不同時(shí)機(jī)電針對(duì)卵巢損傷大鼠卵巢儲(chǔ)備功能的影響?

俞舒丹，何 欣,2，史航毓,2，劉志順△，王偉明△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

隨著腫瘤及各類(lèi)慢性病年輕化，女性在育齡期前后接觸放化療及有毒藥物，平均80%會(huì)出現(xiàn)不同程度的卵巢損傷，嚴(yán)重者甚至卵巢功能完全衰竭，極大地影響女性生育健康[1，2]。針對(duì)有生育意愿但未來(lái)需承擔(dān)卵巢損傷風(fēng)險(xiǎn)的女性，2007年Woodruff[3]提出了腫瘤生殖學(xué)，這是一項(xiàng)腫瘤學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)交叉整合的新型學(xué)術(shù)領(lǐng)域，目的是在保證原發(fā)腫瘤治療的前提下，更加有效地保護(hù)腫瘤患者的生育力，實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)生命和保存生育能力之間的平衡。為保護(hù)女性卵巢儲(chǔ)備功能、保存生育力，歐洲ESHRE發(fā)布的女性生育力保護(hù)指南提出可以在女性生育力未損傷前預(yù)處理使用卵泡、胚胎等凍存技術(shù)，或使用促性腺激素釋放激素類(lèi)似物(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRHa)等保護(hù)劑，減緩卵巢衰竭和損傷[4]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究，已經(jīng)有相關(guān)人群采用以上生殖保護(hù)措施獲得了正常生育[5，6]。然而，以上保護(hù)卵巢儲(chǔ)備功能的方案仍存在一定局限，如胚胎凍存技術(shù)費(fèi)用昂貴，且不適用于無(wú)男性伴侶者；乳腺癌患者GnRHa若聯(lián)合內(nèi)分泌治療或長(zhǎng)期使用，反而可能成為卵巢功能不全的危險(xiǎn)因素等[7，8]。

有研究和前期實(shí)驗(yàn)表明，中藥或針灸針對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能減退的治療機(jī)制為抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)卵泡池中竇卵泡的保護(hù)效應(yīng)[9-11]。然而，在造模前進(jìn)行電針預(yù)處理是否具有更好的卵巢功能保護(hù)效應(yīng)，尚屬未知。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建去氧乙烯基環(huán)己烯(4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD)誘導(dǎo)的大鼠卵巢功能損傷模型，觀察不同時(shí)機(jī)電針對(duì)卵巢損傷大鼠卵巢儲(chǔ)備功能的影響，探討其可能的差異化保護(hù)機(jī)制。本研究通過(guò)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)10～12周齡健康SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量(230±20) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。大鼠購(gòu)回后適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，同時(shí)連續(xù)觀察大鼠動(dòng)情周期10 d，選取動(dòng)情周期規(guī)則的32只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分空白組、模型組、模前組(造模前電針組)、模中組(造模中電針組)4組各8只。

1.2 主要試劑與儀器

去氧乙烯基環(huán)己烯(西格瑪生物科技有限公司，4-vinylcyclohexene diepoxide，VCD，貨號(hào)94956)；抗繆勒氏管激素(anti-müllieus hormones,AMH)Elisa 試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)CSB-E11162r)；AMH 蛋白抗體(貨號(hào)Ab24542)、促性腺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)放免試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，貨號(hào)HY-10024T)；超純RNA提取試劑盒(貨號(hào)CW0597)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)CW0744M)、一步法熒光定量PCR專(zhuān)用試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW0659)；熒光定量PCR上下游引物(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)；異氟烷(魯南貝特制藥有限公司，貨號(hào)26675-46-7)。

BX41光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；MULTISKANMK3全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；γ-911放射免疫計(jì)數(shù)器，中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司；ABI7500熒光定量PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；SDZ-V型電針治療儀、0.3 mm×25 mm一次性華佗牌無(wú)菌針灸針，中國(guó)蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

1.3 模型制備

參考Muhammad[12]報(bào)道方法，每日腹腔注射VCD 160 mg/kg，連續(xù)15 d(具體以芝麻油配液，2.5 μg/g 體質(zhì)量，每次注射體積不超過(guò)0.4 mL)。從腹腔注射第1天開(kāi)始，根據(jù)Cora MC[13]方法每天上午8點(diǎn)觀察大鼠陰道涂片，若大鼠陰道涂片顯示動(dòng)情間期明顯延長(zhǎng)(≥6 d)或超過(guò)2個(gè)周期無(wú)性周期變化，則提示動(dòng)情周期紊亂造模成功。

