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    不同發(fā)酵方式制備沙丁魚下腳料速釀魚露

    2021-12-27 01:25:50趙帥東尹軒威劉宇楊梓璐劉婷周婉婷陳雨瀅汪立平寧喜斌
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年23期
    關鍵詞:下腳料魚露發(fā)酵法

    趙帥東,尹軒威,劉宇,楊梓璐,劉婷,周婉婷,陳雨瀅,汪立平,2,3*,寧喜斌*

    1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306) 2(農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海,201306) 3(上海海洋大學 食品熱加工工程技術研究中心,上海,201306)

    沙丁魚是我國重要的經濟魚類,加工過程中大約產生30%的下腳料,主要包括頭、內臟、皮和尾等。目前,只有小部分沙丁魚下腳料被用于制作魚粉和動物飼料,大部分被丟棄。這些下腳料含有豐富的有價值的生物材料,如蛋白質、脂類和酶。因此,有必要將這些下腳料轉化為高附加價值產品。

    魚露是利用價格低廉的魚蝦或水產品加工中的下腳料,加入30%~40%的鹽,在太陽下暴曬發(fā)酵1~2年得到的產品[1]。因此,可以利用沙丁魚下腳料來制備魚露,這樣不僅能減少環(huán)境污染問題,還能夠提高沙丁魚下腳料的經濟價值。不過,傳統魚露的發(fā)酵的周期長,生產效率低,不利于工業(yè)化。因此,縮短魚露的發(fā)酵周期,提高企業(yè)的生產效率一直是研究的重點。目前,縮短魚露的發(fā)酵周期的主要方法包括:保溫法、外加酶、外加曲法以及微生物發(fā)酵法。LOPETCHARAT等[2]發(fā)現把太平洋鱈魚的發(fā)酵溫度提高到50 ℃時,其發(fā)酵15 d時發(fā)酵液中總氮的含量與商品魚露相一致。李勇等[3]以鯽魚為原料,采用復合酶解的方法,先加胰蛋白酶后加入木瓜蛋白酶,得到的成品魚露的各項指標達到了國標要求,有效地縮短了生產周期。白政澤等[4]采用加曲適量保溫的方式生產魚露,發(fā)酵30 d得到了一級魚露。YONGSAWATDIGUL等[5]從泰國魚露的發(fā)酵過程中分離出來了Virgibacillussp.SK33,并以此作為細菌發(fā)酵劑,能夠把魚露的發(fā)酵時間由12個月降低到4個月。本研究采用4種發(fā)酵方式制備魚露,通過監(jiān)測發(fā)酵過程中理化指標探討每一種發(fā)酵方式的優(yōu)缺點,旨在為水產品加工下腳料的高值化利用提供思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    沙丁魚下腳料(魚頭、魚尾、魚骨和內臟等),由寧波佳必可食品有限公司提供,使用前置于冰箱-20 ℃冷凍備用。傳統發(fā)酵的商業(yè)一級魚露,山東威海某公司;復合蛋白酶(1.5 AU/g)、風味蛋白酶(500 LAPU/g),諾維信(中國)生物技術有限公司;曲霉菌YL001、貝萊斯芽孢桿菌S2(BacillusvelezensisS2),本研究室保藏;種子培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉10,牛肉膏5 g,NaCl 50 g;其他化學試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

    JYSA800型絞肉機,九陽股份有限公司;PHS-3C型 pH 酸度計,上海儀電科學儀器股份有限公司;Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀,丹麥福斯分析儀器公司;H2050R型高速冷凍離心機,湖南湘儀離心機儀器有限公司;SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;7200可見分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司;數顯式恒溫水浴鍋,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;SPME手柄與萃取頭,美國Supelco公司;7890 N/5975C氣質聯用儀,美國Agilent公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 沙丁魚下腳料魚露的制備

    冷凍的沙丁魚下腳料在流水中解凍1 h后,用絞肉機將其斬拌成魚糜,然后與蒸餾水按1∶1(g∶mL)的比例混合,并裝在1 000 mL玻璃罐中,接著用4種發(fā)酵方法制備魚露(如圖1)。

    圖1 沙丁魚下腳料制備魚露流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of fish sauce from sardine by-products

