高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃瓜與土壤中烯酰嗎啉和氰霜唑及其代謝物的殘留量

趙民娟，郭虹娜，邵 華*，金 芬，金茂俊，佘永新，王珊珊，鄭鷺飛，王 靜

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心，北京 100081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院 ，江蘇 南京 210095)

烯酰嗎啉(Dimethomorph)，化學(xué)名稱(chēng)為(E,Z)-4-[3-(4-氯苯基)3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰]嗎啉，有E體和Z體兩種異構(gòu)體，屬于羧酸酰胺類(lèi)真菌殺菌劑，對(duì)卵菌綱真菌具有專(zhuān)一性。該化合物通過(guò)破壞靶目標(biāo)生物細(xì)胞壁膜的形成，引起孢子囊壁分解，進(jìn)而導(dǎo)致病菌死亡。目前已登記在菠菜、觀賞牡丹、花椰菜、黃瓜等13個(gè)作物上，主要用于防治晚疫病、疫病、霜霉病、黑脛病、早疫病等[1-5]。氰霜唑(Cyazofamid)，化學(xué)名稱(chēng)為4-氯-2-氰基-5-對(duì)甲基苯基-咪唑-1-N，N-二甲基磺酰胺，是日本石原株式會(huì)社研制，與BASF公司共同開(kāi)發(fā)的一種磺胺咪唑類(lèi)殺菌劑，為超級(jí)保護(hù)性殺菌劑，可通過(guò)作用于線粒體電子傳遞絡(luò)合物ⅢQi部位來(lái)抑制線粒體呼吸作用，同時(shí)能阻礙孢子萌發(fā)至孢囊形成的各個(gè)階段，從而達(dá)到抑制病菌生長(zhǎng)的目的。氰霜唑已登記在番茄、觀賞菊花、黃瓜、荔枝樹(shù)、馬鈴薯、葡萄、西瓜7個(gè)作物上，主要用于防治霜疫霉病、疫病、晚疫病、霜霉病等[6-12]。氰霜唑在使用后會(huì)迅速分解，4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)是氰霜唑在植物體內(nèi)的主要降解產(chǎn)物，比氰霜唑的毒性高，兩者在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留可能會(huì)給人類(lèi)健康帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。因此，我國(guó)規(guī)定黃瓜中烯酰嗎啉的最大殘留限量(MRL)值為5 mg/kg，黃瓜中氰霜唑和代謝物CCIM之和的MRL值為0.5 mg/kg[15]；日本肯定列表規(guī)定黃瓜中烯酰嗎啉和氰霜唑的MRL值均為0.7 mg/kg[16-17]；歐盟規(guī)定黃瓜中烯酰嗎啉的MRL值為0.5 mg/kg[18]，氰霜唑的MRL值為0.2 mg/kg[19]，且烯酰嗎啉的殘留定義為“同分異構(gòu)體之和”，氰霜唑的殘留定義為“氰霜唑及其代謝物CCIM之和”。

目前，烯酰嗎啉的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[20]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21]、液相色譜法[22]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[23]等，其中氣相色譜法多采用氮吹以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等方式，耗時(shí)較長(zhǎng)，靈敏度相對(duì)較低。王曉環(huán)等[24]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定煙草和土壤中烯酰嗎啉殘留量的方法。而氰霜唑的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[25-26]和液相色譜-質(zhì)譜法[27]等。氰霜唑及其代謝產(chǎn)物CCIM的檢測(cè)方法主要為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[28]，張翠芳等[29]建立了氰霜唑及其代謝物CCIM在黃瓜和土壤中的殘留檢測(cè)方法。雖然目前烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM均有較多的檢測(cè)方法，但在我國(guó)，復(fù)配農(nóng)藥因其獨(dú)特的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物生長(zhǎng)中，所以單一農(nóng)藥檢測(cè)方法已不能滿足要求，建立高效的多種農(nóng)藥同時(shí)檢測(cè)的方法顯得尤為重要。雖然王艷敏[30]報(bào)道了烯酰嗎啉和氰霜唑復(fù)配藥物的高效液相色譜測(cè)定方法，但其未對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)。目前未見(jiàn)關(guān)于烯酰嗎啉、氰霜唑及其代謝物CCIM同時(shí)檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。

本文以黃瓜和土壤為研究對(duì)象，采用QuEChERS/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了黃瓜和土壤中烯酰嗎啉、氰霜唑及其代謝物CCIM的同步檢測(cè)方法；通過(guò)兩年三地田間殘留試驗(yàn)，研究35%氰霜唑·烯酰嗎啉懸浮劑在黃瓜和土壤中的殘留動(dòng)態(tài)及最終殘留量，以期確定烯酰嗎啉和氰霜唑在黃瓜上的安全間隔期，并為其在農(nóng)產(chǎn)品中的安全使用和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品、氰霜唑標(biāo)準(zhǔn)品、CCIM標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%，德國(guó)Dr.E公司)；35%氰霜唑·烯酰嗎啉懸浮劑(江西禾益化工股份有限公司)；乙腈、甲酸(色譜純，F(xiàn)isher公司)；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉(分析純，北京化工廠)；乙二胺-N-丙基硅烷鍵合相(PSA)、十八烷基硅烷鍵合相(C18)(天津博納艾杰爾科技有限公司)；Milli-Q超純水(法國(guó)Millipore公司)。

