生長調(diào)節(jié)劑對東京野茉莉插穗生根及其生理生化的影響

陳 晨，彭 歡，張子晗，喻方圓

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院/南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210037)

東京野茉莉(Styraxtonkinensis)為安息香科安息香屬落葉喬木，分布于熱帶和亞熱帶海拔100～2 000 m的疏林或林緣，主要分布于江西、福建、湖南、廣東、廣西和云南等地[1]。東京野茉莉喜濕潤疏松土壤，較耐貧瘠和耐旱，在藥用、油用、材用和觀賞方面均有較高的利用價(jià)值[2-4]。東京野茉莉種子大小年現(xiàn)象明顯，且存在休眠特性[5]，給播種育苗帶來一定困難。目前，對東京野茉莉研究主要集中在樹種分布[6]、花色成分[7]、繁育系統(tǒng)[8]和木材材性[9]等方面，其中對東京野茉莉種子內(nèi)油脂成分及含油率已經(jīng)有了較為深入的研究[10]，但對其扦插繁殖研究鮮有報(bào)道。

因此開展東京野茉莉扦插繁殖研究十分必要。本試驗(yàn)通過研究不同生長調(diào)節(jié)劑種類對東京野茉莉硬枝扦插生根率、平均生根數(shù)、平均根長等影響，以及生根過程中插穗營養(yǎng)物質(zhì)含量和相關(guān)抗氧化酶活性的變化，探討其扦插生根機(jī)理，試驗(yàn)結(jié)果可為東京野茉莉無性系扦插快繁提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于南京市六合區(qū)馬集鎮(zhèn)中華茉莉谷苗圃基地(32°11′N～32°27′N， 118°34′E～119°03′E)。年平均氣溫15.1 ℃，平均日照時(shí)數(shù)2 199.4 h以上，常年平均降雨量1 000 mm左右，屬北亞熱帶季風(fēng)溫濕氣候區(qū)。扦插池(20 m×1.2 m×0.5 m)中的基質(zhì)為(蛭石-珍珠巖，V/V=2∶1)，使用多菌靈800倍液消毒，翻曬一周后備用。

1.2 插穗的采集與制備

2017年3月24日，選取生長健壯、長勢一致、無病蟲害、無機(jī)械損傷的3年生東京野茉莉的1年生木質(zhì)化側(cè)枝采穗，插條長度10～12 cm，保留3～4個(gè)芽，形態(tài)學(xué)上端平剪(切口距第一個(gè)芽1 cm)，下端斜剪(切口位于芽背面，節(jié)下方0.5 cm)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，即將剪好的插穗基部2/3浸沒于濃度為200 mg/kg的IBA、NAA和ABT 3種不同的生長調(diào)節(jié)劑中2 h，以清水浸泡為對照。采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)置3個(gè)區(qū)組，每個(gè)區(qū)組設(shè)置4個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)安排1個(gè)處理，每個(gè)處理60根插穗。其中30根用于生根情況分析，另30根用于扦插過程中取樣測定營養(yǎng)物質(zhì)含量和相關(guān)抗氧化酶活性。將處理好的穗條垂直插入基質(zhì)中，保留插穗端部1/3于基質(zhì)外。

1.4 插后管理

扦插后將插穗周圍基質(zhì)壓實(shí)，隨即澆透水，并設(shè)置自動(dòng)間歇噴霧系統(tǒng)：每隔15 min，噴霧15 s；雨天不噴。扦插1個(gè)月后加蓋遮陽網(wǎng)(遮陽度70%)，持續(xù)降雨時(shí)加蓋塑料薄膜。

1.5 插穗營養(yǎng)物質(zhì)含量和相關(guān)抗氧化酶活性變化的測定

從插后當(dāng)天即開始取樣，以后每10 d取樣1次，共7次，每個(gè)處理每次在重復(fù)內(nèi)隨機(jī)抽取4根插穗，3個(gè)重復(fù)共12根，置于干冰桶中帶回實(shí)驗(yàn)室，切去插穗形態(tài)學(xué)上端1/3，迅速剝?nèi)∮嘞虏逅腠g皮部，于-70 ℃冰箱保存待測?？扇苄蕴呛?、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性采用李合生[11]的方法測定，過氧化物酶(POD)活性、多酚氧化酶(PPO)活性及丙二醛(MDA)含量采用高俊鳳[12]的方法測定。

1.6 插穗生根過程觀察及生根情況的統(tǒng)計(jì)

結(jié)合生理生化分析取樣，觀察不同處理插穗的外部形態(tài)變化及不定根的發(fā)生情況；扦插60 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)生根率(%)、平均生根數(shù)(條/株)、平均根長(cm)和生根指數(shù)。計(jì)算方法如下：