    (1)雙酶酶解法。先加質量分數0.5%(酶/魚糜)的復合蛋白酶,在50 ℃水浴2.5 h,再加入質量分數0.7%(酶/魚糜)風味蛋白酶,在55 ℃繼續(xù)水浴2.5 h,最后加入質量分數15%的鹽(鹽/混合物)后,發(fā)酵后所得魚露為魚露A。

    (2)雙酶酶解與發(fā)酵劑復合發(fā)酵法。將前期從自然發(fā)酵魚露篩選得到的1株產蛋白酶的貝萊斯芽孢桿菌S2,接到種子培養(yǎng)基(60 mL/250 mL),37 ℃、80 r/min振蕩培養(yǎng)20 h。然后通過雙酶酶解得到酶解液,加入魚糜質量5%的貝萊斯芽孢桿菌S2種子培養(yǎng)液離心(8 000 r/min,4 ℃,15 min)后的得到菌體以及質量分數15%的鹽(鹽/混合物),發(fā)酵后所得魚露為魚露B。

    (3)雙酶酶解與YL001曲復合發(fā)酵法。曲霉菌YL001是從醬油曲篩選出來的高產蛋白酶菌,YL001曲的制備參照白政澤等[4]方法。首先通過雙酶酶解得到酶解液,然后加入質量分數14%的YL001曲(曲/魚糜)以及質量分數15%的鹽(鹽/混合物),發(fā)酵后所得魚露為魚露C。

    (4)僅加YL001曲法。先在50 ℃水浴中自溶2.5 h,然后在55 ℃繼續(xù)水浴2.5 h,然后加入質量分數14%的YL001曲(曲/魚糜)以及質量分數15%的鹽(鹽/混合物),發(fā)酵后所得魚露為魚露D。

    為了得到更高品質的魚露,所有樣品都先在35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中保溫發(fā)酵30 d,然后在室溫(15~25 ℃)下發(fā)酵60 d。

    1.2.2 pH的測定

    用pH計直接測量魚露樣品的pH值。

    1.2.3 總酸及氨基酸態(tài)氮(amino acid nitrogen,AAN)含量的測定

    參考GB 5009.235—2016中甲醛滴定法。

    1.2.4 總氮的測定

    GB 5009.5—2016中的凱氏定氮法。

    1.2.5 揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)的測定

    參考GB 5009.228—2016的自動凱氏定氮儀法。

    1.2.6 揮發(fā)性化合物的鑒定

    魚露的揮發(fā)性成分的測定參考GAO等[6]方法。將5 mL過濾后的魚露樣品放入頂空進樣瓶,插入萃取頭于60 ℃下吸附30 min。再迅速插入進樣口,250 ℃下解吸5 min。

    GC色譜柱為HP-5MS柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:初始溫度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min的速度升溫至90 ℃,再以8 ℃/min的速度升溫至230 ℃,保持7 min。載氣He,流速1.0 mL/min。質譜離子源溫度 230 ℃,電子能量 70 eV;不分流進樣;質量掃描范圍m/z35~550。

    1.2.7 感官評價

    采用描述性定量分析(quantitative descriptive analysis,QDA)法對魚露樣品進行感官評價分析[7]。評價小組由9名研究生(5名男性和4名女性,年齡24~30歲)組成。在感官評價之前,先進行了魚露風味描述的一致認定和培訓。經過訓練的組員對不同風味的魚露(焦糖味、肉味、鮮味、酸味、苦味、魚腥味、氨味、腐臭味)進行評分。計分采用10分制,“1”分代表該風味完全沒有,“10”分代表該風味非常強烈。

    2 結果與分析

    2.1 不同發(fā)酵方法制備沙丁魚下腳料魚露過程中pH的變化

    如圖2所示,發(fā)酵過程中A、B、C和D 4種魚露的pH值的變化趨勢相似。它們的pH值均在發(fā)酵的前15 d升高,緊接著(除A外)pH值又逐漸下降。發(fā)酵過程中pH變化的原因是揮發(fā)性堿基氮類化合物及有機酸類化合物在不同的發(fā)酵階段生成量不同[7]。在發(fā)酵前期pH的上升可能是因為沙丁魚下腳料的蛋白質被降解成小分子的胺、氮等堿性物質含量比例較大所致,而后來pH下降可能是因為蛋白質被分解為氨基酸、多肽及脂肪等被分解為一些有機酸類化合物。發(fā)酵結束后,魚露A、B、C和D的pH值分別為6.34、6.23、5.90和5.78,差異顯著(P<0.05)。魚露C、D的pH值比魚露A、B的pH值低,這說明雙酶酶解與YL001曲復合發(fā)酵法及僅加YL001曲法能夠把原料的蛋白質、脂肪等物質分解更完全。

