青稞大曲微生物菌群的多樣性及其核心菌群的判定

黃和強(qiáng),車(chē)富紅,陳占秀,祁萬(wàn)軍,孔令武,李善文,馮聲寶*

1(中國(guó)青稞酒研究院,青海 互助,810500) 2(青?；ブ囡乒煞萦邢薰?青海 互助,810500)

大曲是中國(guó)傳統(tǒng)白酒釀造中特有的關(guān)鍵糖化發(fā)酵劑,主要包括菌系、酶系和物系,菌系和酶系是生成乙醇和復(fù)雜風(fēng)味化合物產(chǎn)生的必要條件,物系為釀酒提供部分發(fā)酵原料和風(fēng)味形成的前體物質(zhì)[1],它們質(zhì)量的好壞直接決定著酒的產(chǎn)率和品質(zhì),素有“曲為酒之骨”之說(shuō)[2]。青稞酒以青稞為原料,中低溫青稞大曲為糖化發(fā)酵劑,采用固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)蒸餾取酒,是中國(guó)白酒釀造中唯一采用曲糧合一的傳統(tǒng)工藝,具有清蒸清燒四次清、花崗巖窖池發(fā)酵的工藝特點(diǎn)。

大曲的制作是開(kāi)放式的混菌發(fā)酵,在自然發(fā)酵過(guò)程中富集了環(huán)境中的大量微生物,微生物群落結(jié)構(gòu)及其演變對(duì)于大曲制作的過(guò)程條件把控和最終曲的質(zhì)量具有重要作用。王鵬等[3]根據(jù)風(fēng)味貢獻(xiàn)程度、相互作用關(guān)系強(qiáng)度和相對(duì)豐度確定Lactobacillus、Saccharomyces、Candida、Rhizopus、Saccharomycopsis、Pichia、Dipodascus、Bacillus、Thermoascus和Lactococcus等 10 個(gè)屬為濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程的核心微生物群。WANG 等[4]借助高通量擴(kuò)增子測(cè)序解析濃香型白酒酒醅、大曲和窖泥原核微生物群落結(jié)構(gòu)差異,判定發(fā)酵酒醅微生物主要來(lái)源。同時(shí),大曲原料的配比、質(zhì)量的優(yōu)劣以及不同的工藝技術(shù)方法,對(duì)大曲的類(lèi)別和質(zhì)量有很大的影響。目前對(duì)于青稞酒的研究主要集中在釀造微生物及原酒風(fēng)味組分[5],對(duì)青稞大曲制作過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)及其群落演變并不太清楚,解析青稞大曲制做過(guò)程中微生物群落演替規(guī)律,判定制曲過(guò)程中核心功能微生物及其驅(qū)動(dòng)因子對(duì)于今后提升青稞大曲的質(zhì)量至關(guān)重要。王鵬[6]研究了濃香型白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中的核心微生物,通過(guò)核心功能微生物的強(qiáng)化應(yīng)用,提升了白酒釀造品質(zhì)的控制。本文通過(guò)高通量擴(kuò)增子測(cè)序解析3種不同配料大曲發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu),采用氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定大曲發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)樣品中的重要風(fēng)味化合物,并使用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)及群落演替與主要代謝物質(zhì)之間的網(wǎng)絡(luò)共線(xiàn)性關(guān)系,找出大曲發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物種群,為后期青稞大曲功能微生物的篩選及強(qiáng)化大曲品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)樣品取自某青稞酒廠兩種不同配料大曲,分別在制曲過(guò)程第 0、2、3、4、5、8、12、15和30 d(出房)取樣,于-20 ℃冰箱保藏備用。

1.2 試驗(yàn)試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、NaCl,國(guó)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑有限公司；異戊醇氯仿、乙酸鈉、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl snlfate,SPS)、飽和苯酚溶液,生工生物工程(上海)股份有限公司。

