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    紅棗中4種鏈格孢菌毒素的檢測及風(fēng)險評估

    2018-11-22 08:07:10程家興黎明陽楊雨希王毅聰張銳利杜振霞
    分析測試學(xué)報 2018年11期
    關(guān)鍵詞:鏈格孢菌甲酸

    程家興,黎明陽,楊雨希,楊 茜,袁 滌,楊 頡,王毅聰,張銳利,杜振霞*

    (1.北京化工大學(xué) 理學(xué)院,北京 100029;2.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)

    紅棗是中國新疆產(chǎn)量較大的瓜果之一,具有較高的營養(yǎng)和保健價值。真菌毒素污染是現(xiàn)階段影響紅棗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重大隱患,相關(guān)菌株侵染造成的新疆紅棗“黑斑病”爆發(fā)越來越頻繁,導(dǎo)致近幾年紅棗產(chǎn)量平均損失達(dá)30%以上(極端天氣達(dá)60%),和田地區(qū)棗園發(fā)病率更是高達(dá)50%以上[1],造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。有研究報道紅棗黑斑病致病菌主要為鏈格孢菌[2],而鏈格孢菌鏈格孢菌毒素對人體有較大危害[3],會引發(fā)細(xì)胞DNA突變,提高癌癥發(fā)病率[4]。鏈格孢菌較為重要的代謝物有二苯并吡喃酮衍生物——鏈格孢酚(Alternariol,AOH) 、交鏈格孢酚單甲醚(Alternariol monomethyl ether,AME)、細(xì)交鏈格孢菌酮酸(Tenuazonic acid,TEA)及騰毒素(Tentoxin,TEN),而TEN是僅有的一種多肽類代謝產(chǎn)物,且毒性較強(qiáng)[5-6]。鏈格孢菌種可在低溫下生長,在紅棗的生長、采摘、儲運(yùn)及加工過程中也有產(chǎn)生鏈格孢菌毒素的風(fēng)險。因此,針對新疆紅棗中鏈格孢菌毒素的檢測及風(fēng)險評估具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

    Arcella等[7]使用毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)方法評估了這些毒素對人體健康的影響。2011年,歐洲食品安全局(EFSA)針對飼料和食品中鏈格孢菌產(chǎn)生的毒素導(dǎo)致的公共衛(wèi)生風(fēng)險提出了科學(xué)意見[8]。目前,除巴伐利亞健康和食品安全權(quán)威機(jī)構(gòu)外,世界各地均無關(guān)于霉菌毒素的法規(guī)[9]。Wei等[10]對中國干果中的鏈格孢菌毒素與其他毒素進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)在31.4%的干果中同時存在2~4種真菌毒素。故對鏈格孢菌的定性定量分析意義重大。目前關(guān)于紅棗中鏈格孢菌毒素的定性定量研究較少,因此亟需建立紅棗中該毒素的快速檢測方法。

    目前文獻(xiàn)報道的檢測鏈格孢毒素的方法有液相色譜(LC)法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法[11]、薄層色譜(TLC)法[12]、氣相色譜(GC)及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法[13]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法[14]。本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測紅棗中鏈格孢菌毒素的方法,借鑒QuEChERS前處理方法,在保證較高回收率的情況下,簡化了前處理的步驟,相比已有方法具有檢出限低、檢測時間短等優(yōu)勢。本方法樣品前處理簡單,回收率高,基質(zhì)效應(yīng)低,提高了TEA、AOH在質(zhì)譜中的靈敏度,具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),可滿足大棗中4種鏈格孢菌毒素的檢測要求。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    Waters Quatrro-Premier XE超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司),配有ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);KH-100DE型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);WH-861渦旋混合器(太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Anke TGL-16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);Milli-Q A10超純水器(美國Millipore公司);0.22 μm有機(jī)濾膜(津騰公司)。

    交鏈格孢酚單甲醚(AME)、鏈格孢酚(AOH)、騰毒素(TEN)、細(xì)交鏈格孢菌酮酸(TEA)標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%,新加坡Pribolab公司)。乙腈(色譜純,F(xiàn)isher Chemical公司);甲酸(純度>98%,Acros公司);氯化鈉(分析純,Aladdin公司)。

    1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取1.00 mg 4種毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品溶于1 mL 2.0%甲酸-乙腈溶液中,配制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液,-20 ℃保存。

    標(biāo)準(zhǔn)工作液:使用2.0%甲酸-乙腈溶液配制質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、50、100、500、1 000、2 000、5 000 μg/L的TEA、AME、TEN和AOH混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    1.3 樣品前處理

    準(zhǔn)確稱量0.2 g(精確至0.01 g)紅棗樣品于10 mL離心管中,加入5 mL 2.0%甲酸-乙腈溶液,20 ℃下恒溫超聲提取30 min,加入0.2 g NaCl固體粉末,渦旋30 s后以8 000 r/min離心10 min,用注射器取上清液,過0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)檢測。

