磺胺嘧啶分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及其快速檢測食品中磺胺嘧啶藥物殘留

趙玲鈺，秦思楠，高 林，高文惠*

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050000）

磺胺類藥物是一類應(yīng)用較普遍、效果良好的抗菌藥物，主要對革蘭氏陽性菌及一部分革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抑制作用，曾被廣泛用于人類腸道和呼吸道疾病的治療。長期以來，磺胺類藥物在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中起到較大作用，然而畜牧養(yǎng)殖業(yè)者對磺胺類藥物的不科學(xué)使用及濫用造成一些動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物嚴(yán)重超標(biāo)[1-2]。經(jīng)調(diào)查，畜禽養(yǎng)殖業(yè)中豬、牛及雞的磺胺類藥物使用量最大。因此，為保障人體健康，對該類畜禽肉中磺胺類藥物殘留的監(jiān)管及檢測不容忽視。我國對磺胺類及其增效劑的使用有比較明確的規(guī)定，GB 29694—2013《動(dòng)物性食品中13 種磺胺類藥物多殘留的測定》中給出畜禽肉類產(chǎn)品13 種磺胺類藥物的定量限為10 μg/kg[3]；SN/T 4057—2014《出口動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定》中規(guī)定出口類動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物的測定低限為0.003 mg/kg[4]；歐盟/470/2009中也明確規(guī)定，在所有動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留總量不能超過100 μg/kg[5]?；前奉愃幬镏凶罹叽硇?，且使用量最大、使用效果較好的是磺胺嘧啶，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 磺胺嘧啶結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of sulfadiazine

監(jiān)控磺胺類藥物殘留最好的方法是建立一種操作簡單、重復(fù)性好、靈敏度高的快速檢測方法。目前，食品中磺胺嘧啶藥物的檢測方法大多采用高效液相色譜法[6-7]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[8-12]以及免疫技術(shù)[13-14]等，然而，采用色譜法需要較為昂貴的分析儀器和專業(yè)技術(shù)人員，尤其存在樣品前處理過程繁瑣、有基質(zhì)干擾、對低含量的目標(biāo)物萃取效率低、樣品檢測成本高、難以實(shí)現(xiàn)快速檢測等缺點(diǎn)；而免疫學(xué)方法需要制備抗體，制備藥物抗體需要合成完全抗原并免疫動(dòng)物，周期長，且生物活性受多種因素影響而易于失活。近年來，傳感器法用于藥物的檢測以其檢測快速、操作簡單、價(jià)格低廉的特點(diǎn)越來越受到廣大科研工作者的關(guān)注[15-18]。分子印跡電化學(xué)傳感器將分子印跡聚合物選擇性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的優(yōu)勢與電化學(xué)傳感器特點(diǎn)相結(jié)合用于被分析物的檢測可以得到良好的效果，如果同時(shí)將納米材料例如納米金、多壁碳納米管等對電極進(jìn)行修飾可以提高方法的靈敏度[19]。另外，模板分子和功能單體的選擇、模板分子與功能單體比例的優(yōu)化，對傳感器的穩(wěn)定性和選擇性有著至關(guān)重要的作用，而紫外光譜法對于選擇功能單體及優(yōu)化模板分子與功能單體的比例起著重要作用。

目前，基于碳納米管及納米金溶膠（Au nano sol，AuNPs）修飾電極的磺胺類分子印跡電化學(xué)傳感器的制備鮮有報(bào)道[20]。由于磺胺嘧啶電活性差，直接采用電化學(xué)分析法測定磺胺嘧啶靈敏度很低，因此本研究采用分子印跡技術(shù)借助電活性探針間接對動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶或磺胺嘧啶鈉殘留進(jìn)行測定，即以磺胺嘧啶為模板分子，鄰氨基苯酚（o-aminophenol，OAP）為功能單體，引入紫外光譜法優(yōu)化二者比例，用羧基化多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube-COOH，CMWCNTs）和AuNPs以滴涂的方法修飾玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE），電聚合形成OAP聚合膜，制備了磺胺嘧啶分子印跡電化學(xué)傳感器，并將其應(yīng)用于食品中磺胺嘧啶殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豬肉、牛奶、雞蛋、鮮蝦 市售。