Agilent 1200液相色譜儀、API2000串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；渦旋混合器(北京昊諾斯科技有限公司)；電子天平(北京賽多利斯公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 樣品前處理

黃瓜：準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎后的黃瓜樣品10 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋2 min，再加入4 g無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋2 min后，以8 000 r/min離心5 min，上清液為提取液，待凈化。取1.0 mL上清液于裝有50 mg PSA凈化劑的10 mL離心管中，渦旋2 min，以5 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

土壤：準(zhǔn)確稱(chēng)取土壤樣品10 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，凈化時(shí)加入50 mg PSA和50 mg C18凈化劑，其余步驟同上。

1.3 儀器條件

色譜條件：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；等度洗脫，流動(dòng)相為0.5%甲酸水-甲醇(25∶75，體積比)，流速：0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；正離子模式；噴霧電壓(IS+)：5 500 V；離子源溫度(TEM)：450 ℃；碰撞室入口電壓(EP)：10 V；碰撞室出口電壓(CXP)：4 V；霧化氣(GS1)：34.5×103Pa；輔助氣(GS2)：82.7×103Pa；氣簾氣(CUR)：89.6×103Pa。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM的質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion pair

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱(chēng)取烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM的標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g(精確至0.000 1 g)，用乙腈溶解并定容至100 mL，制得100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存。分別吸取3種標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，用乙腈定容至10 mL容量瓶中，配成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃下避光儲(chǔ)存。根據(jù)需要，用乙腈稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，即用即配。

烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈、空白黃瓜和土壤提取液稀釋?zhuān)涞?.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下測(cè)定，重復(fù)3次，選擇不同的離子對(duì)，分別以3種農(nóng)藥的進(jìn)樣質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在黃瓜、土壤空白樣品中添加0.05、0.1、0.5 mg/kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置20 min，提取和凈化操作同“1.2”。每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)5次，以上述實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱及流動(dòng)相的選擇考察了不同色譜柱和流動(dòng)相體系的色譜分離效果。分別以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相對(duì)X Bridge C18色譜柱和Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱進(jìn)行比較;X Bridge C18色譜柱對(duì)目標(biāo)物的保留能力弱，在2 min之內(nèi)出峰，且在3種流動(dòng)相下的峰形均不理想、分離效果較差;Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱對(duì)目標(biāo)物保留能力較好，以甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)的峰形和分離效果較好，這是由于在流動(dòng)相中加少量甲酸可以提高離子化效率，優(yōu)化峰形，通過(guò)優(yōu)化甲酸水的含量以及與甲醇的體積比，最終選擇Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，甲醇-0.5%甲酸水(75∶25)為流動(dòng)相。在該條件下烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM均可獲得較好的分離效果和色譜峰形，三者的提取離子流圖見(jiàn)圖1。

2.1.2凈化劑的選擇黃瓜等植物源性農(nóng)產(chǎn)品的提取液中含有的糖類(lèi)、色素、脂肪酸和甾醇等雜質(zhì)會(huì)對(duì)回收結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，需除去這些雜質(zhì)。比較了50 mg PSA+50 mg C18、50 mg PSA以及不加凈化劑對(duì)樣品中目標(biāo)物凈化回收效果的影響。結(jié)果表明，黃瓜樣品提取液中加入50 mg PSA+50 mg C18時(shí)，回收率偏高(116%～128%)。加入50 mg PSA時(shí)回收率符合要求(79.6%～94.4%)，不加凈化劑時(shí)因受基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，回收率不符合要求(60.8%～66.6%)。土壤樣品提取液選用50 mg PSA+50 mg C18凈化時(shí)，回收率符合檢測(cè)要求(86.5%～103%)，而單獨(dú)使用PSA和不使用凈化劑時(shí)，回收率(47.8%～76.8%)均較低。最終確定50 mg PSA為黃瓜樣品提取液的凈化劑，50 mg PSA+50 mg C18為土壤樣品提取液的凈化劑。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系及定量下限

在HPLC-MS/MS分析中，電噴霧離子源易受樣品基質(zhì)影響，表現(xiàn)出離子抑制或離子增強(qiáng)效應(yīng)，從而影響儀器的靈敏度和重復(fù)性[31]。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，本研究選用空白樣品提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，以使標(biāo)樣和樣品溶液具有相同的離子化條件，并考察了烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM在乙腈、黃瓜和土壤基質(zhì)中的線性范圍、線性方程以及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明：在0.01～0.5 mg/L范圍內(nèi)，烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM在上述基質(zhì)中的響應(yīng)值與其濃度之間線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.994 6～0.999 8。以方法的最低添加水平為定量下限(LOQ)[32]，得黃瓜和土壤中3種化合物的LOQs均為0.05 mg/kg，低于國(guó)內(nèi)外殘留限量[15-19]，該方法的靈敏度可滿足國(guó)內(nèi)和國(guó)際殘留限量的測(cè)定要求。