1.4 干預(yù)方法

按以上方法造模，模前組先連續(xù)進(jìn)行4周的電針預(yù)處理,然后進(jìn)行造模給藥；模中組是在造模用藥的第1天即開(kāi)始進(jìn)行電針處理，連續(xù)電針干預(yù)4周。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)[11]，2個(gè)電針組治療頻率均為前2周5次/周，后2周3次/周。具體操作方法為將大鼠捆綁置于特制鼠袋中，用膠帶黏貼在操作臺(tái)上，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》《實(shí)用動(dòng)物針灸手冊(cè)》確定穴位，隔次交替選擇中髎穴(雙側(cè)，第2骶后孔)和天樞穴(雙側(cè)，第4對(duì)乳頭平齊腹白線旁開(kāi)2 mm)進(jìn)行穴位定位[14，15]。中髎穴毫針直刺7～10 mm，天樞穴毫針直刺3～5 mm，針柄連接電針治療儀調(diào)連續(xù)波，電流0.1～1 mA，頻率1～3 Hz，時(shí)間20 min?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，模型組正常造模且無(wú)電針干預(yù)。

1.5 取材方法

模型組全部大鼠造模成功后監(jiān)測(cè)各組大鼠陰道涂片，在所有大鼠陰道涂片顯示動(dòng)情間期24 h內(nèi)取材，所有大鼠取材前禁食(不禁水)12 h，于次日麻醉放血處死大鼠(1.8%異氟烷氣體麻醉維持)。各組大鼠腹主動(dòng)脈取血4～5 mL保存至采血管中。使用消毒后的眼科鑷小心剝離脂肪組織與系膜，分離大鼠左右側(cè)卵巢，左側(cè)卵巢置于4%多聚甲醛溶液中固定，右側(cè)卵巢液氮凍存。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.6.1 卵巢組織形態(tài)和各級(jí)卵泡數(shù)量 經(jīng)石蠟包埋各組大鼠左側(cè)卵巢組織，橫切卵巢斷面厚度約為5 μm，組織切片經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，中性樹(shù)脂膠封。光學(xué)顯微鏡在10×物鏡下觀察，拍照計(jì)數(shù)原始、初級(jí)、次級(jí)和閉鎖卵泡數(shù)量，Image Pro Plus 6.0軟件處理并對(duì)圖片進(jìn)行分析。

1.6.2 血清性激素水平 檢測(cè)各組大鼠血清AMH、FSH水平，分別按照ELISA試劑盒、放免試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6.3 卵巢組織AMH蛋白檢測(cè) 提取各組大鼠右側(cè)卵巢組織蛋白，測(cè)定濃度后用12%的分離膠電泳分離蛋白并以濕法轉(zhuǎn)膜80 min，以5%脫脂奶粉常溫封閉PVDF膜100 min后，先后加入AMH一抗(濃度1∶1000)和二抗(山羊抗鼠，濃度1∶10000)孵育，TBST洗膜，ECL發(fā)光取片，β-actin為內(nèi)參照。

1.6.4 卵巢組織AMH mRNA表達(dá)檢測(cè) Trizol法提取各組大鼠右側(cè)卵巢總RNA測(cè)定濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min，37 ℃ 40 min，70 ℃ 10 min。將內(nèi)參、目的基因上下游引物、各組樣品、SYBR Green PCR Mixture、ddH2O依次加入96孔板中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCT法計(jì)算AMH mRNA的相對(duì)表達(dá)量(引物序列見(jiàn)表1)。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造模情況

模型組與模中組在造模過(guò)程中各有1只大鼠死亡。注射VCD造模后14 d，模型組與模前組動(dòng)情周期基本正常，模中組動(dòng)情周期全部紊亂。初次使用VCD造模后70 d，模型組所有大鼠陰道涂片均顯示造模成功，模前組、模中組造模成功率分別為100%、85.7%(6/7)。