生根率=(生根插條總數(shù)/總插條數(shù))×100%

(1)

平均生根數(shù)=總根數(shù)/生根插條總數(shù)

(2)

平均根長=根長之和/總根數(shù)

(3)

生根指數(shù)=生根率×平均生根數(shù)×平均根長

(4)

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

在Microsoft Excel 2007中錄入試驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算重復(fù)間均值、方差及制作圖表。使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)進(jìn)行Duncan多重比較。為使數(shù)據(jù)在方差分析前符合正態(tài)分布，對于方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值轉(zhuǎn)換，其中，對生根率進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換，平均生根數(shù)、平均根長及生根指數(shù)進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑處理對東京野茉莉插穗生根的影響

由表1可知，3種生長調(diào)節(jié)劑處理與對照相比均可顯著或極顯著提高東京野茉莉插穗生根率、生根數(shù)、平均根長及生根指數(shù)。各處理中，以200 mg/kg NAA處理插穗生根率、生根數(shù)、平均根長及生根指數(shù)均最高，且與其它各處理相比差異達(dá)顯著或極顯著水平。200 mg/kg IBA與200 mg/kg ABT相比，插穗生根率、生根數(shù)、平均根長及生根指數(shù)的差異均不顯著。由此可知，東京野茉莉硬枝扦插以選擇200 mg/kg NAA浸泡插穗基部2 h效果最佳。

表1 不同生長調(diào)節(jié)劑處理對東京野茉莉插穗生根的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著，0.01

Different lowercase letters after data in the same column mean significant difference,0.01

2.2 扦插過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

東京野茉莉硬枝扦插過程中，可溶性糖含量變化如圖1所示?？扇苄蕴鞘遣鍡l生根的主要營養(yǎng)物質(zhì)[13]。200 mg/kg ABT和200 mg/kg NAA處理的插穗可溶性糖含量在扦插初期有一個(gè)短暫積累的過程，而對照組上升不明顯。隨后可溶性糖含量下降，各處理和對照均在20 d下降到谷值，原因是插穗消耗自身可溶性糖以維持自身生命活動(dòng)；扦插20 d后，各處理組插穗和對照可溶性糖含量開始上升。此時(shí)為愈傷組織誘導(dǎo)期，插穗基部代謝活躍，插穗內(nèi)的淀粉水解使可溶性糖含量升高，為后期生根儲(chǔ)備足夠的碳源。扦插30～50 d，經(jīng)200 mg/kg ABT和200 mg/kg NAA處理的插穗可溶性糖含量呈下降趨勢，因?yàn)榇藭r(shí)期伴隨著愈傷組織和不定根的形成，呼吸作用增強(qiáng)，體內(nèi)可溶性糖消耗量增加，而對照組和200 mg/kg IBA處理的插穗可溶性糖含量繼續(xù)上升并在40 d達(dá)到峰值，可見插穗經(jīng)200 mg/kg ABT和200 mg/kg NAA處理不定根形成期提前。50 d后，200 mg/kg ABT、200 mg/kg NAA和對照組插穗體內(nèi)可溶性糖含量則一直呈上升趨勢，可能是在扦插過程中由于不定根的發(fā)生以及新葉的生成，光合作用生成光合產(chǎn)物，向插穗基部運(yùn)輸減緩了可溶性糖的消耗。而200 mg/kg IBA的可溶性糖含量繼續(xù)下降，可能由于此時(shí)是不定根大量生成期，插穗體內(nèi)需要消耗可溶性糖含量，以滿足能量供應(yīng)。

東京野茉莉硬枝扦插過程中，可溶性蛋白含量變化如圖2所示。在硬枝扦插生根時(shí)，可溶性蛋白含量的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。扦插后0～10 d，200 mg/kg IBA和200 mg/kg ABT處理均使東京野茉莉插穗韌皮部可溶性蛋白積累。而對照組和200 mg/kg NAA處理的插穗可溶性蛋白含量在10 d后才開始穩(wěn)步上升。200 mg/kg ABT、200 mg/kg NAA和對照組插穗可溶性蛋白含量在30 d上升到最大值。這段時(shí)間可溶性蛋白含量的升高可能主要因?yàn)殡S著愈傷組織的形成以及不定根的發(fā)生，需要積累此類物質(zhì)?？扇苄缘鞍着c植物形態(tài)發(fā)生聯(lián)系密切，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化，在植物生長發(fā)育過程中起重要作用。東京野茉莉插穗在40 d后，各處理和對照的可溶性蛋白含量均呈下降趨勢，這可能與不定根的伸長仍然需要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，可溶性蛋白的消耗將用于新細(xì)胞的形成。扦插末期，可溶性蛋白含量趨于平穩(wěn)，則說明韌皮部可溶性蛋白的積累與損耗趨于穩(wěn)定。