0.1 mm玻璃珠、0.5 cm玻璃珠,Sigma公司。

1.2.2 溶液配制

0.1 mol/L PBS緩沖液：0.05 mol/L Na2HPO4、0.042 3 mol/L NaH2PO4(精確稱(chēng)取8.19 g Na2HPO4和5.075 g NaH2PO4,加入去離子水定容至1 L,121 ℃高壓滅菌15 min,保存?zhèn)溆?。

Buffer Z溶液：10 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl(母液1 mol/L的Tris-HCl,精確稱(chēng)取12.1 g Tris加入到80 mL去離子水中,再加入4.2 mL濃鹽酸,定容至100 mL,pH 8.0,121 ℃高壓滅菌15 min保存?zhèn)溆?。

100 g/L SDS溶液：精確稱(chēng)取10 g SDS溶于去離子水中,定容至100 mL,121 ℃高壓滅菌15 min備用。

1.2.3 主要儀器

電子天平,Mettler-Toledo 公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司,Milli-Q 超純水系統(tǒng),美國(guó)Millipore 公司；607EUR珠磨儀,美國(guó)Biospec Products公司；Nano Drop—1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),核酸濃度檢測(cè)儀,美國(guó)賽默飛科技公司；GC6890 N-MSD5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大曲和酒醅理化指標(biāo)的測(cè)定

大曲和酒醅的水分、酸度、淀粉含量、糖化酶、淀粉酶和酯化酶等理化指標(biāo)均依據(jù)QB/T 4257—2011 方法測(cè)定,所有分析均以干重計(jì)。大曲溫度采用溫度計(jì)實(shí)時(shí)測(cè)定。酒醅溫度使用溫度計(jì)插入窖池1.2 m深處測(cè)定。

1.3.2 樣品中揮發(fā)性化合物含量的檢測(cè)

1.3.2.1 樣品的預(yù)處理

取5.000 g待測(cè)樣品,置于50 mL離心管中,加入去離子水20 mL,振蕩1 min混勻,冰浴超聲波30 min,再振蕩1 min,8 000 r/min離心5 min,取8 mL上清液置于裝有3 g NaCl的頂空瓶中。

1.3.2.2 GC-MS檢測(cè)

揮發(fā)性化合物的測(cè)定采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；Agilent 6890 N氣相色譜儀和Agilent 5975質(zhì)譜檢測(cè)器,色譜柱為DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm；J&W Scientific),內(nèi)標(biāo)為分析級(jí)薄荷醇(106.25 mg/L),檢測(cè)條件參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.3 樣本DNA 提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

稱(chēng)取7 g酒醅樣品,參照李小龍[8]等的方法提取樣品中的DNA。細(xì)菌用16S的V3-V4區(qū)引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增；對(duì)于真菌,用ITS2區(qū)引物ITS3(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增[8]。PCR 細(xì)菌擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)熱5 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s；72 ℃延伸40 s,共25個(gè)循環(huán),最后72 ℃ 保持10 min。真菌擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)熱2 min,95 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共32個(gè)循環(huán),最后72 ℃保持10 min。PCR產(chǎn)物根據(jù)已有的報(bào)道方法進(jìn)行純化[9]。純化后的產(chǎn)物用Nanodrop ND-1000 UV-Vis 定量,然后將PCR 產(chǎn)物等分子量混合,并根據(jù)Low Sample Protocol進(jìn)行文庫(kù)的制備,最后在 2×300 Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3.4 序列處理分析

對(duì)測(cè)序下機(jī)的原始序列進(jìn)行去除標(biāo)簽、引物和接頭序列及去除嵌合體等處理。然后把高質(zhì)量的序列根據(jù)97%的序列相似度聚成不同的操作性分類(lèi)單元(operational taxonomic unit,OTU)[8,10],并計(jì)算Chao1、shannon多樣性指數(shù)[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 主成分分析

根據(jù)高通量擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)不同取樣點(diǎn)微生物屬的相對(duì)豐度,借助SPSS 19.0進(jìn)行主成分分析,揭示大曲制作和酒醅發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的演替軌跡。