磺胺嘧啶鈉（純度98%）、磺胺甲基嘧啶（純度99.5%）、磺胺二甲基嘧啶（純度98%）、OAP（純度98%）、鹽酸多巴胺（dopamine hydrochloride，DHY）（純度98%）、殼聚糖（chitosan，CS）（脫乙酰度≥95%） 美國阿拉丁試劑有限公司；CMWCNTs德科島金科技有限公司；氯金酸（含金量47.3%） 南京試劑廠；檸檬酸三鈉、N,N-二甲基甲酰胺、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、醋酸、醋酸鈉、高氯酸、高氯酸鈉、乙腈、無水乙醇（均為分析純）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

LK98BII型電化學(xué)工作站 天津市蘭立科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；三電極系統(tǒng)（CHI104 GCE（直徑3 mm）、CHI115鉑絲電極、CHI111 Ag/AgCl電極）；拋光材料（氧化鋁粉、麂皮） 上海辰華儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 還原法制備納米金膠體

納米金的制備方法有多種，其中以水相中化學(xué)還原法最常用，化學(xué)還原法的原理是向一定濃度的氯金酸溶液中加入一定濃度還原劑，將金離子還原成金原子[21]。采用檸檬酸三鈉在水相中還原氯金酸制備AuNPs，先將1 g氯金酸標(biāo)準(zhǔn)品一次性溶于水中，將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中定容，配制成1%氯金酸溶液，再移至100 mL廣口瓶放置陰暗處保存；在室溫條件下參照Frens[22]的方法，在100 mL圓底燒瓶中加入50 mL水，向其中加入1%氯金酸溶液1 mL，120 r/min攪拌，并加熱至微微沸騰后迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液2 mL，控制溫度不變持續(xù)攪拌5 min，待溶液變?yōu)榫萍t色停止加熱，再持續(xù)攪拌至溶液冷卻至室溫，將制備好的AuNPs取出，在60 ℃水浴條件下將液體蒸發(fā)至25 mL，得到的AuNPs濃縮液移至棕色瓶中冷藏保存。AuNPs最佳吸收波長為520 nm。

1.2.2 納米金用量的優(yōu)化

采用滴涂法將A u N P s修飾到電極表面。將CS-CMWCNTs復(fù)合物10 μL滴涂到已處理好的GCE表面，然后將濃縮后的AuNPs滴涂到修飾了CS-CMWCNTs復(fù)合物的電極表面，晾干。實(shí)驗(yàn)采用DPV法分別考察0、2、4、6、8、10、12 μL AuNPs對電極的修飾效果。

1.2.3 CS-CMWCNTs/AuNPs復(fù)合物的制備

將0.2 g CS溶解在20 mL 1%的醋酸溶液中，磁力攪拌至CS完全分散在醋酸溶液中且氣泡全部消失，得到1%的CS溶液；將20 mg CMWCNTs粉末置于10 mL的N,N-二甲基甲酰胺中超聲30 min，得到CMWCNTs分散液；再將1% CS溶液與CMWCNTs分散液等體積混合，磁力攪拌5 min后超聲20 min得到CS-CMWCNTs復(fù)合物。取CS-CMWCNTs復(fù)合物10 μL及濃縮后所得AuNPs最佳劑量，二者混合得到CS-CMWCNTs/AuNPs復(fù)合物。

1.2.4 模板分子與功能單體的紫外光譜法測定

1.2.4.1 模板分子、功能單體及混合溶液紫外光譜掃描

分別配制1 mmol/L磺胺嘧啶鈉溶液、6 mmol/L 2 種功能單體（OAP、DHY）溶液。取5 支10 mL比色管，分別向其中3 支比色管中加入磺胺嘧啶鈉溶液200 μL、功能單體OAP溶液200 μL、DHY溶液200 μL；在另外2 支比色管中分別配制濃度比為1∶6的混合溶液：磺胺嘧啶鈉溶液與鄰苯二胺溶液各200 μL、磺胺嘧啶鈉溶液與DHY溶液各200 μL。用水將5 支比色管定容至10 mL，超聲10 min后，4 ℃冷藏靜置14 h，然后進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.2.4.2 模板分子與不同比例功能單體的紫外光譜掃描

分別配制1 mmol/L磺胺嘧啶鈉溶液、2 mmol/L 2 種功能單體（OAP、DHY）溶液。取10 支10 mL比色管，分成2 組，5 支為一組。分別向兩組比色管中加入磺胺嘧啶鈉溶液150 μL，按照模板分子與功能單體濃度比為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10向兩組比色管中分別加入功能單體OAP溶液和DHY溶液150、300、450、600、750 μL。用水將10 支比色管定容至10 mL，超聲10 min后，4 ℃冷藏靜置14 h，對配制的混合液進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.2.5 GCE的預(yù)處理