    圖2 魚露發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.2 Changes of pH during fish sauce fermentation process

    2.2 不同發(fā)酵方法制備沙丁魚下腳料魚露過程中總酸和AAN的變化

    發(fā)酵過程中總酸含量的變化如圖3所示??偹岷恐饕c蛋白質分解產生的氨基酸、胺類化合物以及發(fā)酵過程在產生的有機酸有關。由圖3可知,魚露A和B在發(fā)酵初期總酸略微下降,隨后趨于平穩(wěn);魚露C和D在發(fā)酵初期下降后,隨后酸度又增加,最后趨于平穩(wěn)。魚露C和D的總酸度比魚露A和B高,說明加入YL001曲促進了原料中的蛋白質及脂質的分解,導致酸類物質較高。魚露B的酸度高于魚露A的酸度,說明加入貝萊斯芽孢桿菌S2也能促進沙丁魚下腳料的分解,不過分解能力弱于YL001曲;魚露D的酸度高于魚露C的酸度,這可能是因為在加入商業(yè)蛋白酶后產生了較多的堿類物質。

    圖3 魚露發(fā)酵過程中總酸的變化Fig.3 Changes in total acids during fish sauce fermentation process

    AAN是一個衡量魚露質量的重要指標。我國魚露的行業(yè)標準SB/T 10324—1999《魚露》規(guī)定一級魚露AAN的含量應大于9.0 g/L,二級魚露AAN的含量應大于6.5 g/L;而日本CODEX STN 302—2011規(guī)定魚露AAN含量應大于總可溶性氮(total soluble nitrogen,TSN)含量的40%[8]。如圖4所示,4種發(fā)酵方法所制備魚露中的AAN的含量均隨著發(fā)酵時間的增加不斷地增加,在發(fā)酵的前30 d即保溫發(fā)酵過程中,AAN含量增加迅速,當進入室溫發(fā)酵后,AAN含量增加緩慢。AAN的含量變化代表著魚露中主要氨基酸濃度的變化,與魚中多肽和蛋白質降解的聯合作用有關[9]。

    圖4 魚露發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮(AAN)含量的變化Fig.4 Changes in conttent of amino nitrogen during fish sauce fermentation process

    在整個發(fā)酵過程中,雙酶酶解與YL001曲復合發(fā)酵法制備的魚露的AAN含量最高,其次是僅加YL001曲法,然后是雙酶酶解與發(fā)酵劑復合發(fā)酵法,最低的是雙酶酶解法。經過90 d的發(fā)酵,魚露A、B、C、D的AAN的含量分別為8.0、8.5、11.0及10.0 g/L,差異顯著(P<0.05)。魚露A和B達到了我國二級魚露的AAN標準,而魚露C和D達到了我國一級魚露的AAN標準。

    2.3 不同發(fā)酵方法制備沙丁魚下腳料魚露過程中TSN的變化

    TSN是另一個衡量魚露質量的重要指標,我國魚露的行業(yè)標準SB/T 10324—1999《魚露》規(guī)定,一級魚露TSN的含量應大于12.0 g/L,二級魚露TSN的含量應大于8.7 g/L;而日本CODEX STN 302—2011以及韓國規(guī)定,魚露TSN含量應大于10.0 g/L[8-9]。魚露樣品中TSN含量如圖5所示,與AAN的變化趨勢相似(圖4),都是隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加。這主要是因為沙丁魚下腳料中的蛋白質在原料所含的蛋白酶、添加的商業(yè)蛋白酶、YL001曲或者貝萊斯芽胞桿菌S2分泌的酶與一些微生物的降解的共同作用的結果[10-11]。在發(fā)酵的整個過程中,不同發(fā)酵方式所制備的魚露的TSN含量高低與AAN指標的趨勢完全一致。發(fā)酵結束,魚露A、B、C、D的TSN的含量分別為10.6、11.2、13.7及12.8 g/L,存在顯著性差異(P<0.05)。因此,結合AAN以及TSN的含量,可知魚露A和B為二級魚露,魚露C和D為一級魚露。

