基于piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的西方蜜蜂Rubia基因轉(zhuǎn)移研究

柯 俐，胡小芬，王子龍，曾志將，何旭江

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所,江西南昌330045)

蜜蜂是一種真社會(huì)性昆蟲，其獨(dú)特的生物學(xué)特性受到廣泛關(guān)注，是神經(jīng)生物學(xué)、行為學(xué)和分子生物學(xué)的新興模式生物[1]。蜜蜂的基因轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究蜜蜂生物學(xué)的重要手段。目前，精子介導(dǎo)法[2-4]、電穿孔法[5-6]和基因定點(diǎn)編輯法[7]已在蜜蜂中進(jìn)行了大量試驗(yàn)，但均未獲得良好效果。

piggyBac轉(zhuǎn)座子最早發(fā)現(xiàn)于在鱗翅目昆蟲粉紋夜蛾(Trichoplusiani)中，根據(jù)特征性的TTAA 四核苷酸靶位點(diǎn)在基因組上完成切除與轉(zhuǎn)座。其與Minos、Hermes和mariner等其它的DNA轉(zhuǎn)座子不同，piggyBac轉(zhuǎn)座子家族因特異性識(shí)別TTAA序列并可以在基因組上自由移動(dòng)，又被稱為跳躍基因[8]。目前，piggyBac轉(zhuǎn)座子在功能基因研究中擁有著強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，具有轉(zhuǎn)座頻率高、轉(zhuǎn)座后穩(wěn)定，特別是物種適用性廣泛等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)作為一種良好的外源基因?qū)胧侄?，在許多鱗翅目和雙翅目昆蟲[9-11]中廣泛應(yīng)用。

目前，piggyBac在蜜蜂中的應(yīng)用相對(duì)較少。2014年Schulte等[12]首次在蜜蜂中將piggyBac轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射，成功將外源性基因植入蜜蜂基因組中，并在子代中檢測(cè)到熒光與插入染色體上位置。本研究基于piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，以西方蜜蜂為實(shí)驗(yàn)材料，利用顯微注射技術(shù)將外源性Rubia紅色熒光蛋白基因植入西方蜜蜂卵中，并檢測(cè)其基因整合與熒光表達(dá)情況。該研究可為我國今后的蜜蜂轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究和分子育種技術(shù)提供科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲

本實(shí)驗(yàn)西方蜜蜂(Apismellifera)選自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)飼養(yǎng)的3群意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)。利用仿生免移蟲王漿生產(chǎn)技術(shù)[13]獲取蜂王產(chǎn)卵2 h內(nèi)受精卵。

1.2 piggyBac質(zhì)粒與菌株

感受態(tài)細(xì)胞Trans5α購自廣州全式金公司，質(zhì)粒pBac[6×P3-rubia]、質(zhì)粒pBac Transposase，由德國Martin Beye實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.3 主要試劑藥品

限制性內(nèi)切酶EcoRI，2 kb、10 kb DNA marker購自大連Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒Endofree Plasmid Midi Kit 50 preps購于康為世紀(jì)生物科技有限公司；OMEGA DNA提取試劑盒購自南昌賽爾生物公司；mMESSAGE mMACHINE?RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒， MEGAclearTM回收試劑盒購自上海拜力生物科技公司。

1.4 顯微注射與實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

1.4.1 顯微注射針 購自eppendorf公司，直徑2～5 μm，針尖角度37°，長度5.1 cm，密封保存。

1.4.2 注射液體 質(zhì)粒經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒提取，保存于-20 ℃，在注射前取至室溫10 min；轉(zhuǎn)座酶mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄，保存于-80 ℃，在注射前取至室溫10 min待用。

1.4.3 蜜蜂卵的準(zhǔn)備 利用仿生免移蟲產(chǎn)卵器[13]控王2 h，獲得約80粒卵供下一步試驗(yàn)所用。

1.4.4 意蜂卵的顯微注射 將卵與上樣顯微注射針分別調(diào)試在倒置顯微鏡視野的中央。轉(zhuǎn)座子piggyBac質(zhì)粒的濃度為20 μL/ng。調(diào)節(jié)注射壓力在660 hPa,確認(rèn)出液后備用，調(diào)整卵的角度至與針尖70°～90°。令顯微注射針從蜜蜂卵的尾端1/3注入，停留1～2 s，看到蜂卵中出現(xiàn)液滴，移出針端。將注射后受精卵移至35 ℃，相對(duì)濕度75%的培養(yǎng)箱內(nèi)的盒子中培養(yǎng)。

1.4.5 蜜蜂卵的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 蜜蜂幼蟲飼料配方參照Vandenberg等[14]的方法，體外培養(yǎng)方法參照王倩等[15]的方法。

1.5 piggyBac質(zhì)粒的提取與酶切

將菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取轉(zhuǎn)座質(zhì)粒piggyBac，用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切2 h,接著進(jìn)行凝膠電泳，紫外成像觀察。