圖1 東京野茉莉硬枝扦插過程中可溶性糖含量的變化Fig.1 The dynamic changes of soluble sugar content within the S.tonkinesis hardwood cuttings

圖2 東京野茉莉硬枝扦插過程中可溶性蛋白含量的變化Fig.2 The dynamic changes of soluble protein content within the S.tonkinesis hardwood cuttings

2.3 扦插過程中POD活性變化

東京野茉莉硬枝扦插過程中，POD活性變化如圖3所示。在東京野茉莉硬枝扦插生根過程中，扦插初期各處理及對照POD活性均呈上升趨勢。200 mg/kg NAA、200 mg/kg IBA處理和對照組插穗在第10天達(dá)到峰值，200 mg/kg ABT處理的插穗在第20天達(dá)到峰值，且各處理組POD活性均高于對照組，由此說明生長調(diào)節(jié)劑處理對扦插初期POD活性的上升有一定的作用，可促進(jìn)愈傷組織形成。之后POD活性開始下降。在不定根出現(xiàn)期處理組POD活性又出現(xiàn)一個(gè)峰值，200 mg/kg NAA處理組第二個(gè)峰值出現(xiàn)在第40天，而200 mg/kg IBA和200 mg/kg ABT處理組第二個(gè)峰值出現(xiàn)在第50天。對照組POD活性變化不大，而且均低于處理組，說明生長調(diào)節(jié)劑處理下的插穗POD活性明顯增加，有效促進(jìn)了愈傷組織和不定根的形成。

圖3 東京野茉莉硬枝扦插過程中POD活性變化Fig.3 The dynamic changes of POD activity within the S.tonkinesis hardwood cuttings

圖4 東京野茉莉硬枝扦插過程中PPO活性變化Fig.4 The dynamic changes of PPO activity within the S.tonkinesis hardwood cuttings

2.4 扦插過程中PPO活性變化

東京野茉莉硬枝扦插過程中，PPO活性變化如圖4所示。在東京野茉莉硬枝扦插生根過程中，對照組和處理組插穗PPO活性都出現(xiàn)了兩個(gè)峰值，分別在20 d和50 d左右，這兩個(gè)階段分別是愈傷組織形成期和根系大量生成期，說明PPO的活性能有效的促進(jìn)插穗愈傷組織的形成、分化以及不定根的生長。處理組插穗在生根后期PPO活性有所下降，而對照組插穗在50 d后繼續(xù)上升，200 mg/kg IBA和200 mg/kg NAA處理的插穗PPO活性高于對照，說明IBA和NAA處理使根系形成期提前且提高插穗韌皮部PPO活性。

2.5 扦插過程中SOD活性變化

東京野茉莉硬枝扦插過程中，SOD活性變化如圖5所示。扦插生根過程中，東京野茉莉韌皮部SOD活性大致呈先上升后下降的趨勢。SOD活性在插后40 d左右達(dá)到最大值，之后逐漸降低。經(jīng)生長調(diào)節(jié)劑處理后插穗的SOD活性均高于對照。扦插40 d后，隨著插條不定根的生長，SOD活性逐漸降低。

圖5 東京野茉莉硬枝扦插過程中SOD活性變化Fig.5 The dynamic changes of SOD activity within the S.tonkinesis hardwood cuttings

圖6 東京野茉莉硬枝扦插過程中MDA含量變化Fig.6 The dynamic changes of MDA content within the S.tonkinesis hardwood cuttings

2.6 扦插過程中MDA含量變化

東京野茉莉硬枝扦插過程中，MDA含量變化如圖6所示。扦插開始后，MDA含量開始上升，各處理和對照在20 d左右達(dá)最大值，隨后MDA含量開始下降。扦插40 d后，各組處理及對照MDA含量變化趨于平穩(wěn)。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，3種生長調(diào)節(jié)劑處理均可顯著提高東京野茉莉扦插生根率、生根數(shù)、根長及生根指數(shù)，其中，以200 mg/kg NAA處理的插穗生根效果最好，生根率、生根數(shù)、根長及生根指數(shù)均顯著高于200 mg/kg ABT和200 mg/kg IBA處理。而在薔薇扦插生根過程中，200 mg/kg IBA處理的插穗生根效果要優(yōu)于200 mg/kg NAA[14]，可見不同樹種扦插生根最適宜生長調(diào)節(jié)劑種類不同。