    1.4 色譜-質(zhì)譜條件

    超高效液相色譜條件:流動相:A為超純水,B為乙腈。洗脫梯度:0~3.0 min,95%~60%A;3.0~4.3 min,60%~5%A;4.3~5.0 min,5%A;5.0~5.1 min,5%~95%A;5.1~6.0 min,95%A;流速:0.35 mL/min,色譜柱:Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱( 50 mm ×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:35 ℃,進(jìn)樣量:2 μL。

    質(zhì)譜條件:離子化模式:電噴霧離子源(ESI-);掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細(xì)管電壓2.5 kV,離子源溫度120 ℃,脫溶劑溫度 350 ℃,脫溶劑氣流量 650 L/h,錐孔反吹氣流量 50 L/h,碰撞氣流量 0.15 L/min。4種鏈格孢霉毒素的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

    表1 4種鏈格孢霉毒素的串聯(lián)質(zhì)譜測定參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of fouralternaria mycotoxins

    *quantitation ion

    2 結(jié)果與討論

    2.1 色譜-質(zhì)譜條件的選擇

    在ESI-電離模式下,以[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰作為母離子,得到TEN、TEA、AOH、AME的母離子分別為m/z413.3、196.1、257.1、271.1。再進(jìn)行子離子掃描,確定MS/MS中兩個子離子豐度較高時的碰撞電壓,并確定各目標(biāo)化合物的定性和定量離子對。

    實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液時加入甲酸可顯著提高TEA和AOH的質(zhì)譜響應(yīng)。分別比較了使用0.1%甲酸-初始流動相、0.5%甲酸-初始流動相、1.0%甲酸-初始流動相、1.5%甲酸-初始流動相、2.0%甲酸-初始流動相和2.5%甲酸-初始流動相配制毒素標(biāo)準(zhǔn)品時的質(zhì)譜響應(yīng),結(jié)果表明用2.0%甲酸-初始流動相配制的毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的響應(yīng)最高。

    選用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱進(jìn)行色譜條件優(yōu)化??疾炝思状?水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol乙酸銨水溶液和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液多種流動相的分離效果,結(jié)果表明在流動相中加入甲酸或乙酸銨均會抑制毒素在質(zhì)譜中的響應(yīng),最終確定以乙腈-水作為流動相,優(yōu)化并確立了梯度洗脫程序。

    圖1 4種鏈格孢菌毒素的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of fouralternaria mycotoxins

    在優(yōu)化色譜條件下,難分離的AOH和TEN得到更好的分離[15],TEA和AOH的靈敏度也進(jìn)一步提高,圖1為4種毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖。

    2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

    2.2.1樣品量的影響文獻(xiàn)[16-17]一般采用2.0~5.0 g樣品進(jìn)行鏈格孢菌毒素提取,通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),實(shí)際被鏈格孢菌感染的紅棗中4種毒素的含量很高,尤其是TEA在樣品量高于0.5 g時即超出線性范圍,易造成色譜柱過載。本實(shí)驗(yàn)分別考察了0.1、0.2、0.5 g樣品量對紅棗鏈格孢菌毒素回收率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)樣品量為0.1、0.2 g時的回收率相近,4種毒素的回收率均在90%以上,但0.1 g樣品量下部分毒素的精密度和重現(xiàn)性差,AOH和TEA的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為10.1%~21.3%。樣品量為0.5 g時,TEA的平均回收率降至75.4%,因此選擇0.2 g為樣品的稱取量。

    2.2.2提取溶劑的影響4種毒素極性均較大,因此本實(shí)驗(yàn)分別選用極性較大的有機(jī)溶劑(即含2.0%甲酸的甲醇和含2.0%甲酸的乙腈)對紅棗中的鏈格孢菌毒素進(jìn)行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以含2.0%甲酸的甲醇作為提取溶劑時,溶液顏色變深,表明基質(zhì)效應(yīng)明顯,且4種毒素的回收率均下降,其中TEA的回收率由103%降至62.4%。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇2.0%甲酸-乙腈作為提取溶劑。

    2.2.3干燥劑的影響本實(shí)驗(yàn)的前處理方法借鑒QuEChERS方法,簡化了其吸附劑的步驟,比較了使用無水MgSO4干燥和不使用干燥劑兩種情況下4種毒素的回收率。由于紅棗本身水分較少,因此兩種情況下4種毒素的回收率相差不大,均在90%以上。在不引入其他雜質(zhì)的情況下,選擇不使用干燥劑。

    2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

    分別用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液配制500 μg/L的4種毒素混合溶液。通過下式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(ME):ME=(S1-S2)/S2,式中S1為毒素標(biāo)準(zhǔn)品在基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液中的平均峰面積,S2為毒素標(biāo)準(zhǔn)品在純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液中的平均峰面積。