表1 本研究用到的引物

1.6 轉(zhuǎn)piggyBac蜜蜂的分子生物學(xué)方法鑒定

提取蜜蜂基因組總DNA。使用Primer primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物兩對(duì)，并由生工技術(shù)有限公司合成，分別為Rubia-F/r陽性引物與EA-piggy-fw/ piggy-out-rev陰性引物。piggyBac轉(zhuǎn)座子在生物體內(nèi)會(huì)在BacR、BacL兩側(cè)進(jìn)行選擇性剪切形成兩個(gè)活性臂，并插入染色體中。陰性引物位于BacR活性臂兩側(cè)，該對(duì)陰性引物參考自Christina Schulte的文章[12]。目的產(chǎn)物膠回收產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 熒光顯微鏡檢測(cè)

將蛹期蜜蜂置于QLYMPUS-DP80熒光顯微鏡觀察結(jié)果。由于紅色熒光蛋白的6×P3啟動(dòng)子在神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)選擇神經(jīng)系統(tǒng)較發(fā)達(dá)的頭部進(jìn)行觀察。

1.8 PCR體外擴(kuò)增與基因序列測(cè)序

將顯微注射卵培養(yǎng)至蛹期。當(dāng)蜜蜂蛹眼睛發(fā)育成熟并未出現(xiàn)顏色時(shí)，取其頭部與腹部進(jìn)行總DNA提取，并用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，其中2×TaqMaster Mix 12.5 μL，2 μL模板DNA，上下游引物各1 μL，dd H2O補(bǔ)至終體積，94 ℃預(yù)變性2 min,30個(gè)循環(huán)(94 ℃變性，30 s;56.7 ℃退火,45 s;72 ℃延伸,90 s),72 ℃再延伸10 min。電泳后切膠回收。送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)座質(zhì)粒連接后構(gòu)建

連接后的重組質(zhì)粒長度為8 777 bp，用酶切的方法鑒定piggyBac載體，用EcoRI限制酶酶切后在Marker 3 900 bp和4 800 bp附近或得兩條目的條帶(圖1-A，2泳道)，與預(yù)期的剪切結(jié)果一致。

A，M:DNA Marker 10 000,1:pBac[6×P3-rubia]質(zhì)粒；2:EcoRI酶切；B，pBac[6×P3-rubia]重組質(zhì)粒圖譜，BacR、BacL:piggyBac轉(zhuǎn)座子的反向末端重復(fù)序列，6×P3：6個(gè)重復(fù) Pax6 元件基因的核心啟動(dòng)子；SV40，SV40多聚位點(diǎn)；Am-actin5c啟動(dòng)子：蜜蜂actin5c基因的上游翻譯起始位點(diǎn)啟動(dòng)子；rubia：編碼紅色熒光蛋白的報(bào)告基因A,M:DNA Marker 10 000;1:pBac[6×P3-rubia] plasmid;2:EcoRI digestion;B,pBac[6×P3-rubia] recombinant plasmid map,BacR,BacL:piggyBac transposon inverted terminal repeats,6 × P3:core promoter of six repeat Pax6 element genes;SV40,SV40 polyadenylation sites;Am-actin5c promoter:upstream translation initiation promoter of honeybee actin5c gene;rubia:reporter genes encoding red and fluorescent proteins圖1 pBac[6×P3-rubia]重組質(zhì)粒的酶切分析及圖譜Fig.1 Restriction analysis and mapping of recombinant plasmid pBac[6×P3-rubia]

2.2 蜜蜂培養(yǎng)數(shù)據(jù)

顯微注射232粒卵，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中室內(nèi)培養(yǎng)，平均孵化率達(dá)13.4%，成蛹率達(dá)7.3%(表2)。

表2 注射轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶mRNA培養(yǎng)數(shù)據(jù)

M:DL 2000;1:注射piggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒后意大利蜜蜂DNA引物陽性克隆;2:注射piggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒后意大利蜜蜂DNA陰性引物對(duì)照;3:野生型意大利蜜蜂M:DL 2000;1:Positive clone of Apis mellifera ligustica honeybee DNA primer after piggyBac transposing plasmid injection;2:Apis mellifera ligustica honeybee DNA negative primer control after piggyBac transposing plasmid injection;3:Wild-type Apis mellifera ligustica honeybee DNA圖2 轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒Rubia基因PCR分析Fig.2 Transposon plasmid Rubia gene PCR analysis

2.3 轉(zhuǎn)piggyBac蜜蜂表達(dá)鑒定

通過瓊脂糖凝膠電泳，獲得特異性的Rubia目的產(chǎn)物(圖2)，產(chǎn)物條帶大小與預(yù)期目的片段大小基本一致。

2.4 熒光顯微鏡觀察

熒光顯微鏡檢測(cè)17只顯微注射蜜蜂蜂蛹，結(jié)果表明：顯微注射實(shí)驗(yàn)組蜜蜂頭部的吻與復(fù)眼有微弱的紅色熒光信號(hào)，而對(duì)照組無明顯紅色熒光信號(hào)，表明Rubia紅色熒光蛋白可在注射組蜜蜂蛹中進(jìn)行微量表達(dá)(圖3)。