將GCE依次用0.5、0.3、0.05 μm粒度的氧化鋁粉在麂皮表面研磨拋光成鏡面后再依次用無水乙醇、水超聲清洗，氮?dú)獯蹈?，再將電極置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，用循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法掃描10 圈對電極進(jìn)行活化處理，以達(dá)到電極最佳狀態(tài)；取出電極再次用水沖洗后氮?dú)獯蹈?，然后將其置于?.5 mol/L KCl和5 mmol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的溶液中采用CV掃描。重復(fù)以上操作直至得到對稱且可逆的氧化還原峰，峰電位差在85 mV以下，最后取出電極待用[23]。

1.2.6 聚合條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)選取醋酸-醋酸鈉、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）、高氯酸-高氯酸鈉3 種常用的聚合電解質(zhì)溶液。分別考察功能單體OAP及磺胺嘧啶鈉在醋酸-醋酸鈉、PBS、高氯酸-高氯酸鈉溶液及不同pH值條件下的溶解情況、聚合性質(zhì)、成膜情況。在確定最佳電解質(zhì)溶液和pH值后，根據(jù)功能單體的成膜電位分別選取了0～1.3、0～1.5、0～1.7、-0.2～1.3、-0.2～1.5、-0.2～1.7 V電位范圍，采用差分脈沖伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法和CV法對聚合效果進(jìn)行考察。在其他條件相同的情況下，考察掃描圈數(shù)分別為5、10、15、20、25、30、40、50時(shí)，制備的聚合物膜對傳感器性能的影響。

1.2.7 傳感器的制備與洗脫

首先對預(yù)處理好的電極進(jìn)行修飾，取1 0 μ L CS-CMWCNTs復(fù)合物分2 次（每次5 μL）滴涂到打磨干凈的電極表面，隨后用同樣的方法將1.2.2節(jié)中選取的AuNPs最佳劑量滴涂到已修飾CS-CMWCNTs復(fù)合物的電極上，自然晾干，得到CS-CMWCNTs-AuNPs修飾電極；根據(jù)1.2.6節(jié)所得的最佳聚合條件，將上述電極置于聚合液中通過CV進(jìn)行電化學(xué)聚合，在CS-CMWCNTs/AuNPs修飾電極表面得到含模板分子磺胺嘧啶的OAP電聚合膜；取另一支打磨好的GCE作為非印跡電極，處理方法除在電聚合過程中不添加磺胺嘧啶鈉外，其余與上述方法完全一致。

聚合完成后，取出印跡電極，將電極分別置于甲醇-0.5 mol/L硫酸溶液（1∶4，V/V）、乙腈-0.5 mol/L硫酸溶液（1∶4，V/V）、甲醇-0.5 mol/L醋酸溶液（1∶4，V/V）中，對洗脫劑進(jìn)行優(yōu)化，在-0.2 V電位條件下進(jìn)行電位誘導(dǎo)洗脫模板分子，自然晾干，得到磺胺嘧啶鈉分子印跡電化學(xué)傳感器。

1.2.8 電化學(xué)測量

實(shí)驗(yàn)過程中，在室溫條件下用CV法和DPV法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件并表征電化學(xué)傳感器性能，將三電極系統(tǒng)置于電活性探針溶液中測量電極的電流響應(yīng)。測量參數(shù)如下：CV法，掃描電位和掃描速率分別為-0.2～0.8 V和50 mV/s；DPV法，起止電位為-0.2～0.6 V、電位增量0.004 V、脈沖寬度0.05 V、脈沖幅度0.05 V、脈沖間隔0.1 s。樣品測量時(shí)，每次測量后，將工作電極浸泡在甲醇-0.5 mol/L H2SO4（1∶4，V/V）溶液中電誘導(dǎo)洗脫，除去模板分子后用水沖洗電極，氮?dú)獯蹈?，再進(jìn)行下一次測量。實(shí)驗(yàn)采用計(jì)時(shí)電流法對模板分子進(jìn)行電位誘導(dǎo)洗脫，測量參數(shù)如下：掃描電位-0.2 V，階躍次數(shù)180，脈沖寬度2 s。

1.2.9 樣品處理

取2 g搗碎和混勻的樣品（豬肉、牛奶、雞蛋、鮮蝦）置于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈提取劑，渦旋振蕩混勻2 min，超聲提取10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，將剩余殘?jiān)尤? mL乙腈重復(fù)提取1 次，合并2 次上清液，用乙腈定容至10 mL待用[24-25]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Origin 8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以及圖形處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs修飾電極劑量的確定

