固相支持液-液萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人全血中環(huán)孢素A

利 利，賈葉青，張倩影，張愛國，王曼曼，李冬梅,3*，王學(xué)生*

(1.華北理工大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063210；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000；3.華北理工大學(xué) 藥學(xué)院，河北 唐山 063210)

環(huán)孢素A(Cyclosporin A，CsA，圖1)是一種強效、高選擇性的免疫抑制劑，臨床上用于治療肝、腎等器官移植的排斥反應(yīng)和其他自身免疫性疾病，但存在治療窗窄、副作用多、口服生物利用度不穩(wěn)定、個體間及個體內(nèi)的藥代動力學(xué)差異大等問題[1]。在臨床應(yīng)用中，腎臟和心臟移植患者的CsA安全用藥濃度范圍為100～200 ng/mL，肝臟移植患者為100～400 ng/mL[2]。因此，在患者治療過程中，為提高CsA免疫抑制作用，減少其毒性作用，準(zhǔn)確監(jiān)測CsA的血藥濃度具有重要的臨床意義。

圖1 環(huán)孢素A和環(huán)孢素D的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of CsA and CsD

目前，CsA血藥濃度分析方法主要包括光譜法、色譜法和免疫法等，其中色譜法為常用方法[3-6]。由于血液成分復(fù)雜，所含雜質(zhì)干擾測定，且血液中待測組分含量較低，難以檢出，因此在儀器分析前需對樣品中的待測物進行富集和凈化。目前，生物樣品中CsA的前處理方法主要有液-液萃取法(LLE)[7-9]和固相萃取法(SPE)[10]，但LLE法溶劑使用量大、耗時，不適用于高通量分析檢測；SPE法通常需活化、上樣、淋洗和洗脫，步驟較多，易出現(xiàn)操作誤差和污染。因此，建立簡單、快速測定血液樣品中CsA的方法具有重要的研究意義和實際價值。

固相支持液-液萃取(Solid supported liquid-liquid extraction，SLE)法作為一種新型前處理方法，是在傳統(tǒng)液-液萃取法的基礎(chǔ)上，采用硅藻土為吸附劑，利用其吸水性強、性質(zhì)穩(wěn)定的特點，快速吸附樣品基質(zhì)中的水分，在吸附劑表面形成液膜，從而使目標(biāo)物與水相分離，實現(xiàn)對目標(biāo)物的富集與凈化。SLE不僅避免了活化和淋洗步驟，操作簡單，且具有不易產(chǎn)生乳化、基質(zhì)效應(yīng)低和樣品用量少等優(yōu)點[11]。Yoshikawa等[12]利用SLE前處理結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，建立了雞肉中多種獸藥殘留的分析方法；Gao等[13]發(fā)展了一種SLE結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定人尿中阿米他唑、殺螨甲菊酯、甲胎菊酯及其主要代謝物的方法。SLE方法已成功應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和環(huán)境等[12-16]樣品的前處理。

本研究采用SLE對全血樣品中CsA進行凈化和萃取，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，以環(huán)孢素D(Cyclosporin D，CsD,圖1)為內(nèi)標(biāo)物進行定量，建立了人全血中CsA的準(zhǔn)確定量分析方法，可為臨床CsA血藥濃度監(jiān)測提供新的技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LCMS-8040液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司)：液相色譜包括CBM-20A控制器、LC-30AD泵、DGU-20A5R脫氣系統(tǒng)、SIL-30AC自動進樣器和CTO-20AC柱溫箱;質(zhì)譜為三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，電噴霧電離源，軟件控制系統(tǒng)為LabSolutions LCMS Ver.5.53。ET-3301A型氮氣濃縮儀(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；Sigma 3K-15型離心機(上海精宏實驗設(shè)備公司)；Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

甲醇、乙腈(色譜純,美國Sigma-Aldrich公司)；正己烷(n-Hex，99.5%)、二氯甲烷(DCM，99.8%)、甲基叔丁基醚(MTBE，99.7%)均購自北京迪馬科技有限公司；乙酸乙酯(EA，99.0%，上海阿拉丁試劑公司)；石油醚(PE，天津富宇精細(xì)化工有限公司)；SLE柱(1 mL)購自上海拜泰齊貿(mào)易有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)CsA(99.0%，Toronto Research Chemicals公司(加拿大))，CsD(99.0%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司)。使用甲醇分別配制1 g/L的CsA和CsD標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4 ℃下避光儲存。

1.2 樣品制備

收集河北省某醫(yī)院10例骨髓移植術(shù)后患者的全血樣品，于-80 ℃下冷凍保存，使用前自然解凍至室溫。本試驗經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

取全血樣品200 μL置于1.5 mL離心管中，加入200 μL硫酸鋅溶液(0.1 mol/L)渦旋1 min后，2 500 g離心4 min，轉(zhuǎn)移上清液(約120 μL)，用甲醇-水(體積比5∶95)定容至0.8 mL待用。

1.3 SLE方法

將0.8 mL樣品上樣至SLE柱，靜置10 min，使樣品溶液充分浸潤并均勻分布在吸附劑表面，用7 mL甲基叔丁基醚對分析物進行洗脫。收集洗脫液，25 ℃氮吹至干，用甲醇定容至200 μL。