    圖5 魚露發(fā)酵過程中可溶性總氮(TSN)的變化Fig.5 Changes in total soluble nitrogen during fish sauce fermentation process

    經過3個月的發(fā)酵,雙酶酶解與YL001曲復合發(fā)酵法是所得魚露的質量最高;僅加YL001曲所得魚露的質量雖然低于雙酶酶解與YL001曲復合發(fā)酵法,但是也能夠達到我國一級魚露的標準,且不加商業(yè)蛋白酶能夠降低企業(yè)的生產成本,從而更有利于魚露的產業(yè)化;雙酶酶解與發(fā)酵劑復合發(fā)酵法所得魚露質量低于上面兩種發(fā)酵方式,得到了接近一級魚露標準的魚露產品;雙酶酶解法所得魚露質量是4種發(fā)酵方式中最低的,不過也達到了二級魚露標準,這為企業(yè)制造中低端的魚露產品提供了一種方法。

    2.4 不同發(fā)酵方法制備沙丁魚下腳料魚露過程中TVB-N的變化

    發(fā)酵過程中TVB-N含量的變化如圖6所示。在發(fā)酵的前30 d,TVB-N的含量均顯著增加,但是隨后緩慢增加。TVB-N,包括氨、三甲胺等揮發(fā)性堿性氮化合物,是衡量海產品新鮮度和變質程度的重要指標[12]。TVB-N的積累一般與原料的腐敗以及特定腐敗菌的生長有關系[13]。經過90 d的發(fā)酵,魚露A、B、C、D的TVB-N的含量分別為1.42、1.48、2.38和2.18 g/L。魚露A和B的TVB-N含量不存在顯著性差異(P>0.05),這說明加入貝萊斯芽孢桿菌S2后并不會使TVB-N的含量顯著增加,因此具有良好的應用前景。酶與YL001曲復合發(fā)酵法和僅加YL001曲法所得魚露產品的TVB-N含量相近,但是前兩種發(fā)酵方式的TVB-N含量顯著低于后兩種發(fā)酵方式(P<0.05),這是可能是因為加入YL001曲后,在水解蛋白質的過程中產生了一些揮發(fā)性堿類化合物,因此魚露A和B的安全性更高。

    圖6 魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的變化Fig.6 Changes in TVB-N during fish sauce fermentation process

    2.5 揮發(fā)性化合物的分析

    通過SPME-GC-MS檢測了發(fā)酵90 d后的魚露A、B、C、D以及傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露樣品的揮發(fā)性化合物,其中主要包括醛類、醇類、酮類、酯類、烴類、含氮化合物等。

    如增強出版附件表1所示,醛類物質在魚露A、B、C、D中的相對含量分別為47.19%、31.46%、33.89%和29.35%。醛類來自發(fā)酵過程中的脂質氧化,其中支鏈短鏈醛類或芳香族醛類可能是由氨基酸脫氨作用產生[14]。醛類一般具有令人愉快的氣味,而且由于醛類的閾值較低,所以醛類有助于形成發(fā)酵魚的獨特香味[15]。在傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露以及魚露A、B、C、D中均檢測到了3-甲基丁醛,而3-甲基丁醛被認為是魚露特有風味的來源[11],這說明4種發(fā)酵方式均能使沙丁魚下腳料魚露具有傳統發(fā)酵魚露的特征性風味物質。此外,魚露A、B、C、D中均檢測到了2-甲基丁醛,它被認為是魚露中重要的風味物質[15]。另外,在傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露和4種魚露中均檢出大量苯甲醛和苯乙醛,不過苯甲醛和苯乙醛對魚露氣味的影響不大。庚醛是魚腥味的主體成分[16],在4種魚露中均檢測到,傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露中沒有檢測到,這可能是因為商業(yè)魚露經過了脫腥處理。