圖2 AuNPs劑量的優(yōu)化曲線Fig. 2 Optimization of nano-gold sol dose

如圖2所示，在修飾劑量達(dá)到6 μL之前，峰電流值隨修飾劑量的增加逐漸增大；當(dāng)修飾劑量達(dá)到6 μL后，差分脈沖峰電流值不再增加，這是由于納米金顆粒在電極表面分布達(dá)到飽和，再增加AuNPs的修飾劑量也不會(huì)再增大電極的比表面積和催化性能[26]。因此實(shí)驗(yàn)將AuNPs的修飾劑量確定為6 μL。

2.2 功能單體選擇及功能單體與模板分子比例的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)合紫外光譜法對功能單體進(jìn)行選擇，并對模板分子與功能單體的作用機(jī)理進(jìn)行研究。如果模板分子與功能單體不發(fā)生作用則同一波長條件下紫外吸光度應(yīng)該是2 種物質(zhì)吸光度的加和，即混合物的理論吸光度（E2）；而模板分子與功能單體混合物的實(shí)際吸光度為該混合物在該波長條件下實(shí)測的紫外吸光度（E1）；而且實(shí)際吸光度與理論吸光度的差值越大，表明二者的相互作用越大[27]。

圖3 模板分子、功能單體及其混合物紫外吸收光譜Fig. 3 UV absorption spectra of template molecule, functional monomer and their mixture

由于磺胺嘧啶難溶于水，而磺胺嘧啶與磺胺嘧啶鈉主體結(jié)構(gòu)相同，其與常用功能單體的作用形式和作用位點(diǎn)相同，故用磺胺嘧啶鈉代替磺胺嘧啶進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。為了尋找合適的功能單體，根據(jù)模板分子磺胺嘧啶的結(jié)構(gòu)和特性，考察2 種常用的功能單體OAP和DHY對磺胺嘧啶的作用效果。由圖3可知，模板分子與2 種功能單體（OAP和DHY）的E2均高于E1，即理論吸光度大于實(shí)際測定值，說明模板分子與功能單體之間產(chǎn)生了相互作用。根據(jù)物質(zhì)結(jié)構(gòu)可以推斷，這種作用為氫鍵作用力，2 種功能單體與模板分子的混合溶液的最大吸收峰出峰位置均發(fā)生了變化，最大吸收波長發(fā)生了紅移。由圖3還可知，磺胺嘧啶與OAP、磺胺嘧啶與DHY其E2與E1的差值分別為2.5與1.3，即磺胺嘧啶與OAP的E2與E1的差值較大，這意味著二者之間結(jié)合力較大，穩(wěn)定性好，此為電聚合成膜提供了佐證和理論依據(jù)。因此選擇OAP作為本實(shí)驗(yàn)功能單體。

圖4 不同比例的模板分子和OAP預(yù)組裝體系最大吸收波長與吸光度變化趨勢Fig. 4 Maximum absorption wavelength and absorbance from different ratios between template molecules and OAP

實(shí)驗(yàn)結(jié)合紫外光譜法確定模板分子與功能單體二者比例。如果模板分子與功能單體混合物體系最大吸收波長對應(yīng)的吸光度變化趨于平緩時(shí)，說明混合物中模板分子與功能單體作用趨于穩(wěn)定，此時(shí)平緩區(qū)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)所對應(yīng)的混合物比例則擬定為二者的最佳比例[28]。如圖4所示，磺胺嘧啶與OAP對應(yīng)濃度比在1∶6～1∶10范圍之間混合物體系最大吸收波長對應(yīng)的吸光度波長變化趨于平緩。因此，可以推斷磺胺嘧啶與OAP最佳濃度比為1∶6。

2.3 聚合電解質(zhì)及其pH值的選擇

檢測所用電解質(zhì)溶液的種類及pH值對響應(yīng)信號的峰電流有顯著影響。通過1.2.7節(jié)中的不同電解質(zhì)對電極進(jìn)行聚合，結(jié)果表明，當(dāng)3 種聚合電解質(zhì)溶液在弱酸性（pH 5.5）條件下，OAP均能在修飾的電極表面形成致密的不導(dǎo)電薄膜，適合用于制備分子印跡電化學(xué)傳感器。實(shí)驗(yàn)隨后采用DPV法考察以上聚合電解質(zhì)溶液在相同聚合條件下聚合膜的響應(yīng)性能；結(jié)果表明，當(dāng)pH 5.5時(shí)，OAP在高氯酸-高氯酸鈉電解質(zhì)溶液中形成的聚合物膜最穩(wěn)定、絕緣能力最好，并在模板分子洗脫后電流響應(yīng)值最大，為113.3 μA，因此選擇pH 5.5的高氯酸-高氯酸鈉溶液為最佳聚合電解質(zhì)溶液。