1.4 LC-MS/MS條件

色譜條件：Shim-pack XR-ODS色譜柱(75 mm×3.0 mm i.d.，2.2 μm，日本島津公司)；流動相為乙腈-水(體積比95∶5)；流速為0.3 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫60 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，正離子模式ESI(+)；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；霧化氣流速：3 L/min；干燥氣流速：15 L/min；離子源溫度：300 ℃；加熱塊溫度：450 ℃；碰撞氣電壓：230 kPa。CsA及其內(nèi)標(biāo)物CsD的保留時間分別為2.1、2.5 min，質(zhì)譜分析參數(shù)離子對(m/z)分別為1 219.8/1 202.7、1 233.8/1 216.6，碰撞能量(eV)分別為17、28。

2 結(jié)果與討論

2.1 SLE萃取條件的考察

SLE進行樣品前處理時，無需活化和淋洗步驟，水溶液樣品直接上樣，完全吸附后，利用有機溶劑洗脫，即可達到快速萃取和凈化的目的，因此洗脫溶劑的選擇決定了SLE的準(zhǔn)確度。另外，洗脫后需對樣品進行氮吹濃縮。因此，本實驗對氮吹蒸發(fā)壓力、洗脫溶劑種類及體積進行優(yōu)化，實驗平行進行3次。

2.1.1氮吹蒸發(fā)壓力在25 ℃條件下，考察了氮吹蒸發(fā)壓力(21～55 kPa)對5 mg/L CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液回收率的影響(圖2A)。結(jié)果顯示，氮吹蒸發(fā)壓力為28 kPa時CsA的回收率最高，因此最終選擇氮吹蒸發(fā)壓力為28 kPa。

2.1.2洗脫溶劑種類SLE的洗脫溶劑應(yīng)與水不混溶，且對CsA有良好的溶解性。在CsA上樣質(zhì)量濃度為5 mg/L，上樣體積為0.8 mL，洗脫溶劑體積為7 mL的條件下，分別考察了正己烷、石油醚、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚作為洗脫溶劑時CsA的回收率(圖2B)。結(jié)果表明，甲基叔丁基醚對目標(biāo)物的回收率最高，故采用甲基叔丁基醚作為SLE的洗脫溶劑。

2.1.3洗脫溶劑體積在CsA上樣質(zhì)量濃度為5 mg/L，上樣體積0.8 mL的條件下，考察了甲基叔丁基醚體積(5、6、7、8 mL)對CsA回收率的影響(圖2C)。結(jié)果顯示，當(dāng)甲基叔丁基醚用量為7 mL時CsA的回收率最高，用量為8 mL時回收率反而降低，可能是由于氮吹時間延長導(dǎo)致了CsA損失。因此，實驗選擇甲基叔丁基醚的體積為7 mL。

圖3 空白血樣加標(biāo)(A)和標(biāo)準(zhǔn)溶液(B)的MRM譜圖Fig.3 MRM chromatograms of spiked samples of whole blood(A) and standard solution(B)CsA:100 μg/L;CsD:200 μg/L

2.2 線性關(guān)系、檢出限及定量下限

采用“1.4”條件對0、1.5、5、15、50、150、500 μg/L的CsA和200 μg/L CsD內(nèi)標(biāo)物溶液(n=3)進行分析，測定目標(biāo)物峰面積，以CsA與CsD峰面積的比值(y)為縱坐標(biāo)，CsA的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，CsA在1.5～500 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.004 6x+0.003，相關(guān)系數(shù)(r)為0.998，檢出限(LOD，S/N=3)為0.5 μg/L，定量下限(LOQ，S/N=10)為1.5 μg/L。

2.3 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

以空白全血加標(biāo)樣品進行回收率和精密度實驗，分別添加50、100、400 μg/L 3個水平的CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液和200 μg/L的CsD標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組平行實驗3次。CsA的平均加標(biāo)回收率為78.6%～83.5%，日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.1%～5.6%和4.5%～8.3%。圖3為空白血樣加標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM譜圖，由圖可見，在最優(yōu)條件下，將加標(biāo)100 μg/L CsA和200 μg/L CsD的健康人全血經(jīng)SLE萃取后，目標(biāo)物在出峰位置無明顯基質(zhì)干擾，特異性良好。表明本方法能夠有效凈化和萃取全血基質(zhì)中的CsA。

2.4 實際樣品分析

在最優(yōu)實驗條件下，使用SLE結(jié)合LC-MS/MS測定10例骨髓移植術(shù)后患者全血樣品中CsA的濃度。結(jié)果顯示10例樣品的CsA質(zhì)量濃度為100～400 μg/L，均在安全血藥濃度范圍內(nèi)。分別向?qū)嶋H樣品添加100 μg/L的CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液和200 μg/L的CsD標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組平行實驗3次，計算得10例骨髓移植術(shù)后患者的平均加標(biāo)回收率為79.5%±2.1%。

2.5 方法比較

為進一步說明所建方法的可行性，將本方法與文獻方法進行對比(表1)。與血樣中CsA的常用前處理方法LLE、SPE法相比，本方法的回收率與文獻方法相當(dāng)，但靈敏度更高，且避免了活化和淋洗步驟，溶劑用量少，操作簡單。

表1 本方法與文獻方法的分析結(jié)果對比Table 1 Comparison of the present method with the reported methods for determination of CsA in the whole blood samples

3 結(jié) 論

本研究建立了基于SLE前處理技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS測定全血中CsA的分析方法，該法簡便快速,靈敏度和準(zhǔn)確度良好，可為臨床CsA血藥濃度監(jiān)測提供技術(shù)支持和個性化用藥依據(jù)，有助于更加準(zhǔn)確指導(dǎo)臨床進行劑量調(diào)整，優(yōu)化藥物治療方案。