1.4.2 冗余分析

通過(guò)R語(yǔ)言的Vegan包計(jì)算制曲過(guò)程中環(huán)境因子和微生物群落之間的關(guān)系,分析環(huán)境因子對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響,并進(jìn)行蒙特卡洛置換檢驗(yàn)[12]。

1.4.3 網(wǎng)絡(luò)圖繪制

用SPSS軟件計(jì)算微生物與代謝物之間的Pearson相關(guān)系數(shù),找出相關(guān)系數(shù)顯著并且大于0.5的作為可視化對(duì)象[13]。使用Gephi軟件對(duì)大曲發(fā)酵過(guò)程中微生物和代謝物之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行可視化,判定與制曲過(guò)程中的核心微生物[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲過(guò)程微生物多樣性及菌群結(jié)構(gòu)

采用MiSeq 測(cè)序技術(shù)確定2種配料大曲制作過(guò)程中的微生物群落組成。通過(guò)質(zhì)控后,細(xì)菌得到1 064 488條高質(zhì)量的序列,平均每個(gè)樣本有(53 339±6 000)條；獲得6 735個(gè)OTUs,每個(gè)樣品得到(374±105)個(gè)OTUs。真菌質(zhì)控后共得到1 277 271條高質(zhì)量的序列,平均每個(gè)樣本具有(70 959±29 131)條；獲得4 665個(gè)OTUs,每個(gè)樣品得到(259±45)個(gè)OTUs。各樣品的覆蓋率均在99%以上,說(shuō)明樣本測(cè)序深度和數(shù)據(jù)質(zhì)量足夠可靠[15]。

比較了2種不同配料方案大曲發(fā)酵過(guò)程中微生物Chao1和Shannon指數(shù),如圖1所示,方案一[m(青稞)∶m(豌豆)=7∶3]大曲中原核微生物群落的Chao1和Shannon指數(shù)要低于方案二[m(青稞)∶m(豌豆) ∶m(小麥)= 5∶3∶2],2種方案大曲中真菌Chao1和Shannon指數(shù)沒(méi)有明顯的差異,表明2種不同方案細(xì)菌微生物多樣性差異顯著,真菌物種多樣性沒(méi)有明顯的差異。

a-細(xì)菌Chao1指數(shù)；b-細(xì)菌Shannon指數(shù)；c-真菌Chaol指數(shù)；d-真菌Shannon 指數(shù)圖1 不同配料大曲微生物組成多樣性分析Fig.1 Diversity analysis of microbial composition of Daqu with different ingredients注：方案一-m(青稞)∶m(豌豆)=7∶3；方案二-m(青稞)∶m(豌豆)∶m(小麥)=5∶3∶2 (下同)

基于OTU相對(duì)豐度的主成分分析表明(圖2),方案一和方案二在前期(0和5)細(xì)菌和真菌群落都較為相似,而從發(fā)酵第5天開(kāi)始,2種方案細(xì)菌群落演替軌跡比較相似,真菌群落演替出現(xiàn)明顯的分化。

a-細(xì)菌;b-真菌圖2 不同配料大曲制作過(guò)程中基于OTU水平的微生物群落的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of microbial community based on OTU level during the production of Daqu with different ingredients

利用高通量測(cè)序解析了不同配料大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)和組分,圖3為2種不同配料方案大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)和組分圖(OTU≥0.1%)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),真菌群落中0～4 d主要由Saccharomycopsis、Alternaria、Cladosporium主導(dǎo),從第4天開(kāi)始一直到出房,Saccharomycopsis逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì),同時(shí)Pichia和Wickerhamomyces具有一定的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于細(xì)菌,在整個(gè)過(guò)程中Pantoea占到絕對(duì)的優(yōu)勢(shì),Staphylococcus也具有很高的優(yōu)勢(shì),在2個(gè)方案中占比沒(méi)有明顯差異。總的來(lái)說(shuō),青稞大曲制作過(guò)程中真菌Pichia、Saccharomyces具有較高的優(yōu)勢(shì),Lactobacillus在發(fā)酵前期所占比例上升平穩(wěn),在發(fā)酵后期在酒醅中占主要地位。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,方案二的真菌結(jié)構(gòu)在后期發(fā)生了明顯變化,Issatchenkia比方案一又說(shuō)增加；在細(xì)菌組成上,方案二在發(fā)酵后期Lactobacillus的豐度比方案一高,說(shuō)明小麥的加入引起了方案二菌群結(jié)構(gòu)的變化。生產(chǎn)實(shí)際表明方案二大曲質(zhì)量總體評(píng)價(jià)好于方案一大曲,說(shuō)明一定量小麥的加入影響了大曲微生物群落結(jié)構(gòu)和演替,微生物組成變化是造成大曲質(zhì)量差異的主要原因。