2.2 卵巢組織形態(tài)和各級(jí)卵泡數(shù)量

2.2.1 卵巢組織形態(tài) 圖1示，大體形態(tài)方面空白組大鼠卵巢體態(tài)飽滿(mǎn)，周?chē)鷿M(mǎn)布細(xì)小顆粒；模型組、模前組、模中組大鼠卵巢萎縮，模型組可見(jiàn)顆粒明顯疏松。顯微鏡下可見(jiàn)，與空白組比較，模型組卵巢組織原始卵泡明顯減少，次級(jí)卵泡結(jié)構(gòu)破壞且排列松散，成熟卵泡較少，閉鎖卵泡及間質(zhì)腺明顯增加，局部可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模前組較模型組卵巢損傷程度輕，原始卵泡、初級(jí)卵泡和成熟卵泡數(shù)稍多于模型組，卵泡周邊顆粒細(xì)胞層相對(duì)完整，卵泡液充實(shí)完整。模中組與模型組比較，原始卵泡、初級(jí)卵泡數(shù)差別不明顯，局部可見(jiàn)大量閉鎖卵泡和少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 HE 染色檢測(cè)各組大鼠卵巢組織病理學(xué)變化(×100)

2.2.2 卵巢各級(jí)卵泡數(shù)量 表2示，與空白組比較，模型組左側(cè)卵巢組織切片中原始卵泡、初級(jí)卵泡明顯減少，閉鎖卵泡明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，模前組大鼠左側(cè)卵巢組織切片中原始卵泡、初級(jí)卵泡明顯增加，閉鎖卵泡明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 大鼠卵巢組織中各級(jí)卵泡數(shù)目比較

2.3 血清性激素水平

表3示，與空白組比較，模型組血清AMH降低、FSH升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，模前組和模中組血清AMH升高、血清FSH降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；模中組血清AMH高于模前組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清AMH、FSH水平比較

2.4 卵巢組織中AMH蛋白含量

圖2表4示，與空白組比較，模型組卵巢組織AMH蛋白表達(dá)灰度值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，模前組、模中組大鼠卵巢組織AMH蛋白含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：抗繆勒氏管激素(Anti--Müllieus Hormones,AMH)圖2 各組卵巢組織AMH蛋白含量比較

表4 各組卵巢組織AMH蛋白灰度值分析比較

2.5 卵巢組織中AMH mRNA相對(duì)表達(dá)量

表5示，與空白組比較，模型組卵巢組織AMH mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，模前組、模中組大鼠卵巢組織AMH mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 大鼠卵巢組織AMH mRNA表達(dá)情況比較

3 討論

卵巢儲(chǔ)備功能是目前生殖醫(yī)學(xué)的常用術(shù)語(yǔ)，包括生育能力和內(nèi)分泌功能，然而迄今為止有關(guān)卵巢儲(chǔ)備功能的檢查存在局限，尚無(wú)囊括原始卵泡數(shù)量和功能的單一檢測(cè)手段，目前公認(rèn)以AMH，竇卵泡數(shù)(antra1 follicle count,AFC)和FSH綜合評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能[16]。AMH是一種由原始卵泡和竇前小卵泡顆粒細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化因子β超家族成員，主要通過(guò)AMH受體II(AMH receptor II，ANHR II)發(fā)揮抑制原始卵泡招募的生物學(xué)作用。因此有研究以AMH作為抑制小鼠原始卵泡激活，防止環(huán)磷酰胺、鉑類(lèi)等毒性化學(xué)藥物損傷卵巢的保護(hù)劑[17]。大量比較實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMH數(shù)值相對(duì)穩(wěn)定，不隨環(huán)境和月經(jīng)周期波動(dòng)，因其數(shù)值的大小可以近似代表卵巢儲(chǔ)備功能，其在預(yù)測(cè)卵巢損傷和卵巢壽命、衡量卵巢刺激方案效力等方面具有不可替代的優(yōu)勢(shì)[18，19]。

卵巢損傷屬于中醫(yī)學(xué)“月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)、不孕”范疇?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)別論篇》中有關(guān)于月經(jīng)的著名論述“二陽(yáng)之病在心脾，有不得隱曲，女子不月”?！岸?yáng)”目前公認(rèn)指手足陽(yáng)明經(jīng)，陽(yáng)明為多氣多血之經(jīng)，病在陽(yáng)明，針以引氣調(diào)動(dòng)陽(yáng)明經(jīng)氣血回歸胞宮，調(diào)經(jīng)助孕。本研究基于劉志順臨床經(jīng)驗(yàn)選擇雙側(cè)中髎穴與天樞穴，一方面二穴臨近病位，另一方面二穴歸屬足太陽(yáng)膀胱經(jīng)和足陽(yáng)明胃經(jīng)，深刺引陽(yáng)入陰，強(qiáng)力疏通氣血[20]。現(xiàn)代研究表明，針刺還可以抑制下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamic-pituitary-ovarian axis,HPO)，下調(diào)FSH水平，發(fā)揮上源性神經(jīng)化學(xué)調(diào)節(jié)作用[21]。除中樞性機(jī)制外，針刺還能通過(guò)刺激外周神經(jīng)血管調(diào)控局部，如改善受刺激卵巢局部的血液循環(huán)，增加細(xì)胞因子的分泌等[22]。本研究基于韓濟(jì)生[23]團(tuán)隊(duì)的研究，發(fā)現(xiàn)2 Hz低頻電流對(duì)卵泡的生長(zhǎng)有幫助作用。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，低頻電流下針刺對(duì)卵巢激素水平調(diào)節(jié)效果顯著[11]。本研究結(jié)果證實(shí)，造模前電針預(yù)處理聯(lián)合2 Hz低頻電流在調(diào)控原始卵泡發(fā)育和抑制成熟卵泡閉鎖中有一定療效。