2.4 聚合掃描電位和掃描圈數(shù)的選擇

由于聚合電位直接影響到修飾電極的洗脫效果，根據(jù)1.2.6節(jié)選取不同的電位對其進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)聚合電位為-0.2～1.7 V時(shí)模板分子洗脫較為困難，并且洗脫之后，氧化還原峰電流低；當(dāng)聚合電位為-0.2～1.5 V時(shí)，峰電位正移，且氧化還原峰電流低；當(dāng)聚合電位為-0.2～1.3 V時(shí)氧化還原峰電流值最大，且對稱良好，因此實(shí)驗(yàn)選擇-0.2～1.3 V為最佳電位。

圖5 聚合圈數(shù)對峰電流的影響Fig. 5 Effect of polymerization cycles on the peak current

采用DPV表征，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)掃描圈數(shù)為5～20 時(shí)，峰電流值隨掃描圈數(shù)的增加而減小，這是由于聚合圈數(shù)較少時(shí)，膜太薄，OAP聚合膜在洗脫過程中已被破壞，GCE表面全部暴露，峰電流較大，如果掃描圈數(shù)增大，則聚合膜厚增加，膜穩(wěn)定性增強(qiáng)，峰電流減?。浑S著掃描圈數(shù)的繼續(xù)增加，在掃描30 圈時(shí)峰電流值達(dá)到最大，此時(shí)膜的穩(wěn)定性處于最佳狀態(tài)，且洗脫后印跡位點(diǎn)數(shù)量最多；然而，掃描圈數(shù)繼續(xù)增加，峰電流值開始減小，這是因?yàn)榫酆先?shù)增加使OAP聚合膜結(jié)構(gòu)更致密更穩(wěn)定，但膜厚度過大會(huì)造成模板分子無法從聚合膜中洗脫，印跡空穴減少，表征峰電流值減小，影響到傳感器的靈敏度，因此實(shí)驗(yàn)選擇掃描圈數(shù)30 圈為最佳。

2.5 分子印跡聚合物膜的制備

圖6 OAP電聚合CV曲線Fig. 6 Cyclic voltammograms of OAP electropolymerization

當(dāng)聚合圈數(shù)為30 圈，聚合速率為50 mV/s時(shí)，磺胺嘧啶分子印跡電化學(xué)傳感器的電聚合曲線，如圖6所示。由圖6a可知，OAP在修飾電極表面是一個(gè)不可逆的過程，掃描第1圈時(shí)，在電位為0.3 V時(shí)出現(xiàn)氧化峰，且峰電流值達(dá)到60 μA；當(dāng)掃描第2圈時(shí)，峰電流值明顯降低；隨著圈數(shù)的增加，峰電流強(qiáng)度不斷減小，在聚合的最后一圈時(shí)峰電流值不足5 μA。以上現(xiàn)象表明，在OAP聚合過程中，在修飾電極的表面生成了一層致密不導(dǎo)電的聚合物薄膜，導(dǎo)致聚合液中的OAP在電極表面的電子傳遞受到抑制，無法進(jìn)一步氧化，故電流響應(yīng)降低。與圖6a相比，圖6b未見顯著差異，表明OAP的電聚合不會(huì)因?yàn)榛前粪奏せ蚧前粪奏もc的存在而受到干擾，進(jìn)一步說明磺胺嘧啶模板分子在電位范圍內(nèi)對OAP的電聚合不產(chǎn)生影響。