a-細(xì)菌;b-真菌圖3 大曲在屬水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Distribution of microbial community at the genus level in Daqu during fermentation

2.2 制曲過(guò)程代謝物質(zhì)變化

在制曲過(guò)程中,方案一分析出風(fēng)味物質(zhì)有104種,包括35種醇類(lèi)、6 種酸類(lèi)、14種酯類(lèi)、4種吡嗪類(lèi)化合物；方案二130種,包括38種醇類(lèi)、11種酸類(lèi)、25種酯類(lèi)、7種吡嗪類(lèi)化合物(圖4)。整體上方案一風(fēng)味物質(zhì)總種類(lèi)低于方案二,2種方案酯類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)較豐富。通過(guò)化合物的相對(duì)含量的聚類(lèi)分析可看出(圖5),大曲中醇類(lèi)、醛類(lèi)、酚類(lèi)在出房時(shí)含量較高,醇類(lèi)占60%～80%,酸類(lèi)在培養(yǎng)至第4天時(shí)含量最高,后期降低明顯。酯類(lèi)含量也較高,培養(yǎng)前期占10%左右,4～15 d時(shí)降低,第21 天時(shí)又增加明顯,達(dá)到最高值。

a-方案一;b-方案二圖4 大曲培養(yǎng)風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)Fig.4 Types of flavor substances in Daqu culture

2.3 制曲過(guò)程核心微生物判定

選取在制曲過(guò)程中豐度在前15的細(xì)菌屬和前 15的真菌屬,計(jì)算這30個(gè)屬與61種代謝物之間的Pearson 相關(guān)系數(shù)(R),選取R>0.5 作為有效的網(wǎng)絡(luò)連接并繪圖(圖6)?？梢园l(fā)現(xiàn),細(xì)菌與代謝產(chǎn)物的連接數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真菌,與細(xì)菌相關(guān)的主要化合物是乙醛(V18、V19、V20、V21、V22)；與真菌相關(guān)的化合物主要有醇、酸、酯和吡嗪類(lèi),細(xì)菌屬Acinetobacter、Olivibacter只和吡嗪類(lèi)化合作的有顯著的相關(guān)性；另外,真菌與酮類(lèi)化合物的相關(guān)性較強(qiáng),其中絕大多數(shù)細(xì)菌與1-辛烯-3-酮(V27)和傘花烴(V17)有顯著的相關(guān)性；Lactobacillus、Pediococcus、Saccharomycopsis與醇、酸、酯都有顯著的相關(guān)性,Wickerhamomyces、Aureobasidium與醇、酯、吡嗪有一定的相關(guān)性。以上結(jié)果表明,在大曲發(fā)酵過(guò)程中與重要的代謝產(chǎn)物相關(guān)的細(xì)菌有Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus,真菌有Saccharomycopsis、Pediococcus、Wickerhamomyces和Aureobasidium,其中Acinetobacter、Olivibacter和Meyerozyma對(duì)吡嗪的貢獻(xiàn)較大。

圖6 微生物與代謝產(chǎn)物網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Network of microorganisms and metabolites