    醇類物質閾值較高,它們通常不會影響魚露的整體氣味[5]。魚露D中檢測到了3-甲基-1-丁醇,這種物質通常與強烈的蘑菇和草的氣味有關[17],是大豆醬油中產生芳香作用的化合物[18],這說明魚露D的風味接近大豆醬油。1-辛烯-3-醇是不飽和脂肪酸的氧化產物,能產生類似蘑菇的氣味[17],這種物質僅在魚露B和魚露D中檢測出。酮類物質一般與微生物活動和脂類的氧化有關,具有高閾值,可能對魚露的氣味沒有貢獻,不過烯酮能增強魚的腥味。酯類物質在魚露A、B、C、D中的相對含量分別為8.12%、4.51%、11.84%和10.15%,傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露的酯類物質含量為20.16%。除了賦予水果花香的特性,酯類還能減弱或掩蓋不愉快的游離氨基酸衍生的氣味。

    4種魚露中均檢測到了含氮化合物,它主要來源于氨基酸和碳水化合物之間發(fā)生的美拉德反應或氨基酸的熱分解[16]。三甲胺是腥味物質的主要來源,在4種魚露中均檢測到,不過傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露中沒有檢測到。2-乙基呋喃的閾值較低,有助于產生青草味或者豆香味[16],魚露B和D中2-乙基呋喃的相對含量較高,豆香味較濃。烷烴類由于風味閾值較高,一般對風味沒有重要影響[19]。酸類物質對魚露的酸味有重要作用,在傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露中檢測出的4-甲基-戊酸具有刺激的酸味,在4種魚露中均未檢測到。不過,具有奶酪味的2-甲基丁酸僅在傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露中檢測到。另外,在傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露以及魚露A、B和C中均檢測到了二甲基二硫,它是造成魚露獨特氣味的有效化合物[5],這說明魚露A、B和C具有和傳統發(fā)酵魚露相近的風味。

    采用雙酶酶解法、雙酶酶解與發(fā)酵劑復合發(fā)酵法所得魚露產品的腥味較重,風味相對較差;采用雙酶酶解與YL001曲復合發(fā)酵法的腥味最輕、風味最佳,僅加YL001曲法所得魚露風味較接近于大豆醬油。雖然用4種發(fā)酵方式生產出的沙丁魚下腳料魚露不及傳統發(fā)酵魚露的風味濃郁,但已經具有傳統發(fā)酵魚露的特征性風味。

    2.6 感官評價

    4種魚露的感官評價如圖7所示,4種魚露的苦味、酸味、氨味、腐臭味得分都較低,這說明4種發(fā)酵方式所得魚露產品均無特別強烈或難聞的味道。魚露C和魚露D鮮味和焦糖味高于魚露A和B,這是因為加YL001曲后促進了原料中蛋白質等成分的降解,而其降解產物,如氨基酸、TSN等成分能夠促進魚露中鮮味和焦糖味的形成。另外,雖然與傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露相比4種魚露的風味和滋味較差,但是4種魚露的整體接受性良好,尤其是魚露C已經和傳統發(fā)酵的商業(yè)魚露質量相差不大。

    圖7 魚露樣品的感官評價Fig.7 Sensory evaluation of fish sauce samples

    3 結論

    本研究為了探索利用沙丁魚下腳料制作魚露的可能性,采用4種發(fā)酵方式來制備魚露。利用雙酶酶解與YL001曲復合發(fā)酵法所得的魚露樣品C的質量最高,風味最好,達到了一級魚露標準。僅用YL001曲法所得的魚露樣品D質量雖然低于前者,但是也達到了一級魚露標準,且不添加商業(yè)蛋白酶能夠極大的降低企業(yè)的生產成本,更有利于魚露的工業(yè)化。雙酶酶解與發(fā)酵劑復合發(fā)酵法所得的魚露樣品B的質量接近于一級魚露,其安全性更好,因此有良好的應用前景。雙酶酶解法所得魚露A的質量最低,但也達到了二級魚露。4種發(fā)酵方式所得的魚露產品通過GC-MS均檢測到了3-甲基丁醛、2-甲基丁醛等魚露特征性風味物質,感官評價也表明魚露產品均富有傳統發(fā)酵魚露固有的鮮美滋味。因此雖然4種發(fā)酵方式各有優(yōu)缺點,但均能利用沙丁魚下腳料來生產魚露。

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