2.6 電位誘導(dǎo)法洗脫模板分子條件的選擇

在探索模板分子洗脫方法時(shí)首先考察采用傳統(tǒng)的溶劑浸泡洗脫法去除模板分子[29-30]。磺胺嘧啶分子中含有氨基和S＝O基團(tuán)，可與OAP的羥基和氨基以氫鍵作用力結(jié)合，故要求用于洗脫模板分子的溶液既能夠破壞二者之間形成的氫鍵，又不能破壞OAP聚合物膜結(jié)構(gòu)?；前粪奏もc易溶于水、乙酸、鹽酸、硫酸等溶劑，且在酸性溶液中較穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)選取乙酸、鹽酸、硫酸分別與甲醇、乙腈等組成的一系列的復(fù)合溶液作為洗脫劑，雖然不斷調(diào)整酸與醇的比例與浸泡洗脫時(shí)間，但洗脫效果均不理想，這表明在本實(shí)驗(yàn)中洗脫模板分子的方法不適宜采用常規(guī)的浸泡洗脫法。因此，嘗試將電位誘導(dǎo)法用于聚合膜中模板分子的洗脫，即電聚合后向修飾電極施加一定的電位以改變OAP與磺胺嘧啶聚合物內(nèi)部的微環(huán)境，進(jìn)而降低二者之間的氫鍵結(jié)合力，從而使磺胺嘧啶更容易從OAP膜內(nèi)溶出以達(dá)到洗脫模板分子的目的。根據(jù)1.2.7節(jié)，將印跡電極分別置于不同洗脫劑中進(jìn)行電位誘導(dǎo)洗脫模板分子，結(jié)果如圖7所示。印跡電極在甲醇-0.5 mol/L硫酸溶液（1∶4，V/V）中洗脫后的響應(yīng)電流值最大，效果最好，故實(shí)驗(yàn)確定甲醇-0.5 mol/L硫酸溶液（1∶4，V/V）為最佳洗脫劑。

圖7 在不同洗脫劑中電位誘導(dǎo)洗脫后印跡電極響應(yīng)信號Fig. 7 Response currents of the imprinted electrode after potentialinduced elution in different solvents

在確定甲醇-0.5 mol/L硫酸溶液（1∶4，V/V）為最佳洗脫劑之后，實(shí)驗(yàn)對誘導(dǎo)洗脫電位及誘導(dǎo)洗脫時(shí)間進(jìn)行研究。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予一個(gè)正的誘導(dǎo)電位進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫后印跡電極在電活性探針溶液中未出現(xiàn)響應(yīng)電流信號，說明在正電位條件下不能改變印跡膜的微環(huán)境，該膜在正電位條件下是穩(wěn)定的；當(dāng)在負(fù)電位條件下進(jìn)行誘導(dǎo)洗脫時(shí)，隨著負(fù)電位值的增加，響應(yīng)信號逐漸增大，但是如果電位過負(fù)則導(dǎo)致印跡膜被破壞至脫落，響應(yīng)電流值趨于裸電極的信號值，因此最終確定在-0.2 V條件下進(jìn)行誘導(dǎo)洗脫。隨后對模板分子洗脫時(shí)間進(jìn)行考察，如圖8所示，在電位誘導(dǎo)洗脫6 min時(shí)印跡電極的響應(yīng)電流信號達(dá)到最大值，之后不再增加，故確定6 min為最佳的洗脫時(shí)間。

圖8 誘導(dǎo)洗脫時(shí)間優(yōu)化曲線Fig. 8 Optimization curve of induction elution time

綜上所述，最佳的電位誘導(dǎo)洗脫條件為在甲醇-0.5 mol/L硫酸溶液（1∶4，V/V）中，施加-0.2 V的電位，誘導(dǎo)洗脫6 min。

2.7 吸附時(shí)間的選擇

圖9 吸附時(shí)間優(yōu)化曲線Fig. 9 Optimization of adsorption time

實(shí)驗(yàn)采用DPV法對電極洗脫后再吸附的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，將模板分子洗脫后的電極置于一定濃度的磺胺嘧啶鈉溶液中浸泡不同的時(shí)間后，在鐵氰化鉀-亞鐵氰化鉀溶液中表征。如圖9所示，隨著浸泡時(shí)間延長，DPV峰電流值逐漸下降，當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到8 min后，峰電流值不再變化，表明聚合物膜對磺胺嘧啶或磺胺嘧啶鈉的吸附已達(dá)到飽和，因此最佳吸附時(shí)間為8 min。

2.8 電極修飾和印跡效應(yīng)表征

圖10 電極在表征溶液中的CV曲線Fig. 10 Cyclic voltammograms of different electrodes in the probe solution

