大多通過PKS途徑進行合成[17]。同樣在青霉中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)真菌毒素也主要是通過NRPS途徑、PKS途徑調(diào)控合成。如表2所示，僅注釋到一種能合成黃曲霉毒素的基因簇基因Alfd（去氧松酸酮還原酶）及其他5 種相關(guān)基因：乙酰輔酶A羧化酶基因Acac、葡萄球菌8-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因Mota 2 個、去甲基海馬膽囊素6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因Motb 2 個（KO：00254）。在黃曲霉合成基因簇的基因中，pksL、Alfc、pksA為合成關(guān)鍵基因，LaeA為全局調(diào)控因子，在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)至關(guān)重要；而Af l R和Af l r這2 個基因?qū)S曲霉毒素合成基因簇中的特異性轉(zhuǎn)錄因子起到了十分重要的作用，除Af l J外其他基因均受到Af l R基因的調(diào)控[18]。雖注釋到一種能合成黃曲霉毒素的基因簇同源基因Alfd，但其他黃曲霉合成基因簇同源基因并未注釋，特別是調(diào)控基因LaeA及aflR基因等；且Alfd基因主導(dǎo)的黃曲霉毒素代謝途徑尚不完整，缺乏關(guān)鍵的基因Pksa、Alfc、pksA，注釋到的黃曲霉毒素合成基因Alfd同源性僅為81%，相似性不高。因此以目前的數(shù)據(jù)不認為P. citrinum YL-1在魚露發(fā)酵過程中存在產(chǎn)真菌毒素的PKS途徑。

表2 注釋涉及產(chǎn)真菌毒素四大途徑及其他代謝Table 2 Annotation of the 4 key biosynthetic pathways and related genes as well as other metabolites

對于NRPS途徑，僅注釋到微囊藻毒素合成途徑中的一種天冬氨酸消旋酶McyF相關(guān)基因（KO：01054），表明P. citrinum YL-1基本不存在產(chǎn)生真菌毒素的NRPS途徑。PKS-NRPS聯(lián)合代謝途徑一般存在于共生菌中，如小孢根霉素及根霉素是由根霉Rhizopus microsporus內(nèi)共生菌Burkholderia屬菌所產(chǎn)生，在根霉屬（Rhizopus spp.），有存在內(nèi)共生細菌的報道[19]，也有報道提及Aspergillus也可能作為紅曲霉的內(nèi)生菌[20]，但目前在P. citrinum相關(guān)研究中鮮見報道。

圖5 17-mer雜合率評估Fig. 5 Evaluation of 17 mer hybrid rate

圖6 P. citrinumYL-1測序深度與GC含量相關(guān)性分析（以10 000 bp為標(biāo)準(zhǔn)）Fig. 6 Correlation analysis between sequencing depth and GC content of P. citrinum YL-1 (Standardized by 10 000 bp)

對P. citrinum YL-1菌株雜合率、測序深度與GC含量關(guān)聯(lián)分析來考察P. citrinum YL-1測序序列信息的質(zhì)量情況，來判斷在P. citrinum YL-1基因組測序數(shù)據(jù)中是否存在其他菌種（內(nèi)共生菌）基因序列。對菌株雜合率進行分析，運用K-mer頻率分布統(tǒng)計確定，如圖5所示。P. citrinum YL-1的雜合率遠低于0.1%，雜合率低。這一結(jié)果和送樣菌株檢測與P. citrinum同源性極高的結(jié)果相吻合。由圖6可知，GC含量和覆蓋率數(shù)據(jù)相對集中，不成分散狀態(tài)，GC含量在44%～56%之間。雜合率、測序深度與GC含量關(guān)聯(lián)分析表明P. citrinum YL-1菌株不存在共生菌。吳榮等[9]在華根霉全基因組數(shù)據(jù)時，通過雜合率分析排除了華根霉產(chǎn)共生菌的可能性，也是基于此種分析。在基因注釋結(jié)果中，也未發(fā)現(xiàn)PKS-NRPS混合代謝途徑，表明P. citrinum YL-1不存在PKS-NRPS混合代謝合成途徑。