碳水化合物尤其是可溶性糖是插穗能量的主要來源，可作為呼吸底物被利用，為插穗的生根及生長提供能量。本試驗(yàn)中，扦插初期經(jīng)生長調(diào)節(jié)劑處理后的插穗可溶性糖含量上升，為愈傷組織的誘導(dǎo)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)；隨著愈傷組織和根原基的形成，體內(nèi)可溶性糖大量消耗導(dǎo)致其含量降低；扦插20 d后，由于插穗萌芽展葉，葉片光合作用以及貯藏淀粉的水解使穗條中可溶性糖含量增加，但隨著插穗不定根的形成，生理代謝活動(dòng)增強(qiáng)，養(yǎng)分消耗大于積累，可溶性糖含量降低。這一結(jié)果與喜樹扦插生根過程中插穗內(nèi)可溶性糖含量變化規(guī)律一致[15]?？扇苄缘鞍缀康淖兓厔輨t是先上升后下降，王政等[16]在研究牡丹試管苗與扦插苗生根過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量變化時(shí)也得出了同樣的結(jié)論。生長調(diào)節(jié)劑處理能提高可溶性蛋白的積累量。

POD是一種含鐵卟啉輔基的保護(hù)酶，廣泛分布在植物體內(nèi)并參與多種生化過程[17]。本試驗(yàn)中，東京野茉莉插穗在生根過程中POD和PPO均出現(xiàn)了兩個(gè)峰值，這與宋金耀等[18]進(jìn)行的毛白楊(Populustomentosa)嵌合體扦插生根過程中POD活性變化研究結(jié)果一致，而榛子(Corylusheterophylla)[19]扦插生根過程中POD活性僅有1個(gè)峰值，這可能與插條所受脅迫程度有關(guān)。扦插初期POD活性上升消除體內(nèi)過多的內(nèi)源IAA[20]；同時(shí)，POD能夠促進(jìn)木質(zhì)素的合成以及木栓層的形成，加強(qiáng)細(xì)胞壁剛性[21]；更重要的是，POD作為抗氧化系統(tǒng)酶之一，能夠參與自由基的清除。所以，POD活性的上升不但有利于愈傷組織和根原基的誘導(dǎo)，也增強(qiáng)新生根系的細(xì)胞壁強(qiáng)度，降低了插穗在離體環(huán)境中的脅迫程度。對照組POD活性較低，說明生長調(diào)節(jié)劑處理的插穗POD活性明顯增加，有效促進(jìn)根系形成。PPO活性與植物不定根的形成聯(lián)系密切。酚類物質(zhì)在不定根形成和發(fā)育過程中起到了非常重要的作用，有研究認(rèn)為，PPO能夠催化酚類物質(zhì)和IAA形成“IAA-酚酸復(fù)合物”的生根輔助因子，從而促進(jìn)不定根的形成[22]。本試驗(yàn)中插穗PPO活性第一個(gè)峰值比第二個(gè)峰值低，可能的原因是大量生根階段高活性PPO有助于生根；且處理組較對照組峰值提前，說明PPO的活性能有效促進(jìn)插穗愈傷組織的形成以及不定根的發(fā)生，生長調(diào)節(jié)劑處理能促進(jìn)插穗生根。Molnar[23]發(fā)現(xiàn)，在繡球(Hydrangeamacrophylla)莖組織不定根發(fā)生時(shí)，PPO活性顯著增高；用多效唑處理菜豆(Phaseolusvulgaris)插條后，其大量生根階段PPO活性大幅上升[24]。

SOD能清除過量的活性氧，使植物自由基水平保持正常。在愈傷組織和不定根發(fā)生期，基部的營養(yǎng)物質(zhì)和超氧陰離子大量積累，SOD活性增強(qiáng)。本試驗(yàn)中，處理組和對照組插穗SOD活性大致呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且處理組高于對照組?；钚陨叩脑蚩赡苁羌?xì)胞代謝旺盛，切口處產(chǎn)生了較多的自由基，導(dǎo)致了SOD活性升高。后期不定根生長到一定數(shù)量，以及新葉片逐漸展開，插穗代謝水平趨于穩(wěn)定，體內(nèi)自由基含量下降，SOD活性逐漸降低。張鴿香等[25]對紫薇(Lagerstroemiaindica)的扦插試驗(yàn)也證明了此觀點(diǎn)。MDA含量可以評價(jià)細(xì)胞抗氧化能力，反映植物遭受逆境傷害的程度，正常生長的植物體內(nèi)MDA含量很少，逆境條件下含量升高。本試驗(yàn)中，扦插初期因離體插穗受到逆境傷害MDA含量上升到一個(gè)峰值；此后隨著SOD活性的上升，MDA含量開始下降；最后插穗生理機(jī)能逐漸恢復(fù)，生長趨于穩(wěn)定，MDA含量保持在較低水平。由此可知，MDA含量隨著生根進(jìn)程表現(xiàn)出有規(guī)律的變化。