考察用滴涂法將CMWCNTs及AuNPs修飾到GCE的效果，并對不同電極進(jìn)行表征，如圖10所示。在鐵氰化鉀-亞鐵氰化鉀溶液中對裸電極進(jìn)行CV掃描，其掃描曲線如圖10曲線a所示，探針離子Fe3+/Fe2+在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，呈現(xiàn)一組氧化還原峰，峰電流值之比接近于1∶1；當(dāng)在裸電極上修飾兩層CMWCNTs后，有效的增大了電極的比表面積，并加快對電子的傳遞，從而使電極的響應(yīng)峰電流明顯增大，如圖10曲線b所示；納米金具有良好的生物相容性和良好的導(dǎo)電性能，CS-CMWNTs/GCE表面修飾AuNPs后的掃描結(jié)果如圖10曲線c所示，響應(yīng)峰電流又有了一定程度的增加。以上結(jié)果表明電極修飾效果良好。

實(shí)驗(yàn)對傳感器的印跡效應(yīng)進(jìn)行了表征，由圖10曲線d可以看出，聚合時(shí)不含磺胺嘧啶模板分子的非印跡電極在電誘導(dǎo)洗脫后的CV曲線為一條平滑的線，無氧化還原峰出現(xiàn)，表明當(dāng)沒有磺胺嘧啶存在時(shí)電聚合形成的OAP聚合膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、緊密，不會(huì)因?yàn)殡姌O施加-0.2 V電位而被破壞，探針離子無法到達(dá)電極的表面進(jìn)行電子傳遞，所以無響應(yīng)電流信號出現(xiàn)；而經(jīng)過誘導(dǎo)洗脫模板分子后的印跡電極，其CV曲線出現(xiàn)了一組對稱性稍差的氧化還原峰（圖10曲線e），表明磺胺嘧啶存在時(shí)電聚合形成的OAP聚合膜電極在經(jīng)過電位誘導(dǎo)洗脫模板分子之后留下一些帶有特異性吸附的印跡空穴，使得探針離子可以到達(dá)電極表面發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，因此有響應(yīng)電流信號產(chǎn)生。以上現(xiàn)象表明磺胺嘧啶雖然不會(huì)影響到OAP的電聚合，但由于磺胺嘧啶與OAP之間以氫鍵結(jié)合，影響到了OAP膜的性質(zhì)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證磺胺嘧啶鑲嵌到OAP聚合膜中，進(jìn)行一組對比實(shí)驗(yàn)。將未經(jīng)洗脫模板分子的印跡電極和洗脫模板分子后的印跡電極均置于pH 5.5的高氯酸-高氯酸鈉溶液中進(jìn)行CV掃描。對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.2～0.6 V范圍內(nèi)洗脫模板分子后的印跡電極出現(xiàn)氧化峰，未洗脫的沒有出現(xiàn)氧化峰，出現(xiàn)的寬峰為嵌入膜內(nèi)的磺胺嘧啶分子被洗脫后，探針離子發(fā)生了電化學(xué)氧化還原反應(yīng)所致，峰電流較高且峰較寬，表明磺胺嘧啶與聚合物骨架存在分子間作用力，洗脫時(shí)模板分子與洗脫液發(fā)生反應(yīng)，因此模板分子能從聚合物膜中較快地被洗脫到洗脫液中。

2.9 傳感器選擇性測定

圖11 分子印跡電化學(xué)傳感器的選擇性Fig. 11 Selectivity of the molecularly imprinted electrochemical sensor

為考察分子印跡電化學(xué)傳感器的選擇性能，實(shí)驗(yàn)選取與磺胺嘧啶分子結(jié)構(gòu)相似的磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑以及與磺胺嘧啶分子結(jié)構(gòu)相差較大的四環(huán)素作為干擾物質(zhì)進(jìn)行研究。將電極分別浸入到不同濃度（0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 μmol/L）磺胺嘧啶鈉溶液與干擾物質(zhì)溶液中做吸附實(shí)驗(yàn)，采用DPV法考察電流響應(yīng)，計(jì)算吸附目標(biāo)物質(zhì)前后相對峰值電流變化（ΔI）情況，ΔI越大，表明傳感器對目標(biāo)物質(zhì)選擇性越強(qiáng)。如圖11所示，通過吸附前后響應(yīng)電流的變化值（ΔI）可以看出，吸附相同濃度的磺胺嘧啶與干擾物質(zhì)，印跡電極對模板物質(zhì)的ΔI值最大，而對其他分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)響應(yīng)較小，對與磺胺嘧啶結(jié)構(gòu)相差較大的四環(huán)素幾乎沒有電流響應(yīng)，表明該傳感器抗干擾能力很強(qiáng)。