2.5 測(cè)序結(jié)果

回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并在NCBI的blast進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明：目的條帶的基因序列與piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中Rubia基因原始基因序列配比率為81.23%(圖4)，序列基本一致。

A、B分別為注射piggyBac質(zhì)粒后蜜蜂頭部與野生型蜜蜂頭部對(duì)照組的紅色熒光照片A and B indicates the red fluorescence photos of the honeybee head with piggyBac plasmid injection and the wild type bee head control group,respectively圖3 熒光在蜜蜂頭部中的表達(dá)觀察Fig.3 Fluorescent expression observation in honeybee

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過在西方蜜蜂早期胚胎卵中注射piggyBac轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶mRNA，研究了Rubia外源基因在蜜蜂受精卵中的轉(zhuǎn)移與表達(dá)。本研究顯微注射后的平均孵化率達(dá)13.4%，成蛹率達(dá)7.3%，與前人結(jié)果相近[16]。表明顯微注射piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)與幼蟲人工體外培養(yǎng)技術(shù)具有良好的操作性和成功率。通過熒光顯微鏡觀察，在注射組蜜蜂蛹頭部出現(xiàn)部分紅色熒光信號(hào)，而未在對(duì)照組發(fā)現(xiàn)信號(hào)。同時(shí)，PCR擴(kuò)增也檢測(cè)到了蜜蜂頭胸部中外源基因Rubia片段。這一結(jié)果表明piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可以將紅色熒光蛋白R(shí)ubia轉(zhuǎn)移入蜜蜂DNA，并進(jìn)行微弱表達(dá)。

6×P3啟動(dòng)子已經(jīng)成功在黑腹果蠅[17]，赤擬谷盜[18]，異色瓢蟲[19]，蝴蝶[20]等的基因轉(zhuǎn)移研究中應(yīng)用，在眼睛以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中至關(guān)重要[21]。目前還沒有蜜蜂特異性啟動(dòng)子的報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)選用6×P3啟動(dòng)子，但結(jié)果基因轉(zhuǎn)移效率偏低，可能該啟動(dòng)子在西方蜜蜂細(xì)胞中啟動(dòng)活性較弱有關(guān)。另外，不同的啟動(dòng)子如Am-actin5c,elp2l,Am-hsp83 ,Am-hsp70，6×P3等在不同的時(shí)期與組織特異性表達(dá)。若能夠選擇構(gòu)造出西方蜜蜂強(qiáng)表達(dá)特異性啟動(dòng)子，外源基因在西方蜜蜂中的表達(dá)將會(huì)顯著提高。

熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)在分子實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。本實(shí)驗(yàn)中選用的是Rubia紅色熒光蛋白，近年來用作果蠅[22]，家蠶[23]，斯氏按蚊[24]等昆蟲轉(zhuǎn)基因標(biāo)記中。本實(shí)驗(yàn)中的陽性表達(dá)率與前人研究比較接近[25]，

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與轉(zhuǎn)座子piggyBac中Rubia基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 Comparison of PCR amplification products Sequencing and Rubia gene sequences in piggyBac transposon

但熒光表達(dá)比較弱。這可能與顯微注射過程中轉(zhuǎn)座事件的發(fā)生概率較低有關(guān)。此外，蜜蜂受精卵從蜂王生殖腺脫離后就開始快速激烈的卵裂、活化和分化等不同發(fā)育過程[26]。本研究選取蜂王產(chǎn)卵2 h內(nèi)的受精卵進(jìn)行顯微注射，可能受精卵已處于卵裂和分化等胚胎發(fā)育過程，影響了piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移效率。實(shí)驗(yàn)組中幼蟲的成活率比自然蜂群低，且孵化時(shí)間會(huì)延長?？赡茏⑸溥^程對(duì)受精卵有損傷效應(yīng)，且外源基因Rubia對(duì)蜜蜂卵的孵化和幼蟲發(fā)育也會(huì)造成一定影響。

蜜蜂是真社會(huì)昆蟲，也是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲。其社會(huì)分工、級(jí)型分化、單雙倍體性別決定機(jī)制和工蜂監(jiān)督等的生物學(xué)特性受到了廣泛關(guān)注。piggyBac轉(zhuǎn)座技術(shù)在蜜蜂獨(dú)特生物學(xué)的研究中具有良好的應(yīng)用前景，也為蜜蜂分子育種提供了良好的技術(shù)手段。本研究利用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)成功將Rubia蛋白成功轉(zhuǎn)移至蜜蜂受精卵中。雖然轉(zhuǎn)移效率偏低，且僅形成了嵌合體蜜蜂個(gè)體，但隨著該技術(shù)不斷的改進(jìn)與突破，必將廣泛應(yīng)用到在今后的蜜蜂分子生物學(xué)研究與分子育種生產(chǎn)實(shí)踐中。