2.6.2 萜類化合物代謝途徑

真菌毒素也可能由萜類化合物代謝產(chǎn)生，如典型的單端孢霉烯族毒素，此類毒素主要是由Fusarium、Stachybotrys和Myrothecium等真菌屬產(chǎn)生[21-23]。目前已有200多種單端孢霉烯族毒素被報道。它的合成機理是先經(jīng)過萜類化合物代謝生成前體物質(zhì)，再經(jīng)法尼基焦磷酸環(huán)化為萜類物質(zhì)，在這一過程中乙酰轉(zhuǎn)移酶和多個C15細胞色素P450單加氧酶起到關(guān)鍵調(diào)控作用，并有轉(zhuǎn)運蛋白參與合成[21]。但并不是所有的萜類物質(zhì)都均有毒性，相反還具有一定的生理活性，如名貴中草藥靈芝三萜[24]、角鯊烯[25]等對人類許多疾病的預(yù)防和治療有顯著療效。

P. citrinum YL-1基因組次級代謝部分KEGG注釋（圖4），P. citrinum YL-1基因組有40 個基因注釋到萜類化合物代謝中（KO：0013、00900、00909、00904），包括15 個有關(guān)萜類化合物降解的基因，他們主要分布在輔酶Q和其他萜類-醌類化合物代謝途徑中，參與生育酚、質(zhì)醌等物質(zhì)的合成；在萜類物質(zhì)合成骨架結(jié)構(gòu)注釋到20 個基因，三萜和倍半萜合成途徑注釋到4 個基因，二萜化合物合成途徑僅注釋到1 個基因（表2），這些結(jié)果表明P. citrinum YL-1有合成萜類物質(zhì)的潛在可能性，但并不意味能合成真菌毒素。代謝通路關(guān)聯(lián)分析表明，戊磷酸代謝后產(chǎn)物能間接作用于輔酶Q和其他類萜醌合成，并進入倍半類萜和三萜化合物代謝途徑，參與角鯊烯三萜化合物的合成；而對于二萜合成途徑，僅注釋到一個赤霉素雙氧酶基因，二萜化合物的合成不成完整途徑，赤霉素雙氧酶也不屬于真菌毒素物質(zhì)合成關(guān)鍵酶[26]，故此注釋途徑無法形成產(chǎn)生真菌毒素相關(guān)的通路。綜上表明P. citrinum YL-1不存在合成毒性萜類化合物的途徑，反而注釋到角鯊烯合成的完整途徑，這為P. citrinum YL-1的研究及綜合開發(fā)利用提供一個良好的契機。作為中國傳統(tǒng)魚露發(fā)酵中的重要產(chǎn)酶菌株，經(jīng)過長時間的微生物菌群演變，P. citrinum YL-1能在高鹽環(huán)境中脫穎而出，可見其具有多方面的應(yīng)用價值。

2.6.3 其他次級代謝途徑

P. citrinum YL-1還存在其他大量次級代謝途徑（圖4），其中注釋到的部分細胞色素P450不僅是萜類化合物代謝的關(guān)鍵酶，許多還是藥物代謝、異源物質(zhì)代謝等藥物代謝過程中的關(guān)鍵酶[21]。相對來說，P. citrinum YL-1個別的基因與酶注釋到青霉素、鏈霉素、新生霉素等抗生素合成途徑，但并沒有完整的代謝通路（KO：00521、00401、00311），暗示P. citrinum YL-1可能存在合成青霉素、鏈霉素、新生霉素等抗生素的潛在性（表2）。這與P. citrinum YL-1存在于魚露發(fā)酵生產(chǎn)，在長時間多菌相發(fā)酵中能強勢生長的情況存在關(guān)聯(lián)，高鹽及P. citrinum菌株可能分泌的抗生素對其他微生物有抑制作用，而P. citrinum本身對鹽度有高度的耐受性[6]。除了以上四大途徑，部分真菌毒素還能由氨基酸合成或協(xié)助合成，但注釋到的氨基酸代謝途徑僅參與了質(zhì)醌、生育酚、維生素等物質(zhì)的合成，這與測序基因組中RNA查找的某些轉(zhuǎn)運氨基酸個數(shù)的多少可能存在一定聯(lián)系，如圖7所示；注釋途徑關(guān)聯(lián)分析中并沒有發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝流向真菌毒素產(chǎn)生途徑的趨勢，表明P. citrinum YL-1存在氨基酸代謝產(chǎn)生真菌毒素的可能性極小。由目前報道可知，雖可能還存在真菌毒素產(chǎn)生的其他途徑，但幾乎均由上述幾大類代謝途徑單個或多個協(xié)同作用產(chǎn)生，如在對Aspergillus ustus和A. terreus研究中發(fā)現(xiàn)聚酮代謝同萜類化合物代謝混合作用能產(chǎn)生Austin[27]與Austinol[28]?；谝陨戏治霰砻鳎赑. citrinum YL-1中，僅注釋到黃曲霉毒素的合成途徑，但其合成途徑并不完整，并不存在其他典型真菌毒素合成的完整代謝途徑，相反注釋到的藥物代謝途徑可能對部分毒素還存在降解能力，但并不能完全排除P. citrinum YL-1產(chǎn)真菌毒素的可能性。