本研究證實(shí)，160 mg/kg可以成功復(fù)制卵巢原始卵泡損傷模型，文獻(xiàn)報(bào)道VCD有特異性卵巢毒性，能夠通過(guò)加速原始卵泡到初級(jí)卵泡的募集，降低AMH表達(dá)水平[24]。研究觀察了電針調(diào)控對(duì)VCD所致卵巢損傷大鼠卵巢結(jié)構(gòu)與功能的影響。本研究模前組在增加竇卵泡數(shù)量方面明顯優(yōu)于模中組，可能是由于卵巢未損傷前電針能夠抑制原始卵泡發(fā)育，減輕VCD特異性損傷，穩(wěn)定AMH基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而發(fā)揮出保護(hù)卵巢儲(chǔ)備功能的作用。通過(guò)發(fā)病前電針預(yù)處理(模前組)與發(fā)病中電針處理(模中組)證實(shí)，2個(gè)電針組均能升高血清AMH水平、卵巢AMH蛋白和mRNA表達(dá)，證實(shí)電針可以穩(wěn)定損傷卵巢的顆粒細(xì)胞活性，改善卵巢儲(chǔ)備功能。這與一項(xiàng)針灸對(duì)卵巢功能不全的系統(tǒng)評(píng)價(jià)結(jié)論一致[25]。金洵[26]在艾灸干預(yù)對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能低下的影響研究中發(fā)現(xiàn)，先于疾病的預(yù)防性干預(yù)優(yōu)于疾病發(fā)生后的治療。綜上本研究證實(shí)，發(fā)病前與發(fā)病過(guò)程中電針處理均可在一定程度減輕卵巢損傷。從造模第1天到第70天造模成功，課題組發(fā)現(xiàn)大鼠卵巢損傷隨時(shí)間進(jìn)展逐漸加重，盡管電針無(wú)法逆轉(zhuǎn)卵泡與顆粒細(xì)胞遞進(jìn)式的損傷趨勢(shì)，但陰道涂片監(jiān)測(cè)動(dòng)情周期的結(jié)果顯示，電針預(yù)處理很可能存在一定的遠(yuǎn)期維持效應(yīng)。未來(lái)可以生育力為切入點(diǎn)，展開(kāi)電針預(yù)處理對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能近遠(yuǎn)期療效與機(jī)制的研究。

筆者實(shí)驗(yàn)前的假說(shuō)預(yù)測(cè)模前組電針預(yù)處理對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能的保護(hù)優(yōu)于模中組電針處理，然而本實(shí)驗(yàn)中2個(gè)電針組在卵巢AMH蛋白和mRNA的結(jié)果上并沒(méi)有出現(xiàn)明顯差異，分析原因一是可能造模藥物本身劑量對(duì)卵巢的損傷程度較重，部分大鼠存在腹腔黏連甚至死亡，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中較多原始卵泡、初級(jí)卵泡壞死，因而模中組的電針干預(yù)保護(hù)不及；二是可能設(shè)置造模成功的時(shí)點(diǎn)較晚，VCD對(duì)卵巢的損傷已累積且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量較少，因而可能未充分顯示出2組間的保護(hù)差異。未來(lái)實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步探索不同程度卵巢損傷與VCD給藥劑量和時(shí)長(zhǎng)的關(guān)系，此外仍需對(duì)針刺保護(hù)卵巢功能調(diào)控相關(guān)通路進(jìn)行研究。

綜上所述，造模前或造模中電針“中髎/天樞”對(duì)卵巢損傷大鼠卵巢儲(chǔ)備功能可能均有一定保護(hù)作用。造模前電針“中髎/天樞”可能通過(guò)抑制卵泡發(fā)育、穩(wěn)定AMH基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)發(fā)揮保護(hù)卵巢儲(chǔ)備功能的作用。