2.4 環(huán)境因子對(duì)制曲微生物的影響

環(huán)境因素會(huì)影響微生物的組成和分布,通過(guò)冗余分析解析了微生物與青稞大曲制作過(guò)程關(guān)鍵環(huán)境因子之間的關(guān)系(圖7),在制曲過(guò)程中與糖化和液化相關(guān)的微生物有Wickerhamomyces、Rhizopus、Aspergillus、Hypocreales、Ralstonia、Bacteria、Burkholderia、Bacillus；與產(chǎn)酸有關(guān)的微生物主要有Lactobacillales、Leuconostoc、Pediococcus、Lactobacillaceae、Lactobacillus、Enterobacteriaceae、Saccharomycetales；與氨態(tài)氮相關(guān)的微生物主要有Penicillium、Aspergillaceae、Microbotryomycetes、Fusarium、Acinetobacter、Bacillus。蒙特卡洛置換檢驗(yàn)的結(jié)果表明(表1),釀造過(guò)程中溫度、酸度和乙醇是影響不同季節(jié)中微生物群落組成差異的重要原因。

圖7 環(huán)境因子與大曲微生物之間的相關(guān)性Fig.7 Correlation between environmental factors and Daqu microorganisms

理化因子對(duì)制曲過(guò)程群落分布的解釋率為37.86%,游離氨態(tài)氮對(duì)微生物群的分布具有極顯著相關(guān)性(r2>0.5,P<0.001),說(shuō)明環(huán)境中的氮對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)演替有重要的推動(dòng)作用。環(huán)境因子變化與大曲微生物群落衍變有顯著地相關(guān)性,隨著原料中小麥含量增加,氨態(tài)氮含量變化會(huì)驅(qū)動(dòng)大曲中微生物群落衍變。

表1 微生物群與環(huán)境因子之間的蒙特卡洛置換檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Monte-Carlo permutation test of the core microbiota with environmental factors.

3 結(jié)論

2種不同配料大曲在制曲過(guò)程中真菌微生物菌群結(jié)構(gòu)存在差異性,方案二大曲中Lactobacillus和Issatchenkia的含量要高于方案一。初步確定青稞大曲的優(yōu)勢(shì)微生物屬細(xì)菌為Pantoea、Staphylococcus,真菌包括Pichia、Saccharomycopsis。通過(guò)微生物與代謝產(chǎn)物網(wǎng)絡(luò)可視化分析,初步判定在大曲發(fā)酵過(guò)程中與重要的代謝產(chǎn)物相關(guān)的微生物有Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Saccharomycopsis、Pediococcus、Wickerhamomyces、Aureobasidium。制曲過(guò)程中與糖化和液化相關(guān)的微生物有Wickerhamomyces、Rhizopus、Aspergillus、Hypocreales、Ralstonia、Bacteria、Burkholderia、Bacillus；與產(chǎn)酸有關(guān)的微生物主要有Lactobacillales、Leuconostoc、Pediococcus、Lactobacillaceae、Lactobacillus、Enterobacteriaceae和Saccharomycetales；與氨態(tài)氮相關(guān)的微生物主要有Penicillium、Aspergillaceae、Microbotryomycetes、Fusarium和Acinetobacter、Bacillus。這些菌很可能是青稞大曲制作過(guò)程中的核心微生物。在大曲制備過(guò)程中游離氨態(tài)氮對(duì)微生物群的分布具有極顯著相關(guān)性,隨著原料中小麥含量增加,氨態(tài)氮含量變化會(huì)驅(qū)動(dòng)大曲中微生物群落衍變。

本研究借助高通量測(cè)序方法解析了青稞大曲制作過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)和演替規(guī)律,初步判定了制曲過(guò)程中的核心微生物屬。同時(shí)分析了青稞大曲配料中適量加入小麥對(duì)大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)和大曲質(zhì)量的影響。但本研究只通過(guò)高通量測(cè)序解析了微生物群落結(jié)構(gòu),初步判定了制曲過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物屬,后續(xù)還需要結(jié)合釀酒過(guò)程中酒醅微生物變化,明晰大曲微生物對(duì)酒醅釀造微生物的貢獻(xiàn),為今后功能菌的篩選及強(qiáng)化大曲提供科學(xué)依據(jù)。