2.10 分子印跡電化學(xué)傳感器的分析性能

2.10.1 分子印跡電化學(xué)傳感器間接測定磺胺嘧啶的原理及測定結(jié)果

間接測定法是指以Fe3+/Fe2+為電活性探針，將洗脫模板分子后的電極置于探針溶液中用DPV法掃描，測定的峰電流值記為i0，然后向探針溶液中加入一定量的磺胺嘧啶鈉，磺胺嘧啶游離嵌入到聚合物膜的空穴中，導(dǎo)致到達(dá)電極表面的探針離子減少，得失電子減少，峰電流下降，將此峰電流值記為i，將二者差值記為Δi=i0-i。磺胺嘧啶鈉的濃度越大，同等時(shí)間內(nèi)游離嵌入到聚合物膜空穴中的模板分子數(shù)量就越多，峰電流下降的越多，Δi越大。因此，根據(jù)Δi與磺胺嘧啶鈉的濃度關(guān)系可以間接測定磺胺嘧啶或磺胺嘧啶鈉。

2.10.2 線性關(guān)系與檢出限測定結(jié)果

圖12 不同濃度的磺胺嘧啶鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液DPV圖Fig. 12 Differential pulse voltammograms of different concentrations of SD-Na standard solutions

配制一系列濃度（0.002～10 μmol/L）的磺胺嘧啶鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳條件下，采用間接法研究磺胺嘧啶濃度與DPV法表征響應(yīng)峰電流的關(guān)系。以響應(yīng)峰電流差值（ΔI）為縱坐標(biāo)，磺胺嘧啶鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，作圖得出二者線性關(guān)系（圖12），以3 倍信噪比確定目標(biāo)物質(zhì)的檢出限。結(jié)果表明，磺胺嘧啶或磺胺嘧啶鈉在1.0×10-8～2.0×10-6mol/L濃度范圍內(nèi)與ΔI呈線性關(guān)系，其線性方程為Y=-18.38 lgC-90，線性相關(guān)系數(shù)R為0.996 8，檢出限為3.3×10-9mol/L，低于歐盟規(guī)定的可食用動(dòng)物組織中磺胺嘧啶最低檢出限量水平以及國標(biāo)限定水平，因此本實(shí)驗(yàn)方法滿足動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶的檢測要求。

2.10.3 回收率與精密度測定結(jié)果

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，樣品（豬肉、牛奶、雞蛋、鮮蝦）在5 μg/kg和25 μg/kg 2 個(gè)添加水平條件下進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。樣品加標(biāo)平均回收率在83.50%～97.80%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）不大于4.0%。說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表1 樣品加標(biāo)回收率和精密度（n=5）Table 1 Recoveries and precision in spiked samples (n= 5)

2.10.4 重復(fù)性與穩(wěn)定性結(jié)果

重復(fù)采用1.2.4節(jié)方法平行制備3 支印跡電極，分別對相同濃度的磺胺嘧啶鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定7 次，檢測響應(yīng)信號的RSD分別為1.42%、1.93%、2.11%，此結(jié)果表明電極的重復(fù)性良好。對該3 支電極連續(xù)使用20 次，檢測響應(yīng)信號分別降為最初值的86%、84%、89%，此結(jié)果表明印跡電極在有效使用次數(shù)內(nèi)連續(xù)使用的穩(wěn)定性良好。

2.10.5 實(shí)際樣品的測定

取市售豬肉、牛奶、雞蛋、鮮蝦各5 個(gè)樣品，按1.2.6節(jié)方法處理樣品，取待測液各5 mL分別置于電解杯中，在1.2.5節(jié)電化學(xué)測量條件下進(jìn)行測定。檢測結(jié)果表明，被檢樣品均未檢出磺胺嘧啶。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)以磺胺類藥物中常用的磺胺嘧啶為模板分子，選擇OAP為功能單體，檸檬酸三鈉還原氯金酸制備AuNPs與CMWCNTs修飾GCE，在修飾電極上成功制備了磺胺嘧啶分子印跡電化學(xué)傳感器。采用CV法和DPV法研究了印跡傳感器的電化學(xué)響應(yīng)，優(yōu)化了制備條件，考察了印跡傳感器對模板分子以及結(jié)構(gòu)類似物和其他干擾物質(zhì)的選擇性能，并將該傳感器應(yīng)用于實(shí)際樣品的快速檢測。結(jié)果表明，該傳感器具有良好的印跡效應(yīng)、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、檢測準(zhǔn)確快速，可用于動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶藥物的殘留檢測。