圖7 P. citrinumYL-1注釋tRNA氨基酸種類統(tǒng)計圖Fig. 7 The types and amounts of tRNA amino acids annotated in P. citrinum YL-1

3 討 論

魚露在我國食用歷史悠久，其味道滋潤鮮美，香氣宜人，且營養(yǎng)價值高，富含各種必需氨基酸、多種有機酸和微量元素，并且還富含?；撬幔虼藦V受人們喜愛。菌株YL-1是從魚露發(fā)酵液中分離出的一株真菌，具有耐鹽及高產(chǎn)蛋白酶的特性，本研究對菌株YL-1進行生物學(xué)及分子學(xué)鑒定其為P. citrinum，與實驗室前期研究結(jié)果高度一致[6]。利用菌株基因組survey測序信息從基因水平上分析P. citrinum YL-1產(chǎn)毒素的潛在能力，相對驗證了該菌株的安全性，與傳統(tǒng)菌株毒理性的研究相比，其簡單便捷。全基因survey測序顯示P. citrinum YL-1基因組大小為31.92 Mb，與大多數(shù)真菌的基因含量相吻合；GC含量為46.27%，屬于常規(guī)物種的水準(zhǔn)，表明測序結(jié)果良好。初步注釋基因11 980 個，主要注釋基因分布在糖酵解、氨基酸代謝及碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝等途徑，其次在核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成、翻譯后修飾、信號傳導(dǎo)機制等途徑也存在大量注釋基因，另外在分子伴侶和蛋白翻轉(zhuǎn)、氨基酸運輸與代謝等也存在較多注釋基因，注釋基因功能覆蓋面較為全面，能良好代表P. citrinum YL-1實際生物信息。通過基因注釋信息與特異序列比對可知，在P. citrinum YL-1中，不存在目前已報道的青霉毒素和其他典型真菌毒素關(guān)鍵代謝途徑；可能存在1 種產(chǎn)黃曲霉毒素的同源性基因Afld及其他5 種相關(guān)基因，但并未注釋到其完整通路，顯示P. citrinum YL-1在基因水平上幾乎不產(chǎn)真菌毒素，與吳榮等[9]基于基因組測序數(shù)據(jù)對華根霉產(chǎn)真菌毒素進行分析的方法及結(jié)果相似。在對魚露發(fā)酵不同時期的菌相做分析時，也發(fā)現(xiàn)有黃曲霉的存在，因此，對魚露中是否含有黃曲霉毒素以及它的合成代謝來源還應(yīng)做進一步分析。

由于仍有很多真菌毒性物質(zhì)的產(chǎn)生途徑及基因沒有被挖掘和分析，或者仍有一些毒素的產(chǎn)生機理并不屬于以上四大途徑，亦或未在各數(shù)據(jù)庫中公布，所以并不能完全排除P. citrinum YL-1不產(chǎn)真菌毒素的可能性?？山Y(jié)合當(dāng)前動物實驗、儀器檢測[29]或探針免疫技術(shù)[30]等其他技術(shù)對P. citrinum YL-1安全性進行綜合性評價。在對P. citrinum YL-1溶血性實驗中，以洛克福青霉P. roqueforti NL-1為陰性對照，結(jié)果顯示P. citrinum YL-1作用小鼠血液后沒有出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，表明P. citrinum YL-1對小鼠紅細胞沒有毒害作用，這與從基因水平上分析P. citrinum YL-1不產(chǎn)毒素的結(jié)果相吻合，在現(xiàn)有的數(shù)據(jù)上進一步佐證了P. citrinum YL-1運用于魚露及相關(guān)產(chǎn)品的發(fā)酵相對是安全的，但也不能絕對排除P. citrinum YL-1不產(chǎn)毒素的特性，P. citrinum YL-1應(yīng)用于魚露發(fā)酵的安全性仍值得進一步關(guān)注考察。