    結(jié)果表明,AME的ME為-4.65%,AOH的ME為-12.44%,TEN的ME為-1.56%,TEA的ME為-25.35%,在基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液中未檢測到強(qiáng)烈的離子抑制(ME<-30%)。表明外標(biāo)法可用于4種鏈格孢菌毒素的測定。

    2.4 方法學(xué)評價

    2.4.1線性范圍與檢出限在優(yōu)化條件下,對一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),定量離子對的色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表2。由表2可見,AOH的線性范圍為1.0~100 μg/L,AME、TEA和TEN的線性范圍為10~1 000 μg/L,在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2>0.990)。當(dāng)信噪比S/N≥3時,TEN、AME、AOH和TEA的檢出限( LOD )為0.5~12.4 μg/kg。

    表2 紅棗基質(zhì)中4種鏈格孢菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限(LODs)Table 2 Liner ranges,linear equations,correlation coefficients and limits of detection(LODs) of four alternaria mycotoxins in jujube

    2.4.2回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差按優(yōu)化條件,在空白樣品基質(zhì)中進(jìn)行3個水平(40、100、400 μg/kg)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每個加標(biāo)水平平行實(shí)驗(yàn)3次,測定4種鏈格孢菌毒素的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示,4種鏈格孢菌毒素的平均回收率為92.8%~116%,RSD為0.5%~11.2%,日間精密度為2.1%~12.3%,表明方法具有良好的準(zhǔn)確度與精密度。

    2.5 實(shí)際樣品的測定

    采用本方法檢測10份新疆紅棗實(shí)際樣品,其中4份檢出鏈格孢菌毒素,AOH、AME、TEN和TEA的檢出量分別為0.048~5.050 mg/kg、LOD~11.770 mg/kg、LOD~0.320 mg/kg、1.205~1 070.300 mg/kg;其中TEA在紅棗中檢出量最高,與文獻(xiàn)報道一致[17-18]。

    2.6 風(fēng)險評估

    目前,全世界有80多個國家和地區(qū)制定了果品中真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn),但均未包括鏈格孢菌毒素[6]。鏈格孢菌毒素廣泛分布于果蔬食品中,其檢出率為25%~75%[19]。本研究在紅棗中檢出的最高含量達(dá)1 070.300 mg/kg,遠(yuǎn)高于鏈格孢菌毒素在其他食品中的含量。高檢出率與高含量可能會存在潛在的健康隱患,因此本實(shí)驗(yàn)基于T.E.S.T軟件和Toxtree軟件計(jì)算了4種鏈格孢菌毒素的毒理學(xué)評估數(shù)據(jù)(表3)。表3中TTC Class、Protein binding Alerts 和DNA binding Alerts由Toxtree軟件給出,生物蓄集系數(shù)(Bioaccumulation factor)和LD50由T.E.S.T軟件給出。LD50(man)根據(jù)LD50值使用等效劑量系數(shù)轉(zhuǎn)換的方法計(jì)算得到[20]。最大無效水平(The maximal no-effect level,NOEL)根據(jù)公式(1)得到,在此基礎(chǔ)上根據(jù)公式(2)得到允許每日暴露量(The permitted dailyexposure,PDE)[21-22]。

    (1)

    (2)

    式中,BW表示成年人的體重,F(xiàn)1~F5均為不確定因子,在本研究中的取值依次為12、10、10、10、1。由表3可知,體重為60 kg的成年人的PDE范圍為19.30~25.65 μg/d,而TEA在紅棗中的最高含量高達(dá)1 070.300 mg/kg,雖然目前尚無中國人的飲食數(shù)據(jù),但果品中鏈格孢菌毒素尤其是檢測含量最高的TEA確實(shí)存在健康隱患。同時,相對于TEA,雖然AOH和AME的含量較低,但AOH和AME具有遺傳毒性,其潛在危害亦不可忽視。

    表3 4種鏈格孢菌毒素的毒理學(xué)評估Table 3 Toxicological assessment of four alternaria mycotoxins

    3 結(jié) 論

    本文利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法并結(jié)合簡化的QuEChERS技術(shù),建立了快速檢測紅棗中TEA、AOH、TEN和AME 4種鏈格孢菌毒素的方法。該方法樣品前處理簡單,回收率均大于90%,基質(zhì)效應(yīng)小,具有操作簡便、快速、靈敏度高、檢出限低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),能滿足紅棗中鏈格孢菌毒素的檢測要求。同時運(yùn)用毒理學(xué)軟件對4種鏈格孢菌毒素進(jìn)行毒理學(xué)評估,發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌毒素對于人體具有潛在危害,值得關(guān)注。未來可擴(kuò)大范圍測定其他果蔬中鏈格孢菌毒素含量,并結(jié)合中國人飲食數(shù)據(jù),從而更加準(zhǔn)確評估中國人鏈格孢菌毒素的日暴露量。

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