2.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度

按“1.5”進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在0.05～0.5 mg/kg加標(biāo)范圍內(nèi)，黃瓜和土壤樣品中烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM的平均回收率為78%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)為1.3%～14.8%(表2)。表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度、重復(fù)性及精密度，滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。典型加標(biāo)樣品的色譜圖見(jiàn)圖2，其中烯酰嗎啉為順?lè)串悩?gòu)體[33]，故出現(xiàn)兩個(gè)峰，本研究中烯酰嗎啉的檢測(cè)量為兩種異構(gòu)體之和。

表2 黃瓜和土壤中烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Average recoveries and RSDs for dimethomorph，cyazofamid and CCIM in cucumber and soil samples(n=5)

2.4 消解動(dòng)態(tài)與最終殘留分析

為驗(yàn)證該方法的可靠性和實(shí)用性，采用本方法對(duì)北京市通州區(qū)、濟(jì)南市歷城區(qū)和哈爾濱市三地2015～2016年兩年的黃瓜和土壤田間實(shí)際樣品(21 d最終殘留和黃瓜中殘留量)進(jìn)行測(cè)定，供試藥劑為35%氰霜唑·烯酰嗎啉懸浮劑，消解動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)中黃瓜施藥劑量(393.75 g a.i/ha)，土壤施藥劑量(1 000 g a.i/ha)，施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采樣。最終殘留試驗(yàn)按照低劑量(262.5 g a.i/ha)、高劑量(393.75 g a.i/ha)各施藥2次、3次(施藥間隔7 d)，收獲期采一次(采樣距末次施藥間隔期1、2、3、5 d)。結(jié)果表明：在黃瓜和土壤消解動(dòng)態(tài)樣品中烯酰嗎啉殘留量分別為ND～7.21、ND～5.20 mg/kg，氰霜唑及其代謝物CCIM之和的殘留量分別為ND～4.32、ND～2.21 mg/kg，在施藥7、14 d后，烯酰嗎啉和氰霜唑殘留量均小于最低檢測(cè)濃度，表明黃瓜和土壤樣品中烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM的最終殘留量隨采收時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì)(其中ND表示農(nóng)藥殘留量低于LOQs)，烯酰嗎啉在黃瓜和土壤中的半衰期為1.2～2.1、3.0～9.6 d；氰霜唑與CCIM之和在黃瓜和土壤中的半衰期為0.9～2.3 d、1.8～6.2 d，氰霜唑與CCIM之和比烯酰嗎啉的降解速率快，另外不同地區(qū)的降解速率也不同，可能是受天氣、作物生長(zhǎng)狀況差異以及土壤類(lèi)型等因素的影響。在合理的使用情況下，35%氰霜唑·烯酰嗎啉懸浮劑不會(huì)造成黃瓜和土壤中烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM殘留污染。在黃瓜和土壤樣品中，烯酰嗎啉的最終殘留量分別為ND～7.60、ND～2.22 mg/kg，氰霜唑及其代謝物CCIM之和的最終殘留量分別為ND～3.58、ND～0.31 mg/kg，距采收間隔期3 d的黃瓜中烯酰嗎啉最高殘留量為4.26 mg/kg，氰霜唑及CCIM之和的最高殘留量為0.17 mg/kg，均低于我國(guó)規(guī)定的黃瓜中烯酰嗎啉的MRL值(5 mg/kg)和氰霜唑及其代謝物之和的MRL值(0.5 mg/kg)，故建議其采收安全間隔期為3 d。

圖2 空白樣品及加標(biāo)樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank and spiked samplesA:blank cucumber;B:cucumber spiked with 0.5 mg/kg dimethomorph;C:cucumber spiked with 0.5 mg/kg cyazofamid;D:cucumber spiked with 0.5 mg/kg CCIM

3 結(jié) 論

本研究基于QuEChERS前處理技術(shù)，建立了一種同步檢測(cè)分析黃瓜和土壤中烯酰嗎啉、氰霜唑及其代謝物CCIM的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度及準(zhǔn)確度高，能夠滿足同時(shí)快速檢測(cè)和確證黃瓜和土壤中烯酰嗎啉、氰霜唑及其代謝物的要求，可應(yīng)用于農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)樣品中的農(nóng)藥殘留分析。另外，對(duì)黃瓜和土壤實(shí)際樣品的測(cè)定，以及對(duì)35%氰霜唑·烯酰嗎啉懸浮劑在黃瓜和土壤中的殘留動(dòng)態(tài)及最終殘留量的分析，可為烯酰嗎啉和氰霜唑的科學(xué)使用、在黃瓜上的安全間隔期，以及黃瓜中烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM的殘留分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供重要的數(shù)